专利名称：人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其应用于人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程。
背景技术：
长期以来中枢神经系统(central nervous system, CNS)的损伤与再生一直是困扰人类健康的难题，也是科学家们致力于研究的焦点。源于胚胎组织的神经干细胞(neural stern cells，NSC污)曾被认为是治疗中枢神经系统疾病的希望，但它的利用因来源的缺乏和伦理道德的约束而受到明显的限制。近年来通过对骨髓基质干细胞能产生骨骼肌、 心肌、肝细胞和神经胶质细胞及神经元样细胞的研究，已说明这种横向分化具有相当的普遍性，也就是说，“横向分化”可以利用患者自身的健康组织干细胞，诱导分化为病损组织的功能细胞，从而达到治疗各种组织坏损性疾病的目的。人脐血(human umbilieal cord blood, HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞，其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其中间充质干细胞与骨髓的间质干细胞相似，具有较强的可塑性，能发育成多种不同的细胞。将脐血细胞通过鼠尾静脉注射入脑损伤模型的大鼠体内，于脑组织损伤部位可检测到有脐血源性神经元和胶质细胞抗原的表达，且在功能上有明显的恢复。
发明内容
本发明的方法拟通过体外条件下获取脐血MSCs，探讨其在体外培养、纯化和扩增的最佳条件，并应用二甲基亚矾诱导向神经元样细胞定向分化，论证其可塑性，为中枢神经系统的损伤修复提供一种新的细胞来源。具体的，为达到本发明的目的，本发明提出一种人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其应用于人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程，所述的诱导过程包括如下步骤Si.脐血的收集和单个核细胞的分离无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的脐带血40-60ml，肝素抗凝，浓度为20U/ml，所有样本均于采集后12h内分离。用Hank’ S平衡盐溶液1 1稀释、混勻，叠加于Fieoll-Hypaque上面，相对密度为1.0779/L，稀释血与 Fieoll-Hypaque液的柱高比为2 1，以2000r/min离心20min，取界面层的单个核细胞，加 Hank’ S平衡盐溶液离心、洗涤两次，加入培养基中，调整细胞浓度为IxlOfVml左右。S2.细胞的培养、纯化及扩增培养基采用Mesencult 培养液，并调整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，将细胞分装于25T培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5 %的培养箱中培养48-7 后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-5d半量换液一次。待细胞达到80%-90%融合时，用1 1的2.5g/L胰蛋白酶和 0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3d半量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为几代，其余类推。S3.定向诱导MSCs 向神经元样细胞分化取传至第3代的MSCS按虹105/1密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，用含有lmmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)预诱导Mh，PBS洗涤3遍后，换成含10g/L的二甲基亚矾(DMSO)和 lOOmmol/L的丁化轻基苯甲醚(BHA)的无血清DMEM进行诱导，每隔30min在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。S4.免疫组织化学鉴定诱导后的细胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3 遍，加入过氧化物酶阻断液以消除内源性过氧化物酶，山羊血清工作液室温下封闭20min， 去除血清后分别加入小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)单抗工作液，置于湿盒中4°C下过夜，PBS洗涤3遍，分别滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育》i，PBS漂洗3遍，置于荧光显微镜下观察。镜下随机取10个非重叠视野 (X100)，计算NSE和NF-M阳性细胞占总细胞的比例。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程的步骤流程图。
具体实施例方式如图1所示的本发明的人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程的步骤流程图，所述实施例的方法具体步骤如下Si.脐血的收集和单个核细胞的分离无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的脐带血40-60ml，肝素抗凝，浓度为20U/ml，所有样本均于采集后12h内分离。用Hank’ S平衡盐溶液1 1稀释、混勻，叠加于Fieoll-Hypaque上面，相对密度为1.0779/L，稀释血与 Fieoll-Hypaque液的柱高比为2 1，以2000r/min离心20min，取界面层的单个核细胞，加 Hank’ S平衡盐溶液离心、洗涤两次，加入培养基中，调整细胞浓度为IxlOfVml左右。S2.细胞的培养、纯化及扩增培养基采用Mesencult 培养液，并调整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，将细胞分装于25T培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5 %的培养箱中培养48-7 后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-5d半量换液一次。待细胞达到80% -90%融合时，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和 0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3d半量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为几代，其余类推。S3.定向诱导MSCs 向神经元样细胞分化取传至第3代的MSCS按虹105/1密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，用含有lmmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)预诱导Mh，PBS洗涤3遍后，换成含10g/L的二甲基亚矾(DMSO)和 lOOmmol/L的丁化轻基苯甲醚(BHA)的无血清DMEM进行诱导，每隔30min在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。
S4.免疫组织化学鉴定诱导后的细胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3 遍，加入过氧化物酶阻断液以消除内源性过氧化物酶，山羊血清工作液室温下封闭20min， 去除血清后分别加入小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)单抗工作液，置于湿盒中4°C下过夜，PBS洗涤3遍，分别滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育》i，PBS漂洗3遍，置于荧光显微镜下观察。镜下随机取10个非重叠视野 (X100)，计算NSE和NF-M阳性细胞占总细胞的比例。实验结果及分析1.脐血MSCs的纯化、扩增从脐血中分离出的单个核细胞接种于培养基 (MeseneultTM)中48_7池后开始有细胞贴壁，逐渐伸出突起，4_7d出现大量的贴壁细胞，很少有集落形成，以间充质样细胞为主，同时有大量的破骨样细胞混杂。破骨样细胞胞体较大，多个核，圆形，MSCs为成纤维样的长梭形细胞，单个核，有较长的突起，折光性强。随着在条件培养基的环境下培养，1-2周后细胞生长达80% -90%融合。传代后，细胞扩增明显减慢，传至P3代后，大部分细胞(包括破骨样细胞)逐渐被去除，剩下形态为成纤维样细胞和略宽大的扁平形细胞，即为脐血源性的MSCs，形态上类似于骨髓MSCs，将这些细胞再次传代培养，1-2周左右可达到融合，并表现出较强的传代扩增能力。2. MSCs诱导为神经元样细胞的形态学观察脐血源性MSCs在含件琉基乙醇的 DMEM (20% FCS)预诱导24h后，换成DMSO和BHA的无血清DMEM进行诱导24h后细胞形态发生变化，胞质逐渐回缩，呈典型的核周形态，有突起伸出，7-8h后，大多数细胞均转变为类似神经元样的形态，伸出较长的突起，并可见一级和二级分支，类似树突样。3.免疫组化鉴定采用神经元标志物NSE和NF进一步鉴定MSCs经DMSO和BllA 诱导他后，大多数细胞表现为NSE和NF荧光染色阳性，NSE用FITC标记，NF用TRITC标记。从双极到多极细胞均有出现，对照组则无阳性标记细胞出现。随机计数10个视野，计算结果显示诱导后大多数细胞均转变为神经元样细胞，NSE阳性细胞占67. 4%士 2. 6%,NF 阳性细胞为65. 8%土 2.3%。本发明的方法应用含10g/L的二甲基亚矾和lOOmmol/L的丁化轻基苯甲醚的无血清DMEM诱导来源于人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化成神经元细胞。无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencul 作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的应用二甲基亚矾诱导MSCs向神经元细胞诱导分化，免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。人脐血MSCs在体外可以培养、扩增，应用二甲基亚矾诱导能向神经元样细胞分化，为中枢神经系统的损伤修复提供一种新的细胞来源。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其应用于人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程，所述诱导过程包括步骤脐血的收集和单个核细胞的分离、细胞的培养、纯化及扩增、定向诱导MSCs以及免疫组织化学鉴定；其中所述脐血的收集和单个核细胞的分离方法包括无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的脐带血40-60ml，肝素抗凝，浓度为20U/ml，所有样本均于采集后12h内分离；用Hank’ S平衡盐溶液1 1稀释、混勻，叠加于Fieoll-Hypaque上面，相对密度为 1. 0779/L，稀释血与Fieoll-Hypaque液的柱高比为2 1，以2000r/min离心20min，取界面层的单个核细胞；以及加Hank’S平衡盐溶液离心、洗涤两次，加入培养基中，调整细胞浓度为lxl06/ml左右。
2.如权利要求1所述的人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其中所述细胞的培养、纯化及扩增方法包括培养基采用Mesencult 培养液，并调整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印， 将细胞分装于25T培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的培养箱中培养48-7 后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-5d半量换液一次；待细胞达到80% -90%融合时，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和0. 2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例进行传代接种培养，并记为P1R;传代培养过程中每3d半量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作， 传代培养记为几代，其余类推。
全文摘要
本发明提出一种人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其应用于人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程，所述诱导过程应用含二甲基亚矾和丁化轻基苯甲醚的无血清DMEM诱导来源于人脐血间充质干细胞分化成神经元细胞。在无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的应用二甲基亚矾诱导MSCs向神经元细胞诱导分化，免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。人脐血MSCs在体外可以培养、扩增，应用二甲基亚矾诱导能向神经元样细胞分化，为中枢神经系统的损伤修复提供一种新的细胞来源。
文档编号C12N5/0789GK102533645SQ201110448030
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者陆华 申请人:陆华