GmWRI1在调控植物产量及种子脂肪酸含量中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中GmWRIl在调控植物产量及种子脂肪酸含量中的应 用。
【背景技术】
[0002] 大豆是我国重要的粮食、油料和饲料作物。长期以来，我国大豆平均单产不高、不 稳，跟美国、巴西、阿根廷等大豆生产大国的200公斤/亩相比，一直处于（120公斤/亩） 低水平徘徊状态，总产也一直在1200万吨左右浮动，不及美国一个国家的出口量，跟日益 增长的国内大豆7000多万吨的总消费形成了极大地反差。近年来，由于受玉米、水稻等高 产作物经济效益的影响（在我国大豆主产区黑龙江省，在不计算土地费用的情况下，大豆、 玉米、水稻的比较效益为1:2:3)，我国大豆播种面积由2009年的920万公顷降到2014年 的641万公顷，降到建国以来最低值，总产也由2009年的1500万吨降至2013年的1220 万吨。大豆油是人类食用油的重要来源，占世界食用油市场的31%(Kimetal.，2004)。 目前，商用大豆品种种子油含量一般为18 % -22 %，远远低于其它油料作物种子油含量 (40% -60% )。因此，如何大幅提高大豆油脂含量一直是我国大豆育种的一个重要难题。 在大种质资源中，几乎不存在25%以上含油量的大材料，最尚仅有23 %左右（盖钓M， 2003)，利用遗传育种方法实现大豆含油量的大幅提高存在客观障碍。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物种子脂肪酸含量及产量。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质在调控植物产量和/或种子脂肪 酸含量中的应用；所述蛋白质来源于大豆（SesamumindicumL.)，其名称为GmWRIl，是下述 Al)或A2)或A3):
[0005] Al)氨基酸序列为序列2所示的蛋白质；
[0006] A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白质；
[0007] A3)在Al)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0008] 其中，序列2由412个氨基酸组成。
[0009] 为了使Al)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端 或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1、标签的序列
[0011]
[0012] 上述A2)中的GmWRI1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述A2)中的GmWRIl的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或 几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和 /或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0013] 上述蛋白质在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中的应用中，所述产量可为种 子千粒重和/或种子体积。
[0014] 上述蛋白质在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中的应用中，所述脂肪酸可为 油酸（oleicacid) 18:1和/或亚油酸（linoleicacid) 18:2。所述种子脂肪酸含量可为种 子中总脂肪酸含量或油酸18:1和/或亚油酸18:2的含量。
[0015] 上述蛋白质在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中的应用中，所述植物可为单 子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物或豆科植物。所述十字花科植 物可为拟南芥（Arabidopsisthaliana)，所述豆科植物可为大豆（SesamumindicumL.)。 [0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与GmWRIl相关的生物材料在调控植物产 量和/或种子脂肪酸含量中的应用；所述生物材料，为下述Al)至A20)中的任一种：
[0017] Al)编码GmWRI1的核酸分子；
[0018] A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒；
[0019] A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体；
[0020] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0021] A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物；
[0022] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0023] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0024] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0025] A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0026] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0027] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0028] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0029] A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0030] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0031] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0032] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0033] A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0034] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0035] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0036] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0037] 上述应用中，Al)所述核酸分子为如下al)或a2)或a3)所示的基因：
[0038] al)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
[0039] a2)与al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码GmWRIl的cDNA 分子或基因组DNA分子；
[0040] a3)在严格条件下与al)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmWRIl的cDNA分子或基 因组DNA分子。
[0041] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0042] 其中，序列1由1239个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。
[0043] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码GmWRIl的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 分离得到的GmWRIl的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmWRIl且具有 GmWRI1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0044] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85% 或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机 软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示， 其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0045] 上述生物材料在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中的应用中，所述严格条件 是在2父33(：，0.1%303的溶液中，在68°(：下杂交并洗膜2次，每次51^11，又于0.5\33(：， 0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min;或，0.IXSSPE(或0. 1XSSC)、 0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0046] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0047] 上述生物材料在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中的应用中，A2)所述的含 有编码GmWRIl的核酸分子的表达盒（GmWRIl基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达 GmWRIl的DNA，该DNA不但可包括启动GmWRIl基因转录的启动子，还可包括终止GmWRIl 基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子 包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子 的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S:来自西红柿的创伤诱导型启 动子，亮氨酸氨基肽酶（〃LAP〃，Chao等人（1999)PlantPhysiol120:979-992);来自烟 草的化学诱导型启动子，发病机理相关I(PRl)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟 酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2)或LAP启动子（均可用茉莉 酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环素诱导型启动子（美国专利 5,057,422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专 利200710099169. 7))，种子IC存蛋白质特异的启动子（例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin 和大豆betaconglycin的启动子（Beachy等人（1985)EMB0J.4 :3047-3053))。它们可 单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适 的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病 毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止 子（参见，例如：0dell等人（I985)Nature313:810;Rosenberg等人（1987)Gene, 56:125; Guerineau等人（1991)Mol.Gen.Genet, 262:141 ;Proudfoot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人GenesDev. ,5:141;Mogen等人（1990)PlantCell, 2:1261;Munroe等人（1990) Gene, 91:151 ;Ballad等人（1989)NucleicAcidsRes. 17:7891 ;Joshi等人（1987)Nucleic AcidRes.，15:9627)。
[0048] 可用现有的表达载体构建含有所述GmWRIl基因表达盒的重组载体。所述植物 表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译 区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如 胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋