专利名称：一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用。
背景技术：
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等，严重者能导致患者死亡。近些年EV71病毒引发的手足口病在我国呈上升趋势，2008年约有50000万人感染，死亡病例高达120人[Ooi E E,Phoon M C,Ishak B,et al. Seroepidemiology of human enterovirus 71. EmergInfect Dis. 2002；8 :995-997.]。EV71的早期诊断对后期疾病的防治工作具有重要意义。但建立在病毒培养基础上的“金标准法”，难以用于临床。尽管RNA检测已经研制成功，该方法操作复杂，且价格昂贵，难以在基层推广应用。同时由于EV71隐性感染的存在，仅凭RNA阳性往往不能确定患者是否为近期发病。相比之下，酶联检测简单、低廉，且是EV71-IgM是急性感染的重要标记物，具有更广泛的应用价值。目前，商品化EV71-IgM检测试剂中所采用的抗原均为灭活的EV71全病毒颗粒，能在发病的第二天即可检测出IgM抗体的存在，显然，以重组抗原为基础研制的试剂在生产及操作等方面较全病毒颗粒具有明显的优势。EV71为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约30nm。组成EV71病毒粒子基本单位为4种衣壳蛋白(VPl VP4)，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其它3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPl VP3上。目前，对EV71免疫诊断试剂的研究主要集中在重组VPl上，Shih等曾用EV71的VPl基因的原核表达产物作为抗原诊断EV71的感染，研究结果显示重组EV71-VP1抗原能与全部的12份EV71急性感染者和26份既往感染者血清发生阳性反应，但与健康人(5份)和柯萨奇16急性感染者血清(2份)无交叉反应[Shin-Ru Shih, et al Expressionof Caspid Protein VPl for Use as Antigen for the Diagnosis of EV71 Infection.J Med Virol, 200061 :228-234] 0但发明人的检测结果显示仅以重组VPl建立的普通EV71-IgM检测技术其灵敏度显著低于全病毒颗粒为基础的商品化试剂，这一结果提示除了VPl外，还有存在其他具有诊断意义的抗原表位。在对牛肠道病毒的研究中，发现针对VP3表位的中和活性要显著高于VPl表位，而最新的研究显示恩韦肟(抗病毒药)类化合物AN-12-H5具有抑制EV71对BD细胞的感染的作用，但VPl和VP3位点的突变能使AN-12-H5作用消失，这些结果提示VP3在EV71病毒感染中可能具有与VPl相同的重要作用，但目前关于VP3抗原表位分析及其在EV71血清学检测中的应用未见报道。但野生的EV71-VP3基因很难在大肠杆菌中实现高表达，主要原因在于野生型VP3基因共含有46个大肠杆菌表达系统的稀有密码子，占整个VP3氨基酸的18. 9%，特别是G、R超过稀有密码子含量超过50%，限制了其基因的表达，直接影响了其在EV71-IgM ELISA、检测试剂中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的基因。本发明的目的还在于提供含肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的基因的载体和基因工程菌。本发明的目的还在于提供肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途。本发明的目的还在于提供肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71重组疫苗中的用途。一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原，所述重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。包含肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的表达载体。所述表达载体的原始载体为pBET_28a。包含肠道病毒71衣壳蛋白3表达载体的基因工程菌。所述基因工程菌的原始菌株为大肠杆菌。所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途。所述抗体检测试剂用于检测手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎或脊髓灰质炎样的麻痹性疾病。所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71重组疫苗中的用途。本发明的有益效果本发明根据VP3氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子，反向翻译成基因序列，并采用退火延伸PCR技术进行基因拼接，获得726个核苷酸组成的改造后的VP3基因，并以此为基础，实现了 EV71-VP3抗原的高效表达；本发明是建立高效表达的EV71-VP3重组抗原的基础上，可有效的避开生产和检测过程中与EV71病毒的接触，降低了整个实验的危险性；本发明对比了 VPl和VP3抗原活性，显示VPl和VP3抗原与EV71血清的反应具有明显的互补性，两者联合使用能提高手足口病检测的灵敏度，EV71-VP3具有明确的免疫诊断意义，可用于对EV71急性感染的临床诊断。
图1为EV71-VP3改造基因前后的克隆表达(从左到右依次为Marker、改造前、改造后)。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1EV71-VP3基因的改造和合成通过生物信息学软件，采用大肠杆菌优势密码子将EV71-VP3抗原的氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，改造后的EV71-VP3基因序列如序列表中SEQ ID NO 1所示；考虑到目前国内基因引物合成效率，将上述基因分为共A、B、C和D 4段分别予以合成，四段基因片段末端具16个核苷酸的匹配序列。在进一步拼接成完整EV71-VP3基因序列，每段合成的引物序列如表I所示，共分为3步第I步A、B、C、D基因片段的合成合成上述基因共需要3轮退火延伸PCR反应，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ I、双蒸水23 μ I、XFl及XRl弓丨物各I μ 1，期中X代表Α、B、C、D，PCR反应条件为94°C I分钟后，94°C I分钟，550C I分钟，72°C I分，5个循环；后续第η轮PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ I、双蒸水22 μ I、XFn及XRn引物各I μ 1，η_1轮PCR产物I μ 1，η代表2，3 ;反应条件为PCR反应条件为94°C 3分钟后，94°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分钟，30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得A、B、C、D四段基因。
第2步AB基因片段和⑶片段的PCR退火延伸合成基因片段拼接的PCR反应体系为百泰克公司2父？0 反应液25111、双蒸水23111、A基因及B基因各1μ 1，PCR反应条件为94°C I分钟后，94°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2父？0 反应液25111、双蒸水22111、引物八 4及引物BR4基因各I μ 1，PCR反应条件为94°C I分钟后，94°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分，5个循环；30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得AB基因片段；CD基因片段的拼接方法同AB，相应A换成C，B换成D，即可获得⑶基因片段。第3步EV71_VP3基因片段的获得PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ I、双蒸水23 μ I、AB基因及⑶基因各I μ 1，PCR反应条件为94°C I分钟后，94°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分，5个循环 ’第二轮PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ I、双蒸水22 μ I、引物AF3及引物DR3基因各I μ 1，PCR反应条件为94°C I分钟后，94°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分，5个循环；30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得整个基因片段。表1A、B、C、D基因片段PCR引物
权利要求
1.一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原，其特征在于，所述重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.包含权利要求I所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的原始载体为pBET_28a。
4.包含权利要求2所述表达载体的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的原始菌株为大肠杆菌。
6.权利要求I所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途，其特征在于，所述抗体检测试剂用于检测手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎或脊髓灰质炎样的麻痹性疾病。
8.权利要求I所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71重组疫苗中的用途。
全文摘要
本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用。本发明重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。采用基因拼接技术通过退火延伸PCR技术，获得大肠杆菌密码子优化的VP3基因，实现了优化VP3基因在大肠杆菌的高效表达，并通过亲和层析法纯化获得相应的重组EV71-VP3抗原，获得的EV71-VP3抗原能与手足口病患者血清发生特异的免疫反应，与EV71-VP1联合使用能提高手足口病检测的灵敏度，可用于对EV71急性感染的临床诊断。
文档编号C12N15/41GK102628054SQ20121008379
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者修冰水, 冯晓燕, 张贺秋, 戴振华, 杨锡琴, 陈堃 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所