Omega-7脂肪酸在植物种子中的积累的制作方法
【专利摘要】组合物和方法包括在植物细胞中遗传编码和表达新颖的Δ9-18:0-ACP去饱和酶。在一些实施方案中，核酸分子编码新颖的Δ9-18:0-ACP去饱和酶。在其它实施方案中，氨基酸序列具有Δ9-18:0-ACP去饱和酶活性。为了增加全植物、植物种子、和植物材料，例如，种子中不常见脂肪酸的量，所述方法可以牵涉在植物细胞、植物材料和全植物中表达Δ9-18:0-ACP去饱和酶。
【专利说明】OMEGA-7脂肪酸在植物种子中的积累
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求2010年6月24日提交的美国临时专利申请流水号61/358，318关于“ACCUMULATION OF N-7FATTY ACIDS IN PLANT SEEDS” 的提交日权益。
【技术领域】
[0003]在特定的实施方案中，本发明涉及一种发挥A9-16 = O-ACP去饱和酶功能的新型突变体蓖麻属(Ricinus) A9-18:0-ACP去饱和酶，称作Com25。另一个实施方案涉及操作植物中的代谢分支点，例如以使碳改方向到脂肪酸中的代谢工程化方法。在某些实施方案中，本发明涉及用于表达Com25作为代谢工程化策略的一部分，使得碳改方向到植物种子中的《_7脂肪酸中的方法。
[0004]发明背景
[0005]据估计在自然界中可能存在着超过1，000种脂肪酸结构。Millar等，(2000)Trends Plant Sci 5 (3): 95-101。许多这些脂肪酸通过一批原型去饱和酶变体使脂肪酸衍生化来合成。要分离的这些变体去饱和酶的第一种是来自蓖麻胚乳的蓖麻(Ricinus)油酸轻化酶，即负责蓖麻油酸合成的酶。Van de Loo等，(1995) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92 (15):6743-6747o这继之以编码斑鸠菊(Vernonia)亚油酸环氧酶和还阳参(Crepis)油酸乙块酶(actylenase)的基因。Lee 等，(1998) Science 280 (5365):915-18。这些基因的分离导致如下的想法，即其在油料作物植物中的异源表达可以促进相应的不常见脂肪酸的积累。Broun等，(1997)Plant Journal 13:201-10。然而,所得的不常见脂肪酸积累总是低于存在于分离基因的天然来源植物中的积累。Napier, J.A.(2007) Annu.Rev.PlantBiol.58:295-319。
[0006]已经自积累不 常见脂肪酸的组织分离的酶变体去饱和酶的比活谱与生成相应的不常见脂肪酸的作用一致。然而，它们与至今报告的所有硬脂酰-ACP去饱和酶相比展现出非常差的比活，而且已经证明了在异源表达时在生成改变的脂肪酸表型方面是无效的。Cahoon 等，(1994)Prog.Lipid Res.33:155-63。例如，在模式植物拟南芥(Arabidopsis)中在种子特异性强启动子的控制下蓖麻羟化酶的种子特异性表达导致仅约17%蓖麻油酸的积累，远少于存在于蓖麻种子中的约90% o Broun和Somerville (1997) PlantPhysiol.113:933-42。已经对环氧和炔属脂肪酸报告了类似令人失望的结果，已经报告了在拟南芥中异源表达环加氧酶(epoxygenase)和乙炔酶后，它们分别积累15和25%。Lee等，(1998)Science 280 (5365): 915-18。在显示较差的活性外，变体去饱和酶在纯化时趋于形成不溶性聚集体。较低的稳定性和较差的催化速率是作为基因重复事件出现的许多新进化的酶共享的特性，在所述基因重复事件中，释放稳定性和/或周转选择，期间积累突变，这最终导致功能改变。Govindarajan 和 Goldstein(1998)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:5545-49;Goldstein(2001)in Protein Folding, Evolution and Design (Broglia, R.A., Shakhnovich, E.1.和 Ti ana, G.编)CXLIV 卷，1.0.S.Press, Amsterdam。
[0007]已经推进了低水平靶标脂肪酸积累的许多潜在解释。Napier，J.A.(2007)Annu.Rev.Plant Biol.58:295-319。证明提示了专门的酶可以在将不常见脂肪酸掺入三酰甘油中发挥关键作用。例如，月桂酸酯在转基因油菜(Brassicanapus)种子中的积累在共表达椰子溶血磷脂酸酰基转移酶以及加利福尼亚月桂树(California bay)中链硫酯酶后从50% 增加至 60%o Knutzon 等，(1999) PlantPhysiol.120(3): 739-46。最近，蓖麻 2 型酰基辅酶A: 二酰基甘油酰基转移酶(RcDGAT2)以及蓖麻羟化酶的共表达将蓖麻油酸的积累从约 17% 至约 30%o Burgal 等，(2008) Plant Biotechnol.J.6 (8): 819-31。
[0008]仍必须报告在转基因植物中积累与存在于天然存在的物种中的水平等同的高水平不常见(unusual)脂肪酸。因为不常见脂肪酸在许多工业和应用中是高度期望的，所以需要在为其生产而设计的转基因植物中更好地表达不常见脂肪酸。
[0009]发明概况
[0010]本文中公开了编码称作Com25的新颖的变体去饱和酶的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0011]还公开了在植物细胞中表达Com25的方法，以利用Com25酶相对于WT蓖麻A9-1SiO去饱和酶增强的去饱和酶活性，使得在植物种子中的不常见脂肪酸的百分比组成增加。在一些实施方案中，所述方法包括在拟南芥中表达Com25。在某些实施方案中，植物种子中增加的不常见脂肪酸是《_7脂肪酸。在这些实施方案中，《_7脂肪酸可以是16:1 A19-和 / 或 18:1 A110
[0012]还提供了在植物细胞中表达Com25的方法，其中植物细胞在质体和质体外脂肪酸延长方面是受损的，使得植物种子中不常见脂肪酸的百分比组成增加。在一些实施方案中，所述方法包括在拟南芥中表达Com25。在某些实施方案中，植物种子中增加的不常见脂肪酸是脂肪酸。在这些实施方案中，《-7脂肪酸可以是16:1A19-和/或18:1A11。
[0013]提供了在植物细胞中表达Com25的其它方法，其中KASII在植物细胞中受到抑制，使得植物种子中不常见脂肪酸的百`分比组成增加。在一些实施方案中，所述方法包括在拟南芥中表达Com25。在某些实施方案中，植物种子中增加的不常见脂肪酸是《_7脂肪酸。在这些实施方案中，《 -7脂肪酸可以是16:1 A 19-和/或18:1 A 11。
[0014]还提供了在植物细胞中表达Com25的其它方法，其中KASII及质体和质体外脂肪酸延长在植物细胞中受到抑制，使得植物种子中不常见脂肪酸的百分比组成增加。在一些实施方案中，所述方法包括在拟南芥中表达Com25。在某些实施方案中，植物种子中增加的不常见脂肪酸是《_7脂肪酸。在这些实施方案中，《_7脂肪酸可以是16:1A19-和/或18:1 A110
[0015]前述和其它特征通过几个实施方案的以下详细描述及参考的附图会变得更加显而易见。
[0016]附图简述
[0017]图1描绘了拟南芥质体和内质网中脂肪酸合成和修饰的示意图。由16:0去饱和酶介导的反应标示为1: A9-16:0-ACP去饱和酶；2:质体外A 9-16:0-ACP去饱和酶。框示o-7FA，即 16:1 A9 和 18:1 A n。
[0018]图2展示了在拟南芥的多种背景中表达Com25后FAME的代表性气相层析分离。小图A和B，WT ；C和D, fabl ；E和F，fabl/fael。小图A、C和E,未转化；B, D和F，用 Phas:Com25 转化。标示 FAME 峰:16:0 (I)，16:1 A9(2)，16:2(3)，18:0(4)，18:1 A 9(5)，18:1 A 11 (6)，18: 2 (7)，20:0 (8)，20:1 A 11 (6)，18:2 (7)，20:0 (8)，20:1 A 11 (9)，18: 3+20:1A13(IO)和 22:1(11)。
[0019]图3显示了宿主种子中16:0对《-7积累(以mol百分比计)之间的关系?
[0020]图4展示了在拟南芥的多种背景中表达Com25后FAME的代表性气相层析分离。小图 A:最好的 fabl/fael, Phas:Com25, Fabl-HPAS, An A 9DS, Ln A 9DS 转化体系;小图 B:猫爪花(Doxantha)种子。峰名称如图2中中描述的。
[0021]图5是DNA元件在本发明的具体构建体实施方案中的示意性排列。
[0022]发明详述
[0023]1.几个实施方案的概述
[0024]本文中公开了编码酶A9去饱和酶的核苷酸分子，其包含与SEQ ID N0:1至少60%相同的核苷酸序列。核酸分子可以进一步包含基因调节元件。在一些实施方案中，基因调节元件可以是菜豆蛋白启动子。
[0025]还公开了酶A9去饱和酶，其包含与SEQ ID NO: 2至少80%相同的氨基酸序列。其中的氨基酸序列与SEQ ID N0:2至少80%相同的本发明的酶A9去饱和酶可以进一步包含与SEQ ID NO: 2的第114位类似的位置处的丝氨酸；SEQID NO: 2中第117位类似的位置处的精氨酸；SEQ ID NO:2中第118位类似的位置处的半胱氨酸，SEQ ID NO:2中第179位类似的位置处的亮氨酸；和/或SEQID NO:2中第188位类似的位置处的苏氨酸。
[0026]可以在植物材料、细胞、组织、或全植物中表达本发明的核酸分子和酶A9去饱和酶，以相对于同一物种的野生型植物中观察到的量，增加所述植物材料、细胞、组织、或全植物中不常见脂肪酸的量。本发明的备选实施方案包括用于增加植物材料、细胞、组织、或全植物中不常见脂肪酸的量的方法，包括用SEQ ID NO:1的核酸分子转化植物材料、细胞、组织、或全植物，使得所 述植物材料、细胞、组织、或全植物中的不常见脂肪酸的量得到增加。
[0027]在优选的实施方案中，通过公开的方法转化的植物材料、细胞、组织、或全植物进一步包含用于提高植物材料、细胞、组织、或全植物中16:0-ACP水平的一种或多种手段(means)。在某些实施方案中，用于提高植物材料、细胞、组织、或全植物中16:0_ACP水平的手段可以是:表达质体外去饱和酶；抑制KASII，例如通过在fabl基因中引入突变实现；和/或降低16:0脂肪酸的延长，例如通过在fael基因中引入突变实现。
[0028]可以例如对拟南芥属的植物、或自植物衍生的植物材料实施本文中公开的方法。一个具体的实施方案涉及用于创建或再生与同一物种的野生型植物相比在植物中包含增加量的不常见脂肪酸的遗传工程化植物的方法，包括用SEQ ID NO:1的核酸分子转化植物材料；并培养经转化的植物材料以获得植物。还公开了通过前述方法获得的植物、植物材料、植物细胞、和种子。
[0029]I1.缩写
[0030]x:yAz含有X个碳和从羧基端开始数起第z位的y个双键的脂肪酸
[0031]ACP 酰基载体蛋白
[0032]COA 辅酶 A
[0033]KASII ￠-酮脂酰-ACP 合酶 11
[0034]FA 脂肪酸
[0035]FAS 脂肪酸合成[0036]FAME 脂肪酸甲酯
[0037]WT野生型
[0038]II1.术语
[0039]脂肪酸:如本文中使用的，术语“脂肪酸”指从约C12至C22的不同链长的长链脂肪族酸(链烷酸)，尽管更长和更短链长的酸两者是已知的。脂肪酸的结构以符号x:yAz表示，其中“x”是特定脂肪酸中碳(C)原子的总数，且“y”是碳链中如从该酸的羧基端开始数起的第“z”位中的双键数目。
[0040]不常见脂肪酸:出于本发明的目的，不常见脂肪酸是其在天然系统中的合成通过酶变体去饱和酶修饰FAS中间体启动的那些脂肪酸。
[0041 ] 代谢途径:术语“代谢途径”指细胞内存在的、由酶催化以实现代谢产物转化或另一代谢途径启 动的一系列化学反应。代谢途径可以牵涉几个或许多步骤，并且可以与不同代谢途径竞争特定反应底物。类似地，一种代谢途径的产物可以是又一代谢途径的底物。
[0042]代谢工程:出于本发明的目的，“代谢工程”指改变细胞中的一种或多种代谢途径，使得在细胞中运行的总代谢途径的总体方案内实现将初始底物逐步修饰为具有期望的精确化学结构的产物的理性策略设计。
[0043]去饱和酶:如本文中使用的，术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即，引入双键)以生成脂肪酸或感兴趣的前体的多肽。植物可溶性脂肪酸去饱和酶酶将双键区域专一性引入饱和的酰基-ACP底物中。该反应牵涉通过由形成去饱和酶构造核心的四螺旋束配位的两电子还原性二铁中心活化分子氧。本文中特别感兴趣的是A9去饱和酶。
[0044]A9-1S = O1-ACP去饱和酶是所有植物维持膜流动性需要的。虽然此酶主要使硬脂酰-ACP去饱和，但是它在棕榈酰-ACP的情况中也在微小的程度上有活性。
[0045]变体去饱和酶:如本文中使用的，术语“变体去饱和酶”涵盖与在生成不常见的脂肪酸中的作用一致的比活谱的那些去饱和酶。变体去饱和酶可以自生物体分离，或者经由定向进化程序来工程化改造。
[0046]后代植物:出于本发明的目的，“后代植物”指可以通过植物育种方法获得的任何植物，或自其获得的植物材料。植物育种方法是本领域中公知的，并且包括天然育种、人工育种、牵涉DNA分子标志分析的选择育种、转基因学、和商业育种。
[0047]植物材料:如本文中使用的，术语“植物材料”指自植物获得的任何细胞或组织。
[0048]核酸分子:核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义和反义链两者、cDNA、基因组DNA、和上述物质的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、或任一类核苷酸的经修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸之任一或两者。
[0049]核酸分子可以经过化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域普通技术人员容易领会的。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、悬垂的模块(moiety)(例如，肽)、插入剂(例如，吖啶、补骨脂素，等等)、螯合剂、烧化剂(alkylator)、和经修饰的连接(例如,alpha异头核酸,等等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑学构象，包括单链、双链，部分双链体、三联体、发夹、圆形和挂锁构象。
[0050]可操作连接的:当第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。然而，核酸为了可操作连接不需要是连续的。
[0051]调节元件:如本文中使用的，术语“调节元件”指具有基因调节活性的核酸分子；即具有影响可操作连接的可转录核酸分子的转录或翻译的能力的核酸分子。调节元件诸如启动子、前导物、内含子和转录终止区是具有基因调节活性的非编码核酸分子，其在活细胞的总体基因表达中发挥一个组成部分。因此，在植物中发挥功能的分离的调节元件可用于经由分子工程化技术修饰植物表型。“调节元件”意指决定是否表达特定基因、何时表达特定基因、及以何种水平表达特定基因的一系列核苷酸。调节DNA序列与调节蛋白或其它蛋白质特异性相互作用。
[0052]如本文中使用的，术语“基因调节活性”指能够影响可操作连接的核酸分子的转录或翻译的核酸分子。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以提供可操作连接的核酸分子的时间或空间表达或调控表达水平和速率。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以包括启动子、内含子、前导物、或3’转录终止区。
[0053]启动子:如本文中使用的，术语“启动子”指牵涉RNA聚合酶II或其它蛋白质诸如转录因子(调节转录的反式作用蛋白因子)的识别和结合以启动可操作连接的基因转录的核酸分子。启动子可以自身含有影响可操作连接的基因转录的亚元件诸如顺式元件或者增强子域。“植物启动子”是在植物细胞中功能性的天然的或非天然的启动子。可以使用植物启动子作为5’调节元件以调控一种或多种可操作连接的基因表达。植物启动子可以以其时间、空间、或发育表达模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有启动子的核酸序列。
[0054]序列同一性:两种核酸序列间或两种氨基酸序列间的相似性按照序列间共享的序列同一性水平表示。序列同一性通 常按照百分比同一性表示；百分比越高，两种序列越相似。用于比对比较序列的方法在下文详细描述。
[0055]氨基酸序列中的类似位置:可以通过以下段落中描述的方法比对核酸和氨基酸序列。在比对时，若各序列在共有序列内是相同的，则一个序列中的位置与比对序列中的位置在“类似位置”中。
[0056]用于比对比较序列的方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于:Smith 和 Waterman, Adv.Appl.math.2: 482，1981; Needleman 和 Wunsch, J.Mol.Biol.48:443, 1970;Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444, 1988;Higgins和 Sharp, Gene 73:237-44，1988;Higgins 和 Sharp, CABIOS 5:151-3，1989;Corpet等，Nucleic Acids Research 16:10881-10890， 1988;Huang,等，Computer Applicationsin the Biosciences 8:155-65，1992;Pearson 等,Methods in Molecular Biology24:307-31, 1994;Tatiana 等，FEMS Microbiol.Lett., 174:247-50，1990。Altschul 等，J.Mol.Biol.215:403-10, 1990 (详细考虑序列比对方法和同源性计算)。
[0057]国家生物技术信息中心(NationalCenter for BiotechnologyInformation, NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)在因特网上可获得(于blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi),其与序列分析程序,例如blastp和blastn结合使用。关于如何使用此程序测定序列同一丨I"生的描述在因特网上经由NCBI于blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=ffeb&PAGE_TYPE=BlastDocs 可获得。
[0058]为了比较氨基酸序列，使用缺省参数采用BLAST程序的“Blast 2种序列(Blast2sequence) ”功能(bl2seq)。特定参数可以在本领域技术人员的判断内调节，以例如提供错配罚分或匹配奖励。
[0059]经转化的:如本文中使用的，术语“经转化的”指已经接受外来核酸分子，诸如构建体导入的细胞、组织、器官、或生物体。可以将导入的核酸分子整合入接受细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得导入的多核苷酸分子得到后续后代继承。“转基因”或“经转化”细胞或生物体还包括所述细胞或生物体的后代和自在例如杂交中采用此类转基因植物作为亲本的育种程序生成并展现出源自存在外来核酸分子的改变的表型的后代。
[0060]IV.在宿主细胞、组织、或生物体中积累不常见脂肪酸的系统性代谢工程化方法
[0061]A.概述
[0062]本发明的一个实施方案包括代谢工程化例如植物种子中《-7脂肪酸(FA)(其由棕榈油酸(16:1 A9)和异油酸(vaccenic acid) (18:1 A n)构成)积累的系统性方法。为了例示用于拦截质体中新合成的脂肪酸流的方法，在种子特异性菜豆蛋白启动子控制下表达Com25，即一种源自定向进化程序以增强蓖麻A9-18:0-去饱和酶的16:0-去饱和酶活性的16:0-ACP去饱和酶。可以在本文中公开的实施方案中使用任何种子特异性启动子。此方法将《_7FA的积累从野生型(WT)中的小于2%增加至Com25转化体中的约14%。
[0063]在其它例示性的方法中，在fabl/fael双重突变体(其分别在质体和质体外脂肪酸延长方面受损)中表达Com25导致增加至约50%的《_7FA积累。此外，在LTP170启动子控制下引入额外的Com25将《-7FA积累增加至约58%，提示了已经克服可能源自其低周转率的去饱和酶活性限制。在一系`列KASII缺陷型背景中表达菜豆蛋白:Com25构建体，并且观察到随着多至约30%的16:0含量按比例增加的《-7FA含量，其中总体《_7FA积累多至约55%。令人感兴趣地，积累56%?-7FA的转基因物仍含有约19%16: 0，大于两倍的WT植物的。调查了表达质体外16:0去饱和酶以拦截16:0至三酰甘油的在途流动。fabl/fael双重突变体背景中共表达质体和质体外去饱和酶以及抑制KASII导致co-7FA从WT中的约2%至最好的工程化系中的约71%的积累增加，等于存在于猫爪花种子中的。
[0064]选择《-7FA作为靶物，这因为与其它不常见FA的合成一样，其在天然系统中的合成通过酶变体去饱和酶修饰FAS中间体启动。Cahoon等，(1997) Plant Mol.Biol.33:1105-10 ;及 Cahoon 等，(1998) Plant Physiol.117 (2): 593-8。另夕卜，《_7FA 具有作为聚合物给料的潜在商业应用，同时具有与天然存在的不饱和脂肪酸相似的物理特性。
[0065]通过将先前未报告的A9-16:0-酰基载体蛋白(ACP)去饱和酶Com25引入模式植物拟南芥中在种子特异性启动子的控制下启动代谢工程化研究。探索了将碳流改向至?-7FA中的方法，其通过选择含有升高的16:0水平的突变体背景，并通过共表达设计为通过影响底物的竞争将碳流转向至靶标脂肪酸中的构建体进行。表达酶质体外去饱和酶以在自质体输出后使残留的16:0去饱和。
[0066]在fabl/fael背景中共表达质体和质体外去饱和酶以及抑制KASII导致《_7FA自WT中小于2%至多至约71%的积累增加，其高于存在于马利筋(Asckpias)中的，且等于存在于猫爪花种子中的。
[0067]16:0-ACP,即《_7脂肪酸的前体在脂肪酸生物合成的第一分支点，其受到FatB硫酯酶和KASII延长酶(elongase)竞争；并且导入16:0-ACP去饱和酶使这成为三向竞争。抑制KASII和FATB是有效降低底物竞争并增加《 -7积累的方式。《 -7FA积累的增加在宿主系中在约30%时可饱和，因为高于此水平，去饱和酶是限制的。通过在种子特异性启动子的控制下表达第二拷贝来增加Com25的剂量进一步增加《_7脂肪酸的积累。然而，高《-7FA积累物的种子还含有范围为约20%的16:0水平，呈现使质体外16:0去饱和的机会。两种质体外去饱和酶的表达提高W-7FA的积累，导致成熟种子中16:0的约50%降低。
[0068]如下文更为详细描述的，系统性代谢工程化可以是一种用于工程化改造与那些在天然来源中观察到的水平相当的不常见脂肪酸积累水平的成功策略，因为最好的fabl/fael/Com25/Ln A 9D 和 An A 9D 系积累 71%co-7FA,实质上(substantially)比在马利筋中高的水平且等于存在于猫爪花种子中的水平。
[0069]B.核酸
[0070]本发明的一些实施方案中的核酸序列在与SEQ ID NO:1比对时显示增加的百分比同一性。这些和其它实施方案内的特定核酸序列可以包含与SEQ IDN0:2具有例如至少60%，65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%96%, 97%, 98%或100%同一性的序列。本领域普通技术人员理解的是，核酸分子可以在实质上不改变编码的多肽的氨基酸序列的情况下修饰，例如依照密码子简并性依照可允许的核苷酸取代进行。
[0071 ] 在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含启动子。启动子可以基于会接受载体构建体插入的细胞类型来选择。在细菌、酵母和植物中发挥功能的启动子是本领域中公知的。启动子也可以基于其调节特征进行选择。此类特征的例子包括增强转录活性、可诱导性、组织特异性、和发育阶段特异性。在植物中，已经描述了病毒或合成起源的诱导型、组成性活性、时间调节性、和空间调节性启动子(例如见Poszkowski等，(1989)EMB0J.3:2719;0dell 等 ，(1985)Nature 313:810;Chau 等，(1989) Science 244:174-81)。
[0072]经常使用组成性启动子包括例如CaMV 35S启动子、增强型CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒启动子、甘露氨酸合酶启动子、胭脂氨酸合酶启动子、和章鱼碱合酶启动子。
[0073]有用的诱导型启动子包括例如由通过应用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂)诱导的水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子、热休克启动子、自菠菜硝酸盐还原酶可转录核酸分子序列衍生的硝酸盐诱导型启动子、激素诱导型启动子、和与RuBP羧化酶的小亚基和LHCP家族结合的光诱导型启动子。
[0074]有用的组织特异性、发育调节性启动子的例子包括￠-伴大豆球蛋白(conglycinin)7Sa启动子和种子特异性启动子。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子包括那些来自牵涉含油种子中脂肪酸生物合成的蛋白质和来自植物储存蛋白的。此类启动子的例子包括来自可转录核酸分子序列诸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶、和油质蛋白的5’调节区。另一种例示性的组织特异性启动子是种子组织特异性的凝集素启动子。
[0075]其它有用的启动子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章鱼碱合酶启动子(其在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒(CaMV) 19S和35S启动子；增强型CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒35S启动子；来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚基的光诱导型启动子；来自烟草的EIF-4A启动子(Mandel等,(1995) Plant Mol.Biol.29:995-1004);玉米鹿糖合成酶；玉米醇脱氢酶I ；玉米光收获复合物(lightharvesting compolex);玉米热休克蛋白；来自拟南芥的几丁质酶启动子；LTP(脂质转移蛋白)启动子；矮牵牛查耳酮异构酶；豆富含甘氨酸的蛋白I ;马铃薯patatin ;泛素启动子；和肌动蛋白启动子。优选地，有用的启动子是种子选择性的、组织选择性的、或诱导型的。种子特异性调节在例如EP 0255378中有讨论。
[0076]C.氨基酸序列
[0077]依照本发明的一些实施方案的氨基酸序列在与SEQ ID N0:2比对时显示增加的百分比同一性。这些和其它实施方案内的特定氨基酸序列可以包含与SEQ ID N0:2具有例如至少 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%96%，97%，98%或100%同一性的序列。在许多实施方案中，在与SEQ ID N0:2比对时具有前述序列同一性的氨基酸序列编码具有A9-18:0-ACP去饱和酶酶活性的肽。
[0078]D.改变C om25:5处突变
[0079]本发明的方面关注自亲本蓖麻去饱和酶衍生的新颖的遗传工程化去饱和酶。在具体的实施方案中，遗传工程化去饱和酶是Com25。Com25与亲本蓖麻去饱和酶在下列5处氨基酸位置不同:M114S、T117R、L118C、P179L、和G188T (依照成熟蓖麻去饱和酶PDB条目IAFR编号)。在其它实施方案中，遗传工程化去饱和酶在Com25中可以包含这5处突变中的一处或多处。例如，遗传工程化去饱和酶可以与亲本蓖麻去饱和酶在下列位置处不同:M114S;T117R;L118C;P179L;G188T;M114S 和 T117R;M114S 和 L118C;M114S 和 P179L;M114S和 G188T;T117R 和 L118C;T117R 和 P179L;T117R 和 G188T;L118C 和 P179L;L118C 和G188T;P179L 和 G188T;M114S, T117R 和 L118C;M114S, T117R 和 P179L;M114S, T1117R 和G188T;M114S, L118C和 P179L ； M114S, L118C和G188T;M114S, P179L和G188T;T117R, L118C和 P179L;T117R, L118C和 G188T;T117R, P179L和 G188T ;或 L118C, P179L和 G188T。
[0080]E.含有升高的16:0脂肪酸水平的宿主。
[0081]在优选的实施方案中，用Com25转化的宿主细胞或材料可以展现出升高的16:0脂肪酸水平。宿主细胞可以例如通过使16:0-ACP代谢在那些宿主细胞中降低而展现出升高的16:0脂肪酸水平。可以使用提高宿主细胞中的16:0脂肪酸水平的其它方法，并且本领域技术人员可以通过运用判断来选择此类方法。提高宿主细胞中16:0脂肪酸水平的方法的例子包括但不限于:1)在宿主细胞中表达质体外去饱和酶；2)在宿主细胞中抑制KASII，例如通过引入fabl基因中的突变实现；及3)降低16:0脂肪酸延长，例如，通过引入fael基因中的突变实现。
[0082]F.用于遗传转化植物材料的方法
[0083]本发明还涉及生成经转化的细胞的方法，所述经转化的细胞包含含有与SEQ IDNO:1至少60%相同的核酸序列的一种或多种核酸分子。此类核酸分子还可以包含例如非编码调节元件，诸如启动子。也可以将其它序列与非编码调节元件和可转录核酸分子序列一起导入细胞中。这些其它序列可以包含3’转录终止子、3’多聚腺苷酸化信号、其它非翻译序列、转运或靶向序列、选择标志、增强子、和操纵基因。
[0084]一般地，转化方法包括下列步骤:选择合适的宿主细胞，用重组载体转化宿主细胞，并获得经转化的宿主细胞。
[0085]用于将DNA导入细胞中的技术是本领域技术人员公知的。一般地，这些方法可以分成 5 类:(I)化学方法(Graham 和 Van der Eb (1973) Virology54 (2): 536-9; Zatloukal等，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sc1.660:136-53) ; (2)物理方法，诸如微注射(Capechi (1980)Cell 22(2):479-88)、电穿孔(Wong 和 Neumann, Biochim.Biophys.Res.Commun.(1982)107(2):584-7;Fromm 等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82(17):5824-8;美国专利 N0.5，384，253)、和颗粒加速(Johnston 和 Tang(1994)Methods CellBiol.43(A):353-65; Fynan 等,(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90 (24): 11478-82; (3)病毒载体(Clapp(1993)Clin.Perinatol.20(1): 155-68;Lu 等，(1993) J.Exp.Med.178(6):2089-96;Eglitis 和 Anderson(1988)Biotechniques 6(7):608-14); (4)受体介导的机制(Curiel 等，(1992)Hum.Gen.Ther.3 (2): 147-54;Wagner 等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89(13):6099-103);和(5)细菌介导的机制，诸如用土壤杆菌。或者，可以通过直接注射植物的生殖器官来将核酸直接导入花粉中(Zhou等，(1983)Methods inEnzymology 101:433; Hess (1987) Intern.Rev.Cytol.107:367; Luo 等，(1988) Plant Mol.Biol.Reporter 6:165;Pena 等，(1987)Nature 325:274)。其它转化方法包括例如原生质体转化，如美国专利N0.5，508，184中例示的。也可以将核酸分子注射入未成熟的胚中(Neuhaus 等,(1987)Theor.Appl.Genet.75:30)。
[0086]最常使用的用于转化植物细胞的方法是:土壤杆菌介导的DNA转移方法(Fraley等，(1983) Proc.natl.Acad.Sc1.USA 80:4803)(如美国专利 N0.5，824，877;美国专利N0.5，591，616;美国专利N0.5，981，840;和美国专利N0.6，384，301中例示的)和生物射弹或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)(诸如记载于美国专利N0.5，550，318;美国专利N0.5，538，880;美国专利N0.6，160，208;美国专利N0.6，399，861;和美国专利N0.6，403，865)。通常，核转化是期望的，但是在期望特异性转化质体，诸如叶绿体或造粉体的情况中，可以对某些植物物种诸如拟南芥、烟草、马铃薯和芸苔物种利用期望的核酸分子的微粒介导的递送来转化植物质体。
[0087]经由使用属于土壤杆菌 属的遗传工程化土壤细菌实现土壤杆菌介导的转化。几种土壤杆菌物种介导转移称为“T-DNA”的特定DNA，其可以遗传工程化改造为将任何期望的DNA部分携带入许多植物物种中。进行T-DNA介导的发病机制过程的主要事件是:诱导毒力基因、和加工并转移TDNA。此过程是许多综述的主题(Ream(1989)Ann.Rev.Phytopathol.27:583-618;Howard 和 Citovsky (1990)Bioassays 12:103-8;Kado (1991)Crit.Rev.Plant Sc1.10:1-32;Zambryski(1992)Annual Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43:465-90;Gelvin(1993)in Transgenic Plants, Kung和 Wu编，Academic Press, SanDiego,第 49 页-第 87 页；Binns 和 Howitz(1994)In Bacterical PathogenesisofPlants and Animals, Dang 编,Berlin:Springer Verlag.,第 119-38 页;Hooykaas 和Beijersbergen(1994)Ann.Rev.Phytopathol.32:157-79;Lessl 和 Lanka(1994)CelI77:321-4;Zupan 和 Zambryski(1995)Annual Rev.Phytopathol.27:583-618)。
[0088]为了对经转化的植物细胞选择或评分(不管转化方法如何)，导入细胞中的DNA可以含有在可再生的植物组织中发挥功能以生成化合物的基因，所述化合物对植物组织赋予对否则有毒性的化合物的抗性。作为选择、筛选、或评分标准物使用的感兴趣的基因包括但不限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、和抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括赋予对青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；甲氨蝶呤(和甲氧苄啶)；氯霉素；和四环素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草剂抗性基因赋予。Della-Cioppa等，(1987)Bio/Technology 5:579-84。也可以执行其它选择装置，包括但不限于对膦丝菌素(phosphinothricin)、双丙氨磷和正向选择机制的耐受性，Joersbro等,(1998)Mol.Breed.4:111-7,并且认为在本发明的范围内。
[0089]然后，可以容许通过选择或筛选鉴定并在支持再生的合适培养基中培养的经转化的细胞成熟成植物。
[0090]目前公开的方法可以与任何可转化的植物细胞或组织一起使用。如本文中使用的，可转化的细胞和组织包括但不限于能够进一步增殖以产生植物的那些细胞或组织。本领域技术人员认可许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA和适当的培养条件后植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于未成熟的胚、小盾(scutellar)组织、悬浮细胞培养物、未成熟的花序、枝分生组织、节外植体、愈伤组织、下胚轴组织、子叶、根、和叶。
[0091]自经转化的植物原生质体或外植体再生、发育、和培养植物是本领域中已知的。Weissbach 和 Weissbach (1988)Methods for Plant Molecular Biology,(编)AcademicPress, Inc., San Diego, CA;Horsch 等，(1985) Science227:1229-31。此再生和生长方法通常包括下列步骤:选择经转化 的细胞，并将那些细胞培养到胚发育的通常阶段到生根的小植物阶段。类似地，再生转基因的胚和种子。在此方法中，一般将转化体在存在选择培养基的情况中培养，所述选择培养基选择成功转化的细胞并诱导植物幼芽(shoot)的再生。Fraley 等，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 80:4803。这些幼芽通常在 2 至 4 个月内获得。此后，将所得的转基因生根幼芽在合适的植物生长培养基诸如土壤中种植。可以将幸免于暴露于选择剂的细胞，或已经在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物再生的培养基中培养。然后，可以将幼芽转移至合适的根诱导培养基中，所述根诱导培养基含有选择剂和防止细菌生长的抗生素。许多幼芽会形成根。然后，将这些移植至土壤或其它培养基以容许根的继续发育。一般地，如上文概述的方法会根据采用的特定植物品系而不同，并且因此，方法的细节在本领域技术人员的判断内。
[0092]再生的转基因植物可以自花传粉以提供纯合转基因植物。或者，可以将自再生的转基因植物获得的花粉与非转基因植物，优选地，农艺学重要的物种的近交系杂交。相反，可以使用来自非转基因植物的花粉来给再生的转基因植物传粉。
[0093]转基因植物可以将转化的核酸序列传递给其后代。优选地，转基因植物是在转化的核酸序列方面是纯合的，并在有性繁殖后且由于有性繁殖而将所述序列遗传给所有其后代。可以自由转基因植物生成的种子培养后代。然后，可以将这些额外的(additional)植物自花传粉以生成真正的植物育种系。
[0094]可以对来自这些植物的后代评估基因表达，等等。可以通过几种常见的方法诸如Western印迹、Northern印迹、免疫沉淀、和ELISA (酶联免疫吸附测定法)检测基因表达。也可以对经转化的植物分析导入的DNA的存在和由本发明的核酸分子和氨基酸分子赋予的表达水平和/或脂肪酸谱。本领域技术人员知道可用于分析经转化的植物的许多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生物化学测定法、表型筛选法、田间评估、和免疫诊断测定法。
[0095]用于特异性转化双子叶植物的方法是本领域技术人员公知的。已经对许多作物，包括但不限于拟南芥属的成员、棉(棉(Gossypium hirsutum))、大豆(大豆(Glycine max))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、和芸苔属的成员描述了使用这些方法的转化的植物再生。已经对棉(美国专利N0.5，004，863;美国专利N0.5，159，135;美国专利N0.5，518，908)；大豆(美国专利 N0.5，569，834;美国专利 N0.5，416，011;McCabe,等，(1988)Biotechnology6:923;Christou 等，(1988)Plant Physiol.87:671-4 ;芸苔(美国专利 N0.5，463，174)；花生(Cheng 等，(1996)Plant Cell Rep.15:653-7;McKently 等，(1995)Plant CellRep.14:699-703);蕃木瓜；和豌豆(Grant 等，(1995)Plant Cell Rep.15:254-8)发表了主要通过使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法。
[0096]用于转化单子叶植物的方法也是本领域中公知的。已经对许多作物，包括但不限于大麦(大麦(Hoedeum vuIgarae));玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays));燕麦(燕麦(Avenasativa));野茅(野茅(Dactylis glomerata));稻(稻(Oryza sativa),包括印度和日本变种)；高粱(高粱(Sorghum bicolor));甘鹿(甘鹿(Saccharum sp));華状羊茅(華状羊茅(Festuca arundinacea));草地草(turfgrass)物种(例如，匍莖剪股颖(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、维穗纯叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(小麦(Triticum aestivum));苜猜(苜猜(Medicago sativa))描述了使用这些方法的转化和植物再生。对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。
[0097]可以选择任何植物在目前公开的方法中使用。依照本发明修饰的优选的植物包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琉璃苣(琉璃苣属(Borago)物种)、芸苔(Canola)、蓖麻(蓖麻(Ricinus communis))、可可豆(可可(Theobroma cacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉属(Gossypium)物种、两节莽属(Crambe)物种、萼距花属(Cuphea)物种、亚麻(亚麻)物种)、小滨菊属(Lesquerella)和鲸油草(Limnanthes)物种、Linola、旱金莲(旱金莲属(Tropaeolum)物种)、月见草属 (Oenothera)物种、橄榄(olive)(木樨榄属(Olea)物种)、棕榈(油棕属(Elaeis)物种)、花生落花生属(Arachis)物种)、油菜籽(rapeseed)、红花(红花属(Carthamus)物种)、大豆(大豆属(Glycine)和野生大豆(Soja)物种)、向日葵(向日葵属(Helianthus)物种)、烟草(烟草属(Nicotiana)物种)、斑鸠菊属(Vernonia)物种、小麦(小麦属(Triticum)物种)、大麦(大麦属(Hordeum)物种)、稻(稻属(Oryza)物种)、燕麦(燕麦属(Avena)物种)、高粱(高粱属(Sorghum)物种)(Sorghum spp.)、黑麦(黑麦属(Secale)物种)或禾本科(Gramineae)的其它成员。
[0098]对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。
[0099]G.转基因种子
[0100]在本发明的一些实施方案中，转基因种子包含含有与SEQ ID N0:2至少90%相同的氨基酸序列的多肽。在这些和其它实施方案中，转基因种子包含与SEQ ID N0:1至少60%相同的核酸序列。在某些实施方案中，本发明的种子展现出升高的不常见脂肪酸例如《_7脂肪酸，诸如16:1 △ 19_和/或18:1 A 11水平。可以自能育的转基因植物收获种子，并用于培养本发明的经转化植物的后代，包括包含依照本发明的核酸序列和感兴趣的另一种基因或核酸构建体的杂种植物系。
[0101]提供以下实施例来例示某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本发明限于所描述的具体特征或实施方案。
实施例
[0102]实施例1:材料和方法
[0103]植物生长和转化
[0104]将拟南芥(Arabidopsis)植物在土壤中在连续暴露于300微爱因斯坦(microeinstein)光(I微爱因斯坦=Imol光)下在E7/2?受控环境生长室(Conviron)中培养。使用根癌土壤杆菌菌株GV3101依照Clough和Bent的方法Clough和Bent (1998)Plant J.16^):735-43转化植物。我们通过在用来自与25A红色照相机滤光器一起的X5LED?手电筒(Inova)的绿光照明后发射的荧光鉴定携带转基因的个别T1种子(Stuitje等,(2003)Plant Biotechnol.J.1(4):301-9)。Pidkowich 等,(2007)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 104(11):4742-7。分别使用滤光器 FITC 535 和 FITC 515，使用装备有 OlympusU-LH100HG?照明系统的WILD? M3Z解剖显微镜区别携带Zs-绿色和Ds-红色标志物的种子。通过在菜豆蛋白种子储存蛋白启动子或LTP170启动子的控制下放置构建体实现种子特异性表达。Slightom 等，(1983) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80 (7): 1897-1901;及 van derGeest and Hall (1997) Plant Mol Biol.33 (3): 553-7。Com25 的来源
[0105]Com25是蓖麻A 9-18:0-ACP去饱和酶的一种变体，其源自设计为鉴定针对长度小于18C的酰基链具有改善的活性的变体的组合饱和诱变/选择程序。Whittle和Shanklin(2001) J.Biol.Chem.276(24):215·00-5。Com25 与亲本蓖麻去饱和酶在下列 5 个氨基酸位置处不同:M114S，T117R, L118C, P179L和G188T (依照成熟蓖麻去饱和酶PDB条目IAFR编号)。
[0106]质体构建体
[0107]Phas:Com25。将工程化为含有其真正的转运肽并且侧翼有5’ PacI和3’ XhoI限制性位点的蓖麻变体Com25的整个阅读框克隆入质粒pDs-Red-Phas (Pidkowich等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 104(11):4742-7)(具有 Ds-Red 标志物)的相应位点中以创建Phas: Com25 (图 5)。
[0108]Phas:Com25, LTP170: Com25。将 LTP170 启动子使用引物 P17-5，BamHI (GGGATCCCCGGGTTGACATTTTTA CCTTTTT;SEQ ID NO:3)和 P17-3’ PacI(GGTTAATTAAGTCTTCAAACTCTAGGA; SEQ ID NO:4)自拟南芥基因组DNA扩增，亚克隆入pGEMT_Easy中，之后分离BamH1-PacI片段，将其克隆入质粒pDs-Red_Phas: Com25 (上文描述的)的相应位点中以创建pDs-Red-LTP170:Com25。使用BamHI和EcoRV切出含有Com25以及菜豆蛋白终止子的片段，并克隆入载体pDs-Red-LTP170-Com25内的BamHI和SmaI限制性位点中以创建Phas:Com25/LTP170:Com25(图 5)。
[0109]Phas:Fabl-HPAS。将此构建体在两步中创建；首先，构建Phas:FatB_HP，之后将FatB基因的反义部分插入以替换Fad2内含子中分开包含发夹的FatB基因的有义和反义部分的部分。为了实现这点，将150bp拟南芥FatB3’UTR自基因组DNA以有义(使用引物FatB-hps-5’PstIGGGCTGCAGMACAAGTTTCGGCCACCAACC C;SEQ ID 勵:5和卩&七8-1^8-3’父1101 CCCCTCGAGACATCAGAATTCGTMTGAT; SEQ ID N0:6)和反义(使用引物 FatB-hpa_5’NheI GGGGCTAGCAAGTTTCGGCCACCAACCC;SEQ ID NO:7和FatB-hpa-3，PaclCCCTTAATTAAACATCAGAATTCGTAATGAT; SEQ ID N0:8)两者取向扩增。将这些片段用Pstl/Xhol和Nhel/PacI限制，并用于替换 pGEM-T-Easy-HTM3 (Pidkowich 等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 104(11):4742-7)中在其等同位点处FabI的5’UTR有义和反义部分，以创建中间质粒pGEM-T-Easy-HTM4。为了创建 FatB 编码区的 300bp 反义部分，用引物 FatB-Exon-5’Sp-Bam (CCACTAGTGGATCCACCTCTGCTACGTCGTCATT;SEQ ID NO: 9)和 FatB-Exon-3，Bg-Sal(GGAGATCTGTCGACGTAGTTATAGCAGCAAGA AG; SEQ ID NO: 10)扩增片段，并使用用BamHI和SalI限制的片段来替换Fad2-内含子在用BglII和SpeI限制后的部分以创建pGEM-T-Easy-HTM5。
[0110]通过使用PacI和XhoI切出装配好的HPAS片段，并将其克隆入pZs-Green-Phas:Com25 (上文描述的质粒pDs-Red-Phas:Com25,其中已经用绿色突光蛋白标志物pCVMV:Zs-Green?(Clonetech)替换荧光标志物pCVMV:Ds_Red)的等同位点中以创建质粒 Phas:FatB-HPAS(图 5)。
[0111]Phas:AnD9d, Phas:LnD9D。将两种真菌酰基-CoA D9去饱和酶在质粒pDAB7318中组合，其中这两种基因都是由来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的种子特异性Phas启动子驱动的。构建体中的第一种基因是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的酰基CoA A9-去饱和酶，其经过再设计并合成以实现在植物中的最佳表达(美国专利申请20080260933A1)，并且与来自菜豆的菜豆蛋白基因的3’非翻译区和3’MAR融合。此构建体中的第二种去饱和酶基因是来自颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)的酰基CoA A 9-去饱和酶，其也经过再设计并合成以实现植物表达，并与根癌土壤杆菌0RF233’非翻译区融合。通过相对于颖枯壳针孢(S.nodorum)同源性搜索由颖枯小球腔菌测序项目(Broad Institute of Harvard and MIT (http: //www.broad, mit.edu))发布的基因组序列鉴定此去饱和酶。通过互补酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的olel突变体显示了它具有使棕榈酸盐去饱和化的偏爱。Phas:Fab1-HPAS-Phas:Com25。为了简化基因叠加实验，将质粒Phas: Fab I/HPAS-Phas: Com25构建为组合Com25表达与KASII抑制。为了实现这点，将菜`豆蛋白终止子自Phas:Com25分离，并克隆入中间体载体pBL (其具有的EcoRV-EcoRV片段含有驱动Com25的菜豆蛋白启动子)中以创建pBL-Phas:Com25-PhasTer。此Com25表达盒使用侧翼EcoR1-EcoRI限制性位点切出，并克隆入Phas:Fabl-HPAS内的相应位点中以创建Phas:Fabl-HPAS-Phas_Com25。见图5。
[0112]脂肪酸合成
[0113]为了分析单一种子的脂肪酸，通过将种子与甲醇中的0.2M三甲基氢氧化硫一起温育来制备脂肪酸甲酯(FAME)。Butte 等，(1982) Anal.Lett.15 (10):841_50。为了类似地分析散装种子，如下制备FAME，即将种子在0.5mLBCl3中于80° C温育I小时，用ImL己烷将其提取，然后在N2下干燥。用HP6890?气相层析-火焰离子化检测器(AgilentTechnologies)，或安装有 60mx 250 u M SP-2390 毛细管柱(Supelco)的 HP5890? 气相层析-质谱仪(Hewlett-Packard)分析FAME。在分析期间将炉温以15 ° C/分钟的速率以1.1mL/分钟的流速从100° C升高至240° C。用HP5973?质量选择检测仪(Hewlett-Packard)实施质谱术。我们通过二甲硫衍生化测定单不饱和FAME的双链位置。Yamamoto 等，(1991)Chem.and Phys.Lipids 60 ⑴:39_50。[0114]实施例1I:WT拟南芥中的Com25表达
[0115]已经报告了几种植物，包括马利筋(Hopkins和 Chisholm(1961)Can.J.Biochem.Physiol.39:829-35)和猫爪花(Chisholm和 Hopkins (1965) J.Am.0ilChem.Soc.42:49-50)在其种子中积累《_7FA。已经分离出编码负责合成棕榈酸酯(palmitoleate)的酶去饱和酶的基因。相应的重组去饱和酶酶(Cahoon等，(1997)Plant Mol.Biol.33:1105-10;Cahoon 等，(1998)Plant Physiol.117(2):593-8)的活性与许多变体去饱和酶的活性一样低于对原型硬脂酰-ACP去饱和酶报告的活性。Whittle和Shankl in (2001) J.Bi01? Chem.276 (24): 21500-5。我们比较表达马利筋和猫爪花去饱和酶及蓖麻去饱和酶的几种变体，包括来自蓖麻变种5.2的去饱和酶和Com25的效果，所述Com25源自设计为在拟南芥中增强蓖麻A 9-18:0_去饱和酶的16:0-去饱和酶活性的定向进化实验(Whittle 和 Shanklin(2001) J.Biol.Chem.276(24):21500-5)。在这些实验中，Com25 胜过其它去饱和酶酶(Bondaruk 等，(2007) Plant fceedingl26:186-94)，在 WT 拟南芥中将16:1 A9及其延长产物18:1 A11的积累从未转化的植物中几乎检出不到的水平分别增加至约2%和约12% ;在Com25转化体中产生总共约14%?-7脂肪酸。图2A ;图2B。
[0116]表I显示了虽然Com25对16:0-ACP底物比蓖麻WT(2.SmirT1)具有改善很大的keat (11.1mirT1)，但是它达不到对蓖麻变体5.2报告的(25.3min_l)。Whittle和Shanklin (2001) J.Biol.Chem.276(24): 21500-5。然而，Com25 对 16:0-ACP 的 K111 (0.12 u M)比蓖麻变体5.2的Km (0.55)低4.6倍，而且比蓖麻WT的Km (5.0)低42倍。com25在16:0-ACP底物情况下所得的特异性因子(specificity factor) 91 u M-1 ? mirT1是蓖麻变体5.2的特异性因子的约两倍，并且是蓖麻WT的特异性因子的163倍。实际上，Com25在16:0-ACP情况下的特异性因子等于蓖麻WT在其天然18:0-ACP底物情况下的(92 M—1 ? mirT1)。Com2相对蓖麻变体5.2改善的对16:0-ACP的Km提示了它更有效地与FatB和KASII竞争底物，提供了关于尽管其Keat较低，为何其表达比蓖麻变体5.2促进更大的《-7FA积累的解释。
[0117]在各种底物情况下蓖麻去饱和酶及其变体的动力学参数。
【权利要求】
1.一种编码A 9去饱和酶酶的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1至少60%相同的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸分子，其进一步包含基因调节元件。
3.权利要求2的核酸分子，其中所述基因调节元件是菜豆蛋白启动子或LTP170启动子。
4.一种A9去饱和酶酶，其包含与SEQ ID NO: 2至少80%相同的氨基酸序列。
5.权利要求4的A9去饱和酶酶，其中所述与SEQID NO: 2至少80%相同的氨基酸包含与SEQ ID NO: 2中第114位类似的位置处的丝氨酸；与SEQ IDNO: 2中第117位类似的位置处的精氨酸；与SEQ ID NO: 2中第118位类似的位置处的半胱氨酸、与SEQ ID NO: 2中第179位类似的位置处的亮氨酸；或与SEQ ID NO:2中第188位类似的位置处的苏氨酸。
6.权利要求4的A9去饱和酶酶，其中所述与SEQID NO: 2至少80%相同的氨基酸包含与SEQ ID NO: 2中第114位类似的位置处的丝氨酸；与SEQ IDNO: 2中第117位类似的位置处的精氨酸；与SEQ ID NO: 2中第118位类似的位置处的半胱氨酸、与SEQ ID NO: 2中第179位类似的位置处的亮氨酸；和与SEQ ID NO:2中第188位类似的位置处的苏氨酸。
7.一种用于增加在植物材料中不常见脂肪酸的量的方法，该方法包括:用权利要求1的核酸分子转化植物材料，使得增加不常见脂肪酸在所述植物材料中的量。
8.权利要求7的方法，其进一步包括用额外的权利要求1的核酸分子转化植物材料。
9.权利要求7的方法，其中所述植物材料包含用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的手段。
10.权利要求9的 方法，其中所述用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的手段是表达质体外去饱和酶。
11.权利要求9的方法，其中所述用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的手段是抑制 KASII。
12.权利要求11的方法，其中通过在fabl基因中引入突变实现抑制KASII。
13.权利要求9的方法，其中所述用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的手段是降低所述植物材料中16:0脂肪酸的延长。
14.权利要求13的方法，其中通过在fael基因中引入突变实现降低所述植物材料中16:0脂肪酸的延长。
15.权利要求7的方法，其中所述植物材料选自选自下组的属:拟南芥属(Arabidopsis)、琉璃苣属(Borago)、芸苔(Canola)、蓖麻属(Ricinus)、可可树属(Theobroma)、玉蜀黍(Zea)、棉属(Gossypium)、两节莽属(Crambe)、萼距花属(Cuphea)、亚麻属(Linum)、小滨菊属(Lesquerella)、鲸油草(Limnanthes)、Linola、旱金莲属(Tropaeolum)、月见草属(Oenothera)、木樨榄属(Olea)、油棕属(Elaeis)、落花生属(Arachis)、油菜籽(rapeseed)、红花属(Carthamus)、大豆属(Glycine)、野生大豆(Soja)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、斑鸠菊属(Vernonia)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、黑麦属(Secale)、或禾本科(Gramineae)的其它成员。
16.权利要求7的方法，其中所述植物材料包含用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的两种手段。
17.权利要求16的方法，其中用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的第一种手段是抑制KASII，且其中用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的第二种手段是降低所述植物材料中16:0脂肪酸的延长。
18.权利要求7的方法，其中所述植物材料包含用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的三种手段。
19.权利要求18的方法，其中用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的第一种手段是抑制KASII，其中用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的第二种手段是降低所述植物材料中16:0脂肪酸的延长，且其中用于提高所述植物材料中16:0-ACP水平的第三种手段是表达质体外去饱和酶。
20.权利要求10的方法，其中所述质体外去饱和酶是LnA 9D或An A 9去饱和酶。
21.一种用于创建与野生型植物相比在植物中包含增加量的不常见脂肪酸的遗传工程化植物的方法，所述方法包括: 用权利要求1的核酸分子转化植物材料；并 培养经转化的植物材料以获得植物。
22.权利要求21的方法，其中所述植物材料选自选自下组的属:拟南芥属、琉璃苣属、芸苔、蓖麻属、可可树属、玉蜀黍、棉属、两节荠属、萼距花属、亚麻属、小滨菊属、鲸油草、Linola、旱金莲属、月见草属、木樨榄属、油棕属、落花生属、油菜籽、红花属、大豆属、野生大豆、向日葵属、烟草属、斑鸠菊属、小麦属、大麦属、稻属、燕麦属、高粱属、黑麦属、或禾本科的其它成员。
23.通过权利要求21的方法获得的植物。
24.自权利要求23的植 物获得的植物材料。
25.权利要求24的植物材料，其中所述植物材料是种子。
【文档编号】C12N15/53GK103429741SQ201180031133
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年6月24日 优先权日:2010年6月24日
【发明者】J.尚克林, T.H.古延, T.A.沃尔什, E.J.惠特尔, M.S.皮德科维奇 申请人:陶氏益农公司, 布鲁克黑文科学联合有限责任公司