专利名称：家蚕质型多角体病毒荧光定量pcr检测方法
技术领域：
一种家蚕质型多角体病毒(BmCPV)荧光定量PCR检测方法，属生物技术领域。
背景技术：
家香质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV) 属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，是危害养蚕业的主要病原物之一，给生产上造成了巨大经济损失。BmCPV病毒粒子直径约为50-65nm，形状呈正二十面体，具有独特的单层衣壳结构。 基因组由10节段双链RNA分子组成，目前把质型多角体病毒按照电泳迁移率的不同分成14 个电泳型，BmCPV属I型。其宿主域主要是鳞翅目，双翅目，膜翅目和鞘翅目等昆虫。BmCPV 专一性感染家蚕中肠上皮细胞，感染了 BmCPV的家蚕中肠上皮细胞的主要细胞器均发生显著病变。家蚕表现为发育不良、体形瘦弱、行动呆滞。随着病程的推进，在中肠后部可看到白色的褶皱，这是家蚕质型多角体病的典型病症之一。中肠乳白色的病变是家蚕质型多角体病肉眼诊断的重要依据之一。目前对家蚕质型多角体病的防治尚未取得突破性进展，生产上主要以预防为主。 家蚕病毒病的诊断技术相对落后，主要通过对典型症状的肉眼判断为主。虽然，也有学者尝试利用其它诸如血清学方法、酶联抗体-ELISA法、胶乳凝集反应和单克隆抗体法用于家蚕病毒病的诊断，但这些检测方法有的准确性低、有的无法定量，有的操作烦琐等，均没有形成体系化、稳定化的检测方法，很难在实际诊断中推广应用。经对现有发明专利检索发现， 刘吉平等(专利号CN1021M522A，2011年)采用常规PCR方法检测BmCPV。常规PCR方法扩增后需电泳检测，易造成PCR产物污染及环境污染，不能定量，且不适合高通量检测。荧光定量PCR将常规PCR和荧光检测相结合，仪器自动分析，高通量，无后续处理，具有高灵敏性、高特异性、重现性好，且可以对样品中的病毒含量进行准确定量，已成为病毒检测的重要方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种家蚕质型多角体病毒荧光定量 PCR检测方法。本发明检测灵敏度可达IO1个数量级拷贝的病毒分子，具有灵敏性高、稳定性高、可以定量，特异性好，假阳性低等特点。本发明通过以下技术方案予以实现，步骤如下步骤一，以家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列为靶目标，利用I^rimer Premier 5.0软件设计特异性引物，扩增目的基因片断(SEQ ID No :1)。所述特异性引物为正向引物5‘ ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3，，反向引物5'ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3，。步骤二，构建含目的基因片断的定量标准质粒，所用载体为pGEM-T Easy ；步骤三，提取样品RNA，反转录合成cDNA ；步骤四，实时荧光定量PCR扩增及标准曲线的建立。PCR反应体系为95°C预变性3min ；95°C 15s，60°C lmin，共 40 个循环。本发明的有益效果为与RT-PCR相比，本发明的方法无需扩增后电泳分析，避免了 PCR产物污染及制胶过程中的健康损害；本发明的方法具有灵敏性高、稳定性强、特异性好及可以准确定量等特点；本发明可同时进行大批量样品的检测，具有高通量性；本发明方法检测范围广，在IO1-IO7拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可达7个数量级。
图1家蚕质型多角体病毒绝对定量的标准曲线图。图2家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商所建议的条件；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例步骤一，设计特异性引物从基因数据库中检索获得家蚕质型多角体蛋白基因序列(登录号为AB003361)， 利用I^rimer Premier 5. 0软件设计得到一条特异性引物，目的扩增片段为118bp (SEQ ID NO :1)。设计的引物序列为正向引物5'ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3，，(SEQ ID NO 2)反向引物5'ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3，。(SEQ ID NO 3)步骤二，定量标准质粒的构建以提取的家蚕质型多角体病毒RNA为模板，应用I^rimer script RT reagent kit (购自TaKafci公司)反转录合成cDNA。反应体系共20 μ L，其中，5 XI^rimer script Buffer 4 μ L, Primer script RT Enzyme Mix I 1 μ L, Oligo dT Primer 1 μ L, Random 6mers 1 μ L，Total RNA(1 μ g) 2 μ L，RNase-free 水 11 μ L。反应条件为37 °C 15min， 85°C 5s0以反转录合成的cDNA为模板，用正向引物(SEQ ID NO 2)和反向引物(SEQ ID NO :3)扩增目的基因片断，PCR反应体系为10XPCR Buffer (Mg2+)2. 5μ L, dNTP(各 10mM)0. 5μ L,正向引物(10 μ mol/L) 0. 6 μ L，反向引物(10 μ mol/L) 0. 6 μ L，cDNA 模板 1· 0 μ L，Taq (5U/ μ L) 0· 5 μ L，ddH20 19. 3 μ L，终体积 25 μ L。反应条件为94 "C 2min ； 94°C 30s，58°C 40s，72°C 40s，共 30 个循环；72°C lOmin。反应结束后，取 5yL PCR 产物在 1 %的琼脂糖凝胶上电泳分析。PCR产物经电泳鉴定后，通过胶回收纯化目的片段，然后将目的片段与PGEM-T Easy载体连接，将其转化ToplO感受态细胞，进行测序验证。阳性质粒用碱裂解法进行提纯，根据紫外分光光度计测定0拟60/280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数。质粒拷贝数=质粒浓度(μ g/μ L) X6. 02X 1023mol/1000M, M 代表质粒分子量。步骤三，病毒样品RNA的提取
采用Trizol法提取待检样本的RNA。具体步骤如下(1)将待检样品放入处理好的研钵中，用研杵迅速将样品砸碎并磨成粉末，分装到 RNase-free 的 1. 5mLEppendorf 管中，每 0. Ig 组织加 ImL Trizol，样品体积应小于 Trizol 体积的10% ；(2)振荡混勻，室温温育约lOmin，12000g，4°C离心IOmin ；(3)将上清转移到另一个新的离心管中，每mL加入0.2mL氯仿(1/5体积)，剧烈摇动15s，室温放置5min，12000g，4°C离心15min ；混合物分成下层的红色苯酚-氯仿相，中间的蛋白质沉淀和上层无色水相。RNA即位于上清液；(4)将上清液转移到另一个干净离心管中，等体积加入预冷的异丙醇，颠倒混勻， 室温静置lOmin，12000g，4°C离心lOmin，留下RNA沉淀，弃上清；(5)加入 75% 乙醇，ImL Trizol 加 ImL 75% 乙醇，涡旋混勻，7500g，4°C离心 5min，
弃上清；(6)自然控干RNA沉淀约5-lOmin，用30-40 μ L的RNase-free水常温溶解RNA ；(7)取1 μ L稀释100倍后，5 μ L用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，剩余用于分光光度计检测总RNA浓度和纯度，_80°C保存备用。样品RNA的反转录同步骤二中的反转录。步骤四，实时荧光定量PCR扩增及标准曲线的建立。将步骤2中的定量标准质粒稀释至1.0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、 i.oxio3、i. ox Io^loxio1U. ox 10°拷贝/y l，以稀释后的标准液为模板，进行荧光定量PCR扩增。其中，1. OX IO7 1. OX IO3拷贝/μ L用于建立标准曲线；1. O X IO2U. O X IO1, 1.0X10°拷贝/yL作为阳性对照，同时检测PCR反应的灵敏性。两个家蚕品种(P50和意 16)的未感染中肠cdna及灭菌水作为阴性对照的模板。每个反应作3个平行样，进行组内的重复性检验。反应体系为:2XSYBR Premix Ex Taq 10 μ L，正向引物(10 μ mol/L) O. 4 μ L， 反向引物(10ymol/L)0. 4yL，模板lyL，ddH20 8. 2 μ L，终体积20 μ L。反应条件为95°C 预变性:3min ;95°C 15s,60°C lmin，40个循环。检测结束后，荧光PCR仪自动绘制标准曲线 (图1)。本检测方法灵敏度可达到10个拷贝，在1. O X IO7 1. O X IO1拷贝/ μ L范围内具有良好的线性关系，其检测范围可达7个数量级。步骤五，重复性分析每个浓度的标准液均检测3个平行样，进行重复性分析，通过检测其CT值的变异系数进行重复性评价，下表结果显示，变异系数均小于0. 5%，表明本检测方法重复性很好， 稳定性强。
权利要求
1.一种家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、以家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列(SEQ ID No:l)为靶目标，设计特异性引物，扩增目的基因片断；O)、利用步骤(1)所得片断构建定量标准质粒； (3)、提取样品RNA，反转录合成cDNA ；G)、实时荧光定量PCR检测方法检测样本中的家蚕质型多角体病毒含量。
2.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法，其特征是，步骤 ⑴和步骤⑷中，扩增时所用引物为正向引物5 ‘ ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3 ’， 反向引物5 ‘ ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3 ’。
3.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法，其特征是，步骤 (2)中所述质粒使用的是pGEM-T Easy0
4.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法，其特征是，步骤中，PCR反应体系为95°C预变性:3min ;95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法，属生物技术领域。本发明方法包括标准质粒的构建、特异性引物的设计、实时荧光定量PCR的扩增及标准曲线的建立、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备及其检测结果的判定。本发明灵敏性高、稳定性好、特异性强，可以定量，适用于病毒感染的批量检测。
文档编号C12Q1/68GK102559929SQ20121000470
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者吴萍, 李龙, 郭锡杰, 陈涛 申请人:江苏科技大学