专利名称：一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产L-乳酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
乳酸是一种古老且重要的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生产物，被广泛应用于药品、医药、饲料、化工的等领域。在食品工业上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。乳酸，尤其是L-乳酸具有很强的杀菌作用，可直接用作手术室、病房、实验室等场所的消毒剂。L-乳酸、L-乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。乳酸可添加至烟草中，能保持烟草的湿度，提高卷烟的质量。还可以用来处理纺织纤维，可使之易于着 色，增加光泽等。L-乳酸经聚合可生成立链的或环状的聚乳酸，在人体内能被分解成L-乳酸为人体代谢，因此可用于生产缓释胶囊制剂、生物降解纤维、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然条件下缓慢分解，它不像PVC、PP塑料那样造成“白色污染”。因此在制造食品包装材料和农用薄膜等方面有很大的潜力。由此可见，L-乳酸的发展前景十分诱人。乳酸可以通过化学合成法、微生物发酵法(同型乳酸发酵、异型乳酸发酵)及酶法几种方法合成得到。由于微生物发酵能够专业得到L-乳酸且无污染，因此发酵法被广泛应用于L-乳酸的生产。目前国内外多以米根霉、德氏乳杆菌等进行L-乳酸发酵生产。根霉属于异型乳酸发酵，营养要求简单，但转化率相对较低，且发酵产物光学纯度不高。乳酸细菌属于同型乳酸发酵，转化率高，产物光学纯度也较高，属于化能异养型微生物，必须由外界提供多种营养物质及生长因子，如氨基酸、维生素、核酸碱基等。自然界中产L-乳酸能力强，并可应用于工业生产的菌种只有霉菌中德根霉属及细菌中的乳杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属。为了提高发酵产L-乳酸的产量，降低生产制备成本，提高生产质量，国内外对其生产过程进行了大量研究，主要包括生产菌种诱变改良、低价原料的开发利用、发酵工艺的优化等方面。由此可见，提高L-乳酸发酵产物光学纯度、提高发酵糖酸转化率、提高产物耐高糖能力等已经成为发酵产L-乳酸的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种凝结芽孢杆菌及其诱变选育方法，使其发酵产物L-乳酸产量大幅度提高。本发明要解决的技术问题之二在于提供所述凝结芽孢杆菌在混合发酵产L-乳酸中的应用。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
一种凝结芽抱杆菌(BacillusBC-N6242,已于2012年5月10日保藏于中
国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC M 2012156。本发明所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242的筛选方法是凝结芽孢杆菌BC-3出发菌株经低能氮离子注入诱变后，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选得到耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株。然后将所得的菌株按一定比例与干酪乳杆菌LC-N235混合接入发酵培养基，经摇瓶发酵筛选出发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述过程，直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌{Bacillus coagulans) BC-N6242。本发明诱变得到的凝结芽孢杆菌BC-N6242菌株的形态学及生理生化学特征如下
菌落颜色米白色；
需氧方式兼性厌氧；
菌落大小2 6mm ；
适宜生长温度4(T45°C ；
适宜生长pH :7. 0 7.4 ;
菌落形态圆形；
革兰氏染色阳性；
本发明所提供的凝结芽孢杆菌BC-N6242的诱变方法，具体步骤如下
(a)、单孢子悬浮液制备将凝结芽孢杆菌BC-3出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为IO6个/毫升。(b)、低能氮离子注入诱变取0. ImL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20KeV、注入剂量为180X1013ionS/Cm2下对其进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用ImL无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上；在40 45°C下倒置培养2 3d。(C)、琥珀酸平板初筛将步骤(b)筛选到的能生长良好且透明圈大的菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在4(T45°C下倒置培养2 3d，筛选菌株。(d)、纯乳酸平板初筛将步骤(C)筛选到比出发菌株延迟出现菌落的单菌落挑接至纯乳酸平板培养基上，在4(T45°C下倒置培养2 3d，筛选在纯乳酸平板上不能生长的菌株。(e)、发酵复筛将步骤(d)筛选出的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基，在4(T45°C下培养f 2d，取斜面培养物接入种子培养基在4(T45°C下扩培12 20h。取种子液与干酪乳杆菌LC-N235种子液按比例接入发酵培养基，接种量59Tl5% (v/v)，250mL摇瓶装液量2(T50mL，发酵温度4(T45°C，发酵3(T50h后测定L-乳酸含量，筛选出发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌BC-N6242。在上述筛选方法中步骤(b)所采用的高糖平板培养基包含如下质量百分数的组分碳源25% 35%、氮源I. 0% 2. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂2% 4%，琼脂I. 0% 1. 5%,其余为水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；中和剂为重质碳酸钙。步骤(c)所采用的琥珀酸平板培养基以259^35%的琥珀酸代替高糖培养基中碳源，其他成分不变。步骤(d)所采用的纯乳酸平板培养基以
0.49TO. 6%的乳酸代替高糖培养基中碳源，其他成分不变。在上述筛选方法中步骤(b)所采用的斜面培养基包含如下质量百分数的组分碳源0. 4% 0. 6%、氮源I. 0% 2. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂0. 2% 0. 4%，琼脂
I.09T1. 5%，其余为水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；中和剂为重质碳酸钙。在上述筛选方法中步骤(e)所采用的种子培养基包含如下质量百分数的组分碳源4% 8%、氮源I. 0% 5. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂2% 4%，其余为水，pH 7. 0 7. 4 ；其中所述碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或几种；氮源为蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种混合；中和剂为重质碳酸钙。在上述筛选方法中步骤(e)所采用的发酵培养基包含如下质量百分数的组分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂5% 10%，其余为水，pH
7.(T7. 4 ;其中所诉碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或几种；氮源为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏中的一种或几种混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐磷酸盐中的一种 或多种；中和剂为重质碳酸钙。本发明混合发酵所用的干酪乳杆菌{LactobaciIluscase已于2012年5月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC M 2012157。所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235在混合发酵产L-乳酸中的应用。包含如下步骤
1)、平板培养将凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上培养，培养温度为35 45°C，培养时间为2 3 d ；
2)、斜面培养将步骤I)平板培养的两种菌分别接种至斜面培养基培养，培养温度为35 45°C，培养时间I 2 d ；
3)、种子培养将步骤2)中的两种菌的斜面培养物分别接种至种子培养基中培养，培养温度为35 45°C，250ml摇瓶装液量l(T30ml，培养时间12 20h ；
4)、混合发酵将步骤3)中的两种菌的种子培养液按凝结芽孢菌BC-N6242:干酪乳杆LC-N235=(0. 5 2) :1的比例接种至发酵培养基中，接种量5 15%(v/v)，250ml摇瓶装液量2(T50ml，发酵温度40 45 V，发酵培养30 50h。所述步骤I)平板基本培养基包含如下质量百分数的组分碳源4%飞％、氮源
I.0% 2. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂2% 4%，琼脂I. 0% 1. 5%、其余为水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分碳源0. 390). 6%、氮源I. 09T2. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂0. 2% 0. 4%、琼脂I. 0% 1. 5%、其余为水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。所述种子培养基包含如下质量百分数的组分碳源49T8%、氮源19T5%、无机盐0. 029T0. 08%,中和剂29T4%，其余为水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分碳源109^20%、氮源I. 09T3. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂5. 0% 10. 0%，其余为水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或多种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。本发明的有益效果在于本发明采用低能氮离子注入诱变凝结芽胞杆菌BC-3出发菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选出能够耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株，再通过“混合发酵实验”筛选出高产菌株作为下一轮诱变的出发菌株，直至筛选到目标菌株，即凝结芽胞杆菌BC-N6242。最后将其与干酪乳杆菌LC-N235按2:1的比例混合接入发酵培养基，该混合菌株能高效地利用葡萄糖发酵产L-乳酸，糖酸转化率高，且能有效的缩短发酵时间。在5L发酵罐中，按凝结芽孢菌BC-N6242 :干酪乳杆LC-N235=2:1的比例，L-乳酸产量达到了 235g/L，比同等培养条件下的干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽胞杆菌BC-3原始出发菌株或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了 45. 1%、 57. 7%、14. 6%，具有重大的社会意义和经济价值。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I
本实施例说明将凝结芽孢杆菌原始菌株进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下
(a)、单孢子悬浮液制备取4(T45°C恒温培养2 3d的凝结芽孢杆菌BC-3原始出发菌株新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min (250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度IO6个/晕升。(b)、低能氮离子注入诱变取0. ImL步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在20KeV的能量下对干酪乳杆菌进行离子注入。注入剂量为180X1013ions/cm2，靶室真空度为10_3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用Iml无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上，在4(T45°C下倒置培养2 3d。(C)、诱变菌株的筛选
琥珀酸平板初筛将步骤(b)筛选到的生长良好且透明圈大的单菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在4(T45°C下倒置培养2 3d，筛选比出发菌株延迟出现菌落的菌株。纯乳酸平板初筛将琥珀酸平板上筛选到生长良好且透明圈大的单菌落挑接至高乳酸平板培养基上，在4(T45°C下倒置培养2 3d，筛选在纯乳酸平板不生长的菌株。发酵复筛将初筛最终筛选到的菌株的单菌落和干酪乳杆菌LC-N235分别接至斜面培养基，在35 45°C条件下培养f2d ;将斜面培养物分别接入种子培养基在35 45°C、5(Tl20rmp摇床转速下扩培12 20h。取筛选到的菌株的种子液与干酪乳杆菌LC-N235混合发酵复筛，即初筛得到的所有凝结芽孢杆菌与干酪乳杆菌LC-N235按比例混合接入发酵培养基，接种量5% 15% (v/v)，250mL摇瓶装液量2(T50mL，发酵温度35 45°C，发酵发酵时间3(T50h ;测定混合发酵产L-乳酸的含量，筛选出混合发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌BC-N6242。其中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)
步骤(b)中所用的高糖平板培养基为葡萄糖30%，蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，硫酸镁0.05%，碳酸钙3%，琼脂I. 2%，其余为蒸馏水，pH 7.0。步骤(c)中所用的琥珀酸平板培养基以8%琥珀酸代替高糖培养基中“葡萄糖30%”，其他成分不变。所用的纯乳酸平板培养基以5%乳酸代替中高糖培养基中“葡萄糖30%”，其他成分不变。 步骤(a)和(C)中所用的斜面培养基为葡萄糖0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏0. 3%，酵母膏0. 3%，硫酸镁0. 05%，碳酸钙0. 3%，琼脂I. 2%，其余为蒸馏水，pH 7. O。步骤(c)中所用的种子培养基为葡萄糖6%，蛋白胨1%，酵母膏1.0%，硫酸镁0.05%，碳酸钙3%，其余为蒸馏水，pH 7.0。步骤(c)中所用的发酵培养基为葡萄糖15%，蛋白胨0. 05%，酵母膏I. 5%，硫酸镁0.05%，碳酸钙7.5%，其余为蒸馏水，pH 7.0。发酵结束后检测各菌株L-乳酸含量如表I所示
表I
I ~干酪乳杆菌"""凝结芽孢杆菌BC-3 '凝结.嘗孢杆菌I
I万LC-K235出发菌株BC-K6262
发酵吋间(h)^^ 40^I I I
L-乳酸含量(gL)162149205
经过平板组合筛选及单因素混合发巾选获得的凝结芽孢杆菌突变株在发酵过程中L-乳酸产量明显高于出发菌株。实施例2
本实施例说明高产菌株凝结芽孢杆菌BC-N6262以及干酪乳杆菌LC-N235的遗传稳定性。传代发酵试验结果如表2所示
表权利要求
1.一种凝结芽孢杆菌(feci77m coa讲7aas)BC-N6242，已保藏于中国典型培养物保藏中心 CCTCC，保藏编号CCTCC M 2012156。
2.权利要求I所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235在混合发酵产L-乳酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包含如下步骤 1)、平板培养将凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上培养，培养温度为4(T45°C，培养时间为2 3 d ； 2)、斜面培养将步骤I)平板培养的两种菌分别接种至斜面培养基培养，培养温度为40 45°C，培养时间I 2 d ; 3)、种子培养将步骤2)中的两种菌的斜面培养物分别接种至种子培养基中培养，培 养温度为35 45°C，250ml摇瓶装液量l(T30ml，培养时间12 20h ； 4)、混合发酵将步骤3)中的两种菌的种子培养液按凝结芽孢菌BC-N6242:干酪乳杆LC-N235=(0. 5 2) :1的比例接种至发酵培养基中，接种量5 15%(v/v)，250ml摇瓶装液量2(T50ml，发酵温度35 45 V，发酵培养30 50 h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述步骤(I)平板基本培养基包含如下质量百分数的组分碳源4% 6%、氮源I. 09T2. 0%、无机盐0. 029T0. 08%、中和剂2% 4%，琼脂I.09T1. 5%、其余为水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分碳源0. 39TO. 6%、氮源I. 09T2. 0%、无机盐0. 029T0. 08%、中和剂0. 2%"0. 4%、琼脂I.09T1. 5%、其余为水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述种子培养基包含如下质量百分数的组分碳源4% 8%、氮源1% 5%、无机盐0. 02% 0. 08%,中和剂2% 4%，其余为水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、无机盐0. 02% 0. 08%、中和剂5. 0% 10. 0%，其余为水，pH7.(T7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或多种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
全文摘要
本发明公开一株凝结芽孢杆菌BC-N6242，保藏号登记号为CCTCCM2012156。本发明采用低能氮离子注入诱变凝结芽孢杆菌，分别利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选，与干酪乳杆菌“混合发酵”筛选，直至最终筛选到目标菌株。将该菌株与干酪乳杆菌LC-N235按比例混合发酵。在5L发酵罐中按2∶1的比例接入种子培养液后发酵培养48h，产物L-乳酸的产量达到235g/L，较干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽胞杆菌BC-3或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了45.1%、57.7%、14.6%，且有效缩短凝结芽胞杆菌单独发酵时间24h，具有重大的社会意义和经济价值。
文档编号C12R1/07GK102653725SQ201210172600
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者李玉燕, 虞龙, 钱梦宇, 陈晓双, 黄思思, 龚文静 申请人:南京工业大学