神经源性因子和胶质生成性因子及其测定的制作方法
【专利摘要】本文中公开了用于测量物质或物质的来源促进神经发生和胶质生成的潜能的定量测定。还公开了促进神经发生和胶质生成的物质。
【专利说明】神经源性因子和胶质生成性因子及其测定
[0001]相关申请的参考
[0002]本申请要求2011年8月19日提交的美国临时专利申请号61/575，378和2011年12月28日提交的美国临时专利申请号61/580，991的利益；为了所有目的将所述美国临时专利申请的说明书和附图通过引用整体并入本文。
[0003]关于联邦政府资助的声明
[0004]不适用
[0005]领域
[0006]本申请涉及促进神经发生和胶质生成的物质以及用于这样的物质的测定的领域。
[0007]背景
[0008]间充质基质细胞包括一群称为间充质干细胞的多潜能干细胞(综述于[I]中)。成年哺乳动物的间充质干细胞(MSC)的主要来源是骨髓；获自骨髓的多潜能干细胞被称为下列不同名称:间充质干细胞(MSC)、骨髓粘附基质细胞(MASC)、骨髓粘附干细胞和骨髓基质细胞(BMSC)。间充质干细胞已被作为用于神经组织修复的潜在细胞疗法进行了研究(综述于[2]中)。MSC或MSC衍生物至神经系统的移植已显示在神经变性疾病包括中风、帕金森病、脊髓损伤、多发性硬化和新生儿缺氧缺血性脑损伤的许多模型中是有益的[3-9]。
[0009]目前的证据表明MSC或其衍生物的移植激活受损神经组织[9-13]和正常脑组织[14]中的内源性再生机制。这些再生过程包括内源神经干细胞的增强的增殖、新生儿神经元的增加的存活[10-11]，胶质生成[7]以及炎症细胞因子产生的调节[15]。据认为神经保护作用和神经增殖的增强至少部分是通过由移植的细胞分泌的可扩散的神经营养因子和细胞因子介导的。事实上，已显示MSC在培养物中分泌许多生长因子[16，17];并且分泌的生长因子的身份在神经变性环境中可通过移植来调节[18，19]。
[0010]因此重要的是鉴定由MSC及其衍生物产生的负责间充质细胞的神经源性活性和胶质生成活性的因子。MSC与神经细胞之间的体外相互作用的研究对产生适合于几种不同细胞类型(例如，神经元、神经胶质细胞、神经干细胞、间充质细胞)的培养条件提出了挑战，每一种类型对基底和生长培养基具有不同的要求。事实上，在大多数系统中，共培养条件(例如，血清的存在或不存在，或使用MSC单层作为少数神经细胞的基底)选择性地偏爱某些细胞，但以牺牲其它细胞为代价，这导致不一致的结果[23-26]并且阻止了 MSC作用的充分定量。例如，某些培养系统有利于神经元但非神经胶质细胞的生长；还未发现同时支持神经前体细胞和3个主要类型的神经细胞(神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞)的生长的系统。
[0011]MSC和其它物质对神经干细胞的增殖和至不同神经谱系的分化(即，神经发生)的作用通常使用丝裂原驱动的神经球作为神经干细胞/早期前体细胞的来源在体外进行研究；随后通过将神经球涂铺在粘附基底上并且撤除促有丝分裂生长因子来诱导它们的分化[23-26]。然而，神经球中的细胞可能不反映神经前体细胞的天然库，因为它们的生长条件会选取对于非生理性的高浓度的生长因子和非附着型生长的响应者[27，28]。从而有可能的是，在共培养开始时，来源于神经球的细胞可能已被培养条件重编程。此外，在神经球共培养实验中，神经干细胞前体的生长状态难以观察，因为其存在于神经球自身内部的“盲点”中。最后，通过细胞附着状态的改变对神经分化的诱导可能在神经球系统中掩盖测试物质的作用。
[0012]为了上述原因，能够定量在相同条件下神经源性和胶质生成性因子对神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的作用的系统仍然是不可获得的
[0013]SB623细胞是通过用编码Notchl细胞内结构域的载体转染MSC从MSC衍生而来的。参见，例如，美国专利号7，682，825。先前的工作已显示由人MSC和从其衍生的SB623细胞产生的ECM在无添加的因子或血清的情况下有效地支持大鼠胚胎皮层细胞的生长和分化(29，也参见US2010/0310529，为了描述由MSC和SB623细胞产生的ECM的某些性质，将其公开内容通过引用整体并入本文)。
[0014]如上所述，仍然存在对这样的简单精确的体外系统的需要:所述体外系统建立具有神经源性和/或胶质生成活性的物质(例如，MSC及其衍生物例如SB623细胞)与神经细胞的复杂群体的相互作用的模型，并定量这样的物质的效力。
[0015]概述
[0016]本文 中提供了用于在最优化定量影响培养物中的不同神经细胞的生长和分化的因子的作用之能力的条件下，共培养MSC和/或其衍生物(例如，SB623细胞)与神经细胞群体的体外系统。
[0017]这些培养系统可用于提供用于测量物质(例如，MSC及其衍生物，例如SB623细胞、条件化培养基、多肽、有机化合物)对不同类型的神经细胞(例如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)的作用的定量功能测定。具体地，可鉴定和定量神经营养性、神经源性、胶质营养性和胶质生成性因子以及这类因子的来源。
[0018]通过使用本文中描述的测定，已鉴定了许多具有神经源性活性和胶质生成活性的物质。
[0019]因此，本公开内容提供了，除其它以外，下列实施方案。
[0020]1.一种用于测试促进神经发生的物质的方法，所述方法包括:
[0021](a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；
[0022](b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0023](c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0024](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0025](e)测量神经元的生长；
[0026]其中神经元的生长表明所述物质促进神经发生。
[0027]2.实施方案I的方法，其中所述MSC获自人。
[0028]3.实施方案I的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0029]4.实施方案I的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0030]5.实施方案I的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
[0031]6.实施方案I的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0032]7.实施方案6的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。[0033]8.实施方案I的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0034]9.实施方案I的方法，其中神经元的生长通过轴突生长物或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β -微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶的标志物的表达来测量。
[0035]10.实施方案I的方法，其中将神经元的生长与不存在所述物质的情况下神经元的生长相比较。
[0036]11.一种用于测试促进胶质生成的物质的方法，所述方法包括:
[0037](a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；
[0038](b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0039](c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0040](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0041](e)测量神经胶质细胞的生长；
[0042]其中神经胶质细胞的生长表明所述物质促进胶质生成。
[0043]12.实施方案11的方法，其中所述MSC获自人。
[0044]13.实施方案11的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0045]14.实施方案11的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0046]15.实施方案11的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
[0047]16.实施方案11的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0048]17.实施方案16的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进胶质生成。
[0049]18.实施方案11的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0050]19.实施方案11的方法，其中将神经胶质细胞的生长与不存在所述物质的情况下神经胶质细胞的生长相比较。
[0051]20.实施方案11的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。
[0052]21.实施方案20的方法，其中所述星形胶质细胞的生长通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast或谷氨酰胺合成酶的表达来测量。
[0053]22.实施方案11的方法，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞。
[0054]23.实施方案22的方法，其中所述少突胶质细胞的生长通过选自2’，3’ -环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来测量。
[0055]24.一种用于测试促进神经发生的物质的方法，所述方法包括:
[0056](a)在固体基底上培养细胞；其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代；
[0057](b)从基底除去细胞；
[0058](c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0059](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0060](e)测量神经元的生长；[0061]其中神经元的生长表明所述物质促进神经发生。
[0062]25.实施方案24的方法，其中所述MSC获自人。
[0063]26.实施方案24的方法,其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0064]27.实施方案24的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0065]28.实施方案24的方法，其中所述物质是化合物或多肽。[0066]29.实施方案24的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0067]30.实施方案29的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。
[0068]31.实施方案24的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0069]32.实施方案24的方法，其中神经元的生长通过轴突生长物或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β -微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶的标志物的表达来测量。
[0070]33.实施方案24的方法，其中将神经元的生长与不存在所述物质的情况下神经元的生长相比较。
[0071]34.一种用于测试促进胶质生成的物质的方法，所述方法包括:
[0072](a)在固体基底上培养细胞；其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代；
[0073](b)从基底除去细胞，以便由所述细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0074](C)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0075](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0076](e)测量神经胶质细胞的生长；
[0077]其中神经胶质细胞的生长表明所述物质促进胶质生成。
[0078]35.实施方案34的方法，其中所述MSC获自人。
[0079]36.实施方案34的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0080]37.实施方案34的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0081]38.实施方案34的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
[0082]39.实施方案34的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0083]40.实施方案34的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进胶质生成。
[0084]41.实施方案34的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0085]42.实施方案34的方法，其中将神经胶质细胞的生长与不存在所述物质的情况下神经胶质细胞的生长相比较。
[0086]43.实施方案34的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。
[0087]44.实施方案43的方法，其中所述星形胶质细胞的生长通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast或谷氨酰胺合成酶的表达来测量。
[0088]45.实施方案34的方法，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞。
[0089]46.实施方案45的方法，其中所述少突胶质细胞的生长通过选自2’，3’ -环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、Ol抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来测量。
[0090]47.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的生长的物质的方法，所述方法包括:
[0091](a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；
[0092](b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0093](c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0094](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0095](e)测量神经前体细胞的生长；
[0096]其中NPC的生长表明所述物质促进NPC的生长。 [0097]48.实施方案47的方法，其中所述MSC获自人。
[0098]49.实施方案47的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0099]50.实施方案47的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0100]51.实施方案47的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
[0101]52.实施方案47的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0102]53.实施方案52的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经前体细胞的生长。
[0103]54.实施方案47的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0104]55.实施方案47的方法，其中通过巢蛋白或S0X2的表达测量NPC的生长。
[0105]56.实施方案47的方法，其中将NPC的生长与不存在所述物质的情况下NPC的生长相比较。
[0106]57.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的生长的物质的方法，所述方法包括:
[0107](a)在固体基底上培养细胞，其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞(MSC)的后代；
[0108](b)从基底除去细胞，以便由所述细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0109](C)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0110](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0111](e)测量NPC的生长；
[0112]其中NPC的生长表明所述物质促进NPC的生长。
[0113]58.实施方案57的方法，其中所述MSC获自人。
[0114]59.实施方案57的方法,其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0115]60.实施方案57的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0116]61.实施方案57的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
[0117]62.实施方案57的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0118]63.实施方案62的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经前体细胞的生长。
[0119]64.实施方案57的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0120]65.实施方案57的方法，其中所述NPC的生长通过巢蛋白、Glast或S0X2的表达来测量。
[0121]66.实施方案57的方法，其中将NPC的生长与不存在所述物质的情况下NPC的生长相比较。
[0122]67.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的分化的物质的方法，所述方法包括:
[0123](a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；
[0124](b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0125](C)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0126](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0127](e)测量NPC的分化；
[0128]其中NPC的分化表明所述物质促进NPC的分化。
[0129]68.一种用于测试 促进神经前体细胞(NPC)的分化的物质的方法，所述方法包括:
[0130](a)在固体基底上培养细胞，其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞(MSC)的后代；
[0131](b)从基底除去细胞，以便由所述细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；
[0132](C)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；
[0133](d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和
[0134](e)测量NPC的分化；
[0135]其中NPC的分化表明所述物质促进NPC的分化。
[0136]69.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述MSC获自人。
[0137]70.实施方案67或68的任一个的方法,其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0138]71.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0139]72.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
[0140]73.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0141]74.实施方案73的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。
[0142]75.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0143]76.实施方案67或68的任一个的方法，其中将NPC的分化与不存在所述物质的情况下NPC的分化相比较。
[0144]77.实施方案67或68的任一个的方法，其中NPC的分化通过轴突生长物，或通过选自微管相关蛋白2 (MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、谷氨酰胺合成酶、GLAST谷氨酸转运蛋白、2’，3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来证明。
[0145]78.一种包含固体基底与沉积在其上的生物层的组合物，其中所述生物层是由如下(a)或(b)沉积的细胞外基质:
[0146](a)间充质干细胞(MSC)，或
[0147](b)已用核酸转染的MSC,其中所述核酸编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白。
[0148]79.实施方案78的组合物，其中所述MSC获自人。
[0149]80.实施方案78的组合物，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
[0150]81.实施方案78的组合物，其还包含胚胎皮层细胞。
[0151]82.实施方案81的组合物，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
[0152]83.实施方案81的组合物，其还包含测试物质。
[0153]84.实施方案83的组合物，其中所述测试物质是化合物或多肽。
[0154]85.实施方案83的组合物，其中所述测试物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。
[0155]86.实施方案83的组合物，其中所述测试物质是来自细胞培养物的条件化培养基。
[0156]87.一种用于测定物质对神经生成、神经发生、星形胶质细胞发生或少突胶质细胞发生的效应的试剂盒；所述试剂盒包括实施方案78-86的任一项的组合物。
[0157]88.实施方案87的试剂盒，其还包括一种或多种用于检测神经元或神经胶质标志分子的试剂。
[0158]89.实施方案88的试剂盒，其中所述检测是通过免疫组织化学。
[0159]90.实施方案89的试剂盒,其中所述试剂包括一种或多种抗体。
[0160]91.实施方案90的试剂盒,其中所述一种或多种抗体特异于选自如下的一种或多种抗原:微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β -微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast、谷氨酰胺合成酶、2’，3’_环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白。
[0161]92.实施方案88的试剂盒，其中所述检测是通过定量逆转录酶/聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
[0162]93.实施方案92的试剂盒，其中所述试剂包括一种或多种寡核苷酸引物或寡核苷酸探针。
[0163]94.实施方案93的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸引物或寡核苷酸探针特异性检测编码选自下列的蛋白质的核酸:微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast、谷氨酰胺合成酶、2’，3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓憐脂相关糖蛋白。[0164]附图概述
[0165]图1A和IB显示ECM涂覆的板上单独的大鼠神经细胞(表示为"N")或与MSC共培养的大鼠神经细胞(表示为〃M")的增殖的测量结果。图1A显示3个不同的时间点(共培养开始后第I天、第5天和第7天)的共培养物中的DAP1-染色的神经细胞(非-MSC)的细胞核的数目的测量。对于每一对条柱，最左边的条柱表示活神经细胞的数目，最右边的条柱表示死神经细胞的数目，如通过细胞核形态学评价的。图1B显示单独培养的(表示为〃N")或与MSC共培养的(表示为〃M")神经细胞以及在大鼠神经细胞不存在的情况下培养的MSC的细胞数目，如通过大鼠noggin基因的相对水平测定的。显示了两个时间点(第I天和第7天)的数据。
[0166]图2，图框A至E，显示在ECM涂覆的板上进行的大鼠神经细胞(N)的培养物和大鼠神经细胞与MSC (N+M)的共培养物中双皮质素(DCX)(图2A)、微管相关蛋白_2 (MAP2)(图2B)、巢蛋白(Nes)(图2C)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)(图2D)和2’，3’ -环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNP)(图2E)的mRNA的表达的时间过程。共培养物包含200个MSC/细胞。〃天数〃是指共培养开始后的天数。
[0167]图3显示定量PCR研究的结果，该结果表明大鼠E18皮层细胞中编码不同神经标志物的RNA的表达在生长于细胞外基质(ECM)上的共培养物中是MSC剂量依赖性的。在第5天评价了大鼠巢蛋白(rNes)、MAP2 (rMAP2)和CNPase (rCNPase)基因表达的MSC-剂量反应，在第7天评价了大鼠GFAP (rGFAP)和人GAP (huGAP)表达。在任何大鼠表达测定中未检测到来自单独的人MCS或SB623细胞的信号，并且在人GAP表达测定中未检测到来自大鼠细胞的信号。
[0168]图4显示通过qRT-PCR测定的，ECM涂覆的板上的大鼠神经细胞与MSC的共培养物中的不同标志物的 相对表达水平。大鼠标志物是巢蛋白(Nes)、CNPase (CNP)、双皮质素(DCX)、微管相关蛋白-2 (MAP2)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(ratGAP)。用于鉴定和定量培养物中的MSC的人标志物是甘油醛3-磷酸脱氢酶(huGAP)。在5天的共培养后测定巢蛋白和CNPase的表达；在7天的共培养后测定所有其它标志物。在最低MSC剂量(32个细胞/孔)时的水平被人为指定为表达水平为I。
[0169]图5显示MSC浓度对ECM涂覆的板上的共培养物的两个不同时期的CNPase mRNA表达水平的作用。通过qRT-PCR定量CNPasemRNA水平。将在特定的测定日(第5天或第7天)观察到的最高水平人为设定为相对表达水平为I。
[0170]图6显示在非附着条件下进行的大鼠神经细胞与MSC的共培养物中标志物表达的水平。还在无MSC但存在bFGF和EGF的情况下培养神经细胞作为对照。对于每一组条件，条柱从左至右表示大鼠巢蛋白(rNes)、大鼠微管相关蛋白_2(rMAP2)、大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质(rGFAP)、大鼠双皮质素(也0乂)、大鼠2’，3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶(rCNPase)、大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶(rGAP)和人甘油醛3-磷酸脱氢酶(huGAP)的表达水平。在bFGF/EGF存在的情况下神经标志基因表达水平被赋予等于I的值，除GFAP外的所有其他标志物相应地表达为其他值，GFAP在bFGF/EGF样品中被赋予等于0.1的值。
[0171]图7显示在不同附着条件下进行的大鼠神经细胞和MSC的共培养物中标志物表达的水平。〃ECM〃表示用SB623细胞衍生的细胞外基质涂覆的板上的共培养物。〃0rn/FN〃表示用鸟氨酸和纤连蛋白涂覆的板上的共培养物。"ULA〃表示Ultra Low Attachment板上的培养物。在ECM和Orn/FN板上，将神经细胞与MSC以10:1的比率(1.5xl04个细胞/cm2)共培养。在ULA板上，将神经细胞与MSC以2:1的比率(〃+MSC，5X〃)一起培养或在MSC不存在的情况下培养在补充有生长因子("FGF2/EGF")的培养基中。对于每一组条件，条柱从左至右表示大鼠巢蛋白(Nes)、大鼠2’，3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、大鼠双皮质素(DCX)和人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(huGAP)的表达水平。在培养或共培养5天(〃5d〃)后测试巢蛋白和CNPase水平；在7天(〃7d〃)时测定所有其它标志物。
[0172]图8显示肝素酶对神经细胞的巢蛋白mRNA的表达的作用。将大鼠皮层细胞培养在ECM涂覆的板上。在涂铺皮层细胞之前，ECM涂覆的板已用两个浓度的肝素酶I (0.5个单位/ml和1.5个单位/ml)或用肝素酶缓冲液(H-缓冲液〃)处理或未处理(〃无添加〃)。巢蛋白mRNA表达在培养开始后5天利用qRT-PCR来测定。未处理的ECM涂覆的板上培养的细胞中检测到的巢蛋白mRNA的量被人为地赋予等于I的相对表达水平。
[0173]图9A-9D显示通过qRT-PCR测定的、纯化的生长因子(EGF, BMP6, HB-EGF)和MSC条件化培养基(CM)对由在ECM涂覆的板上培养的神经细胞产生的编码不同神经标志物的mRNA的相对表达水平的作用。图9A显示对巢蛋白(神经前体细胞的标志物)的表达的作用。图9B显示对双皮质素(DCX)(新生神经元的标志物)的表达的作用。图9C显示对CNPase(少突胶质细胞的标志物)的表达的作用。图9D显示对GFAP (星形胶质细胞的标志物)的表达的作用。
[0174]图10显示抗-FGF2中和抗体对ECM涂覆的板上的神经细胞/MSC的共培养物中的神经细胞的巢蛋白表达的作用。将大鼠皮层细胞(5，000个细胞)本身(“无MSC”)单独培养或与200MSC—起(〃+MSC〃)共培养。另外的共培养样品还包含中和性抗-FGF2抗体(〃+MSC+bFMl〃)或非中和性抗-FGF2抗体(〃+MSC+bFM2〃)。在培养或共培养开始后5天测定巢蛋白表达。在MSC不存在的情况下培养的皮层细胞的巢蛋白表达水平被人为地赋予等于I的相对表达值。
[0175]图11显示MSC条件化培养基和FGF2被耗尽的MSC条件化培养基对培养的大鼠神经细胞的巢蛋白表达的作用。将大鼠皮层细胞在无其它添加("无添加")的情况下与MSC条件化培养基("CM")，与已通过免疫沉淀耗尽了 FGF2的MSC条件化培养基("FGF2被耗尽的CM")，与利用不与FGF2反应的对照抗体处理的MSC条件化培养基(〃IP_对照-CM") —起在ECM涂覆的板上进行培养。在培养开始后5天测定巢蛋白表达。在条件化培养基不存在的情况下培养的皮层细胞的巢蛋白表达水平被人为地赋予等于I的相对表达值。
[0176]图12显示由在200个间充质干细胞(〃+MSC，200个细胞〃)或来自间充质干细胞的条件化培养基的1:10稀释物("+CM，10%〃)存在的情况下在ECM涂覆的板上培养的神经细胞表达的编码巢蛋白(Nes)和神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)的mRNA的水平。在MSC或条件化培养基不存在("无添加")的情况下培养对照细胞。在培养开始后5天进行巢蛋白的测定；在培养开始后7天进行GFAP的测定。与MSC的共培养物中表达的每一种标志物的水平被人为地赋予等于I的相对表达值。[0177]图13显示在培养或共培养开始后7天测定的ECM涂覆的板上培养的大鼠皮层细胞中的GFAP mRNA的水平。将皮层细胞与MSC("MSC")共培养，在30ng/ml重组noggin蛋白存在的情况下与MSC共培养("MSC+noggin")，或在抗-BMP4抗体存在的情况下与MSC共培养("MSC+抗-BMP4")。将与MSC共培养物中表达的GFAP mRNA水平人为地赋予等于I的相对表达值。
[0178]图14显示ECM涂覆的板上大鼠神经细胞和MSC的共培养物中的人骨形态发生蛋白-4 (〃huBMP4〃)、人甘油醛3-磷酸脱氢酶("huGAP")、人成纤维细胞生长因子-2(〃huFGF2〃)和大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质("rGFAP")的mRNA表达水平。在共培养之前，用靶向人BMP-4序列的siRNA库(〃N+siBMP4_MSC〃)或对照非-BMP4-靶向的siRNA (〃N+siContr-MSC〃)转染MSC。还在MSC不存在(“单独的N”)的情况下单独地培养神经细胞。
[0179]详述
[0180]已经证明难以建立支持各种不同类型的神经细胞的生长和分化的体外培养条件。本发明人设计了其中神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞全都能够生长和分化的体外培养系统。本文中公开的培养系统从而第一次允许定量评价测试物质对神经细胞的生长和分化的作用。该系统包括在测试物质存在的情况下在细胞外基质上培养神经细胞(例如啮齿类动物胚胎皮层细胞)，随后分析神经细胞培养物的一种或多种标志分子的表达。这些测 定中使用的细胞外基质由如下细胞产生:(a)间充质干细胞，或(b)已用核酸转染的间充质干细胞，其中所述核酸编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白(例如，SB623细胞)。
[0181]该系统的不同方面促成其提供关于各种神经源性和胶质生成因子的效力的定量信息的能力。在一个方面，将神经细胞培养在由MSC或SB623细胞(通过用包含编码Notch细胞内结构域的序列的载体转染MSC而从MSC衍生的细胞)产生的细胞外基质上。在另一个方面，选择将神经细胞与测试物质共培养的时间的量来最优化待测定的标志物的检测和定量。测定前共培养的持续时间对于每一个标志物是独特的。例如，对于巢蛋白和CNPase的测量进行5天的共培养；对于GFAP、DCX和MAP2的测量进行7天的共培养。在另一个方面，最优化培养的细胞的浓度。例如，以1.5xl04个细胞/ml的浓度使用神经细胞；以0.5-1.5xl03个细胞/ml的浓度使用MSC和SB623细胞。
[0182]本文中公开的定量测定系统使用来自间充质细胞例如MSC及其衍生物(例如，SB623细胞)的ECM作为用于测试物质(例如，MSC或其衍生物SB623细胞、条件化培养基、生长因子、细胞因子)与神经细胞群体的共培养的生物基底，并且提供了有利于间充质细胞和神经细胞的生长的培养系统。这样的系统继而允许定量间充质细胞以及其它细胞和物质对不同类型的神经细胞的生长和分化的作用。
[0183]本文中描述的测定的有利方面包括下列事实:发育转变在生理条件下和整个生理时间过程中发生，而不是响应于异常物理条件例如附着或聚集而发生(参见神经球培养)。此外，待测定的细胞的发育期可容易地确定，因为发育不会在神经球的内部发生。最后，本文中公开的测定不需要外部生长因子；从而允许在该系统中定量这样的因子的作用。
[0184]通过使用该系统，本发明人已确定:间充质细胞ECM不仅支持神经细胞群(例如，胚胎皮层细胞)的生长，而且MSC或SB623细胞向在间充质细胞ECM上生长的神经细胞群体中的添加显著增强了所有神经谱系(例如，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的生长和分化。
[0185]与现有共培养系统相比较，低得多的间充质细胞对神经细胞的比率能够在本文中描述的基于ECM的共培养中诱导神经细胞的显著生长和分化。例如，本文中描述的测定系统的灵敏性足以检测约50个间充质细胞对5，000个神经细胞的作用。
[0186]本文中提供的是神经源性和胶质生成因子以及促进神经前体细胞的生长和分化的因子的定量测定。所述测定还可用于鉴定和定量这样的因子的来源，例如细胞培养物或条件化培养基。
[0187]为了进行测定，将MSC或SB623细胞(统称为〃间充质细胞〃)生长在容器中，例如组织培养皿，进行足以让细胞在容器表面上留下细胞外基质的时间。任何固体基底可用作在其上生长细胞的表面，只要其支持细胞的生长和让细胞产生细胞外基质。适当的基底包括塑料、玻璃或硝酸纤维素。此外，可用物质例如纤连蛋白或胶原或重建的基膜例如Matrigel?涂覆基底。
[0188]适当的基底的实例是塑料组织培养皿或培养瓶。可按需将细胞生长I天、2天、3天、I周、2周、I个月或其间任意时间间隔。关于由MSC和SB623细胞产生的ECM的其它详细内容，参见美国专利申请公布号2010/0310529，为了描述由MSC和SB623细胞(在该公布中称作"MASC的分化限制的后代〃)产生的ECM及其性质的目的，将其公开内容通过引用并入本文。
[0189]MSC可通过从骨髓样品选择附着细胞来获得。骨髓可商购获得(例如，来自Lonza, Walkersville, MD)或来自骨髓生物活检组织。间充质干细胞的其它来源包括例如脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘和蜕膜。MSC可获自任何动物，包括哺乳动物，并且包括人。
[0190]MSC的示例性公开内容提供于美国专利申请公布号2003/0003090; Prockop (1997)Science276:71-74 和 Jiang(2002)Nature418:41-49。用于分离和纯化 MSC 的方法可见于例如美国专利号 5，486，359; Pittenger 等人(1999) Science284:143-147和 Dezawa 等人(2001)Eur.J.Neurosc1.14:1771-1776。人 MSC 可商购获得(例如，Bioffhittaker, Walkersville, MD)或可通过例如骨髓穿刺，随后选择附着骨髓细胞而从供体获得。参见，例如，W02005/100552。
[0191]SB623细胞通过用包含编码Notch细胞内结构域(NI⑶)但不编码全长Notch蛋白的序列的载体转染MSC (以便转染的细胞表达外源NI⑶但不表达外源全长Notch蛋白)而从MSC产生。用于获得MSC和用于从MSC群体衍生SB623细胞的方法描述于例如美国专利号7，682，825和美国专利申请公布号2010/0266554中，为了描述MSC和SB623细胞以及获得这些细胞的方法，将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用并入。
[0192]在于基底上生长预定量的时间后，从基底除去MSC或SB623细胞，从而留下沉积在基底上的细胞外基质。从基底除去细胞的方法在本领域是公知的。在本文中公开的方法的实践中，必须足够温和地从基底除去细胞，以便由细胞产生的ECM保留在基底上。这样的方法包括例如利用非离子型去垢剂(例如，Triton X-100, NP40)和碱(例如NH4OH)的处理。关于其它内容参见下文中的"实施例"部分。
[0193]随后将含ECM基底用作用于神经细胞与一种或多种测试物质的共培养的基底，测定并定量测试物质对神经细胞的作用。可同时或以任一顺序将神经细胞和测试物质引入培养物。
[0194]可使用任何类型的神经细胞或神经细胞群体；这样的细胞在本领域是已知的。神经细胞群体的方便来源是啮齿类动物胚胎皮层细胞(例如，来自大鼠或小鼠)，其可商购获得(BrainBits, Springfield, IL)。在某些实施方案中，在神经前体细胞中富集神经细胞群体。
[0195]测试物质可以是任何化合物、大分子(例如，核酸或多肽)、细胞、细胞培养物、细胞级分或组织，或其组合。例如，生长因子和细胞因子、低分子量有机化合物、mRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、反义RNA分子、核酶、DNA分子、DNA或RNA类似物、蛋白质(例如，转录调控蛋白)、抗体(例如，中和性抗体)、酶(例如，核酸酶)、糖蛋白、聚糖、蛋白聚糖、细胞、细胞膜制剂、细胞培养物、来自细胞培养物的条件化培养基、亚细胞级分和组织切片或组织级分全都是适当的测试物质。测试物质还可包括电磁辐射例如X-射线、光(例如，紫外、红外)或声音(例如，亚声或超声辐射)。在某些实施方案中，蛋白质与与针对蛋白质的中和抗体的组合被用作测试物质。
[0196]天然存在的测试物质可包括由细胞合成和分泌的可溶性分子(例如，蛋白质)，以及由细胞合成、被转运至细胞表面，并且仍然嵌入细胞表面、分子的全部或部分暴露于细胞的外部的分子(例如，蛋白质)(即，表面分子、表面蛋白或表面糖蛋白)。
[0197]将神经细胞和测试物质共培养适当量的时间，如由本方法的实施者决定的。例如，共培养可进行I小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、I个月 或其间的任意时间间隔。
[0198]测试物质对神经细胞的作用通过测量神经细胞的一种或多种标志物的表达来测定。取决于选择的标志物，可能测定神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的形成。
[0199]在一个实施方案中，特定蛋白质(天然的或重组的)对神经发生或胶质生成的作用可通过将该蛋白质添加至在MSC或SB623ECM上生长的神经细胞的培养物、并且测定适当的神经元或神经胶质标志物来测定。任选地，低浓度(1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%或其间的任意值)的来自MSC或SB623细胞的条件化培养基也可包括在培养物中。例如，条件化培养基的加入可提供除了待测试的因子外的研究过程所需的另外的因子，从而允许评价多因子信号转导系统的一个组分的作用。
[0200]神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的分子和形态发生标志物在本领域是公知的；下列标志物被提供来作为实例。
[0201]神经前体细胞的标志物包括例如巢蛋白，谷基酸转运蛋白(GLAST)、3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-P⑶H,星形胶质细胞前体)、ephrin B2 (EfnB2)、Sox2、Pax6和musashi。在某些实施方案中，增殖能力也可用作神经前体细胞的标志物。增殖能力可以例如通过溴脱氧尿苷的掺入、羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记、K1-67的表达或增殖细胞核抗原(PCNA)的表达来测量。
[0202]神经元的标志物包括例如微管相关蛋白2 (MAP2)、β -微管蛋白同种型III (也称为β-1II微管蛋白和TuJ-1)、双皮质素(DCX)、神经丝蛋白质(例如，神经丝-M)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶(也称为烯醇化酶-2和Y烯醇化酶)。轴突生长物也可用作神经元发育的标志物。
[0203]其它神经元标志物列于下表中:
[0204]
【权利要求】
1.一种用于测试促进神经发生或胶质生成的物质的方法，所述方法包括: (a)在固体基底上培养间充质细胞； (b)从基底除去所述间充质细胞，以便由所述间充质细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上； (C)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞； (d)将物质添加至步骤(C)的培养物中；和 (e)测量神经元或神经胶质细胞的生长； 其中神经元的生长表明所述物质促进神经发生，神经胶质细胞的生长表明所述物质促进胶质生成。
2.用于测试促进神经前体细胞(NPC)的生长或分化的物质的方法，所述方法包括: (a)在固体基底上培养间充质细胞； (b)从基底除去所述间充质细胞，以便由所述间充质细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上； (C)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞； (d)将物质添加至步骤( C)的培养物中；和 (e)测量NPC的生长或分化； 其中NPC的生长表明所述物质促进NPC的生长，NPC的分化表明所述物质促进NPC的分化。
3.权利要求1或2的方法，其中所述间充质细胞选自: (a)间充质干细胞，和 (b)已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代。
4.权利要求1至3的任一项的方法，其中所述间充质细胞获自人。
5.权利要求1至4的任一项的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
6.权利要求的I至5任一项的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
7.权利要求1至6的任一项的方法，其中所述物质是化合物或多肽。
8.权利要求1至6的任一项的方法，其中所述物质是细胞、细胞培养物或来自细胞培养物的条件化培养基。
9.权利要求8的方法，其中所述细胞选自: (a)间充质干细胞，和 (b)已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代。
10.权利要求8或9的任一项的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生、胶质生成或NPC的生长或分化。
11.权利要求1或3至9的任一项的方法，其中神经元的生长通过轴突生长物或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β -微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶的标志物的表达来测量。
12.权利要求1或3至9的任一项的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞，并且星形胶质细胞的生长通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast或谷氨酰胺合成酶的表达来测量。
13.权利要求1或3至9的任一项的方法，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞，并且少突胶质细胞的生长通过选自2’，3’ -环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来测量。
14.权利要求1或3至13的任一项的方法，其中将神经元或神经胶质细胞的生长分别与不存在所述物质的情况下神经元或神经胶质细胞的生长相比较。
15.权利要求2至10的任一项的方法，其中NPC的生长通过巢蛋白、Glast或S0X2的表达来测量。
16.权利要求2至10的任一项的方法，其中NPC的分化通过轴突生长物，或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、谷氨酰胺合成酶、GLAST谷氨酸转运蛋白、2’，3’_环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来证明。
17.权利要求2至10，15或16的任一项的方法，其中将NPC的生长或分化分别与不存在所述物质的情况下NPC的生长或分化相比较。
18.—种包含固体基底与沉积在其上的生物层的组合物，其中所述生物层是由下列(a)或(b)沉积的细胞外基质: (a)间充质干细胞(MSC)，或 (b)已用核酸转染的MSC,其中所述核酸编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白。
19.权利要求18的组合物，其中所述MSC获自人。
20.权利要求18或19的任一项的组合物，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。
21.权利要求18至20的任一项的组合物，其还包含胚胎皮层细胞。
22.权利要求21的组合物，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。
23.权利要求18至22的任一项的组合物，其还包含测试物质。
24.权利要求23的组合物，其中所述测试物质是化合物或多肽。
25.权利要求23的组合物，其中所述测试物质是细胞、细胞培养物或来自细胞培养物的条件化培养基。
26.权利要求25的组合物，其中所述细胞选自: (a)间充质干细胞，和 (b)已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代。
27.一种用于测定物质对神经生成、神经发生、星形胶质细胞发生或少突胶质细胞发生的效应的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求18至26的任一项的组合物。
28.权利要求27的试剂盒，其还包括一种或多种用于检测神经元或神经胶质标志分子的试剂。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述检测是通过免疫组织化学或定量逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
30.权利要求28或29的任一项的试剂盒，其中所述试剂包括一种或多种特异于神经元或神经胶质标志分子的抗体，或一种或多种寡核苷酸引物或寡核苷酸探针。
31.权利要求28至30的任一项的试剂盒，其中所述神经元或神经胶质标志分子选自下列的一种或多种:微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJl)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast、谷氨酰胺合成酶、2’，3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、01抗原、04抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细 胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白。
【文档编号】C12N5/02GK103842498SQ201280048345
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年8月20日 优先权日:2011年8月19日
【发明者】I·艾兹曼, C·C·凯斯 申请人:桑比欧公司