专利名称：一种重组腺病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组腺病毒，具体是一种含有东亚钳蝎氯离子通道毒素(简称BmK CT)基因的重组腺病毒及其制备方法以及该重组腺病毒在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。
背景技术：
脑神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的一种恶性肿瘤，常规的临床治疗主要以 外科手术切除，放疗或者化疗为主，不能彻底治疗并且容易复发，治疗过程中对患者自身也 有很大的损伤。随着基因操作技术的发展，基因治疗得到了广泛的应用。腺病毒载体携带 特定抑癌基因在癌症治疗方面有很明显的优势。腺病毒最早在人体内发现，可以感染大多 数的哺乳动物细胞并且稳定表达目的蛋白，在正常的组织中通过免疫反应可以消除，而且 腺病毒基因组不会整合到宿主细胞的基因组中，E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒在哺乳动 物细胞内不能正常复制且不会产生致病蛋白，提高了腺病毒载体在基因治疗中的安全性。东亚钳蝎氯离子通道毒素(BmK CT)由35个氨基酸组成，含4对二硫键，与从以色 列蝎L. quinquestriatus中提取的小电导氯离子通道抑制剂蛋白的同源性在60%以上。本 课题组前期的研究表明，大肠杆菌表达和纯化的BmK CT蛋白可以通过抑制胶质瘤细胞上的 基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达，从而抑制了肿瘤细胞与 细胞外基质(ECM)的黏附和降解，降低了肿瘤细胞的迁移能力。如何使优化后的BmK CT基因导入靶细胞内并使其高效稳定表达是BmK CT用于神 经胶质瘤治疗所面临的关键环节。腺病毒载体是目前研究和临床中使用最广泛的具有高效 感染率和表达的基因表达载体，可在包装细胞中获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非 分裂期的细胞。并且，腺病毒载体因为其具有转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴度高和安 全的优点，是基因疫苗、基因治疗、组织工程等研究中重要的转基因病毒载体。因此，将优化 后的BmKCT基因整合到腺病毒基因组上包装纯化重组腺病毒是解决该问题的有效途径。目前，国内外已经有关于腺病毒载体连接特定基因在神经胶质瘤，恶性肿瘤，前列 腺癌，肝癌，食管癌等的报道，但尚未发现有重组腺病毒介导的蝎氯离子通道毒素基因治疗 神经胶质瘤的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有BmK CT基因的重组腺病毒；提供一种构建该重 组腺病毒的方法；以及该重组腺病毒在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。本发明提供的一种重组腺病毒，AdEasy-I-BmK CT,已于2009年12月9日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 3499。该腺病毒可以在被感染的宿主细胞内表达绿色荧光蛋白、东亚钳蝎氯离子通道毒 素，且其基因组缺失E1/E3区，不会整合到宿主细胞的基因组中。本发明提供的一种重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤
3
(1)利用偏爱密码子表合成能在哺乳动物细胞中高效表达的东亚钳蝎氯离子通道 毒素(BmK CT)基因，原始BmK CT基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 1，优化后的BmK CT基因 的核苷酸序列为SEQ ID No. 2 ；合成特异性引物上游5，-tt gat ate atg tgc ggc ccc tgc ttc_3，(见 SEQ ID No. 3)Tffif 5' -at ctc RaR tea gat acg gtt gca cag gc_3，( JAL SEQ ID No. 4)经PCR扩增获得蝎氯离子通道毒素基因，且分别在5’端和3’端加上Xho I 和Hind III酶切位点并连接到中间载体pShuttle-IRES-hrGFP-2中获得重组质粒 pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT ；(2)将重组质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT用Pme I酶切线性化后转化 含有腺病毒基因组PAdEasy-I的BJ5183细菌中发生同源重组，筛选出重组腺病毒基因组 PAdEasy-I-BmKCT后转化到XLlO Gold细菌中大量复制，将重组的腺病毒基因组酶切线性 化后转染AD293细胞，包装复制后获得重组腺病毒AdEasy-I-BmK CT ；(3)将步骤⑵获得的重组腺病毒AdEasy-I-BmK CT感染AD293细胞并在细胞内 大量扩增，待细胞全部出现病变时收集细胞，-SO0C /37°C反复冻融3-4次使细胞裂解，收 集裂解液，CsCl密度梯度离心，取中间层透析去除病毒液中CsCl，获得大量的重组腺病毒 AdEasy-I-BmK CT0体外实验使用不同剂量的病毒液感染C6细胞48小时后，利用流式细胞仪测定最 佳感染效率的剂量；同时用不同剂量不同时间点测量对C6细胞的毒性作用。在体实验利 用SD大鼠皮下C6胶质瘤模型，分别注射重组腺病毒，对照组腺病毒和PBS，统计大鼠瘤块大 小；冰冻切片荧光镜下检测GFP表达情况。本发明获得的重组腺病毒对神经胶质瘤具有抑 制作用，可用于制备治疗神经胶质瘤的药物。本发明提供的含氯离子通道毒素(BmK CT)基因的重组腺病毒可以抑制神经胶质 瘤细胞的增殖和扩散，腺病毒载体高效感染神经胶质瘤细胞并且作用时间长，使得蝎氯离 子通道毒素能稳定表达并作用于胶质瘤细胞，从而通过抑制胶质瘤细胞的生长和迁移来治 疗神经胶质瘤。
图IBmK CT基因的原始序列和优化后的可在哺乳动物细胞内高效表达的BmK CT
基因序列。图2从pUC57质粒克隆BmK CT基因并在其两端分别加上EcoRV和Xho I酶切位 点设计合成的引物序列。图3重组中间质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT的结构示意图。图 4 中间质粒 pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT 的鉴定。图5重组腺病毒鉴定。图6重组腺病毒基因组中BmK CT及其两端序列的测序报告，下划线为BmK CT基 因。图7脂质体转染腺病毒基因组后绿色荧光蛋白表达情况分析。图SCsCl密度梯度离心后病毒所在位置示意图。图9重组及空腺病毒对大鼠神经胶质瘤C6细胞感染效率的检测。
图10RT-PCR检测BmK CT基因在宿主细胞内的表达情况。图1IMTT法检测AdEasy-I-BmK CT和AdEasy-cGFP腺病毒抑制C6细胞的曲线。图12AdEasy_I-BmK CT和AdEasy-cGFP腺病毒在动物肿瘤模型中的抑制实验。
具体实施例方式实施例1重组腺病毒的构建(I)BmK CT基因的优化合成及鉴定和中间质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2_BmK CT的 构建及鉴定根据哺乳动物偏爱密码子表优化已知的BmK CT基因序列，交上海生工生物工程技 术有限公司人工合成并克隆在载体PUC57中，在该序列的两端分别加入Xho I和HindIII 酶切位点，以便酶切鉴定(图1)。将携带优化后的BmK CT基因的克隆载体pUC57转化大肠杆菌DH5a大量扩增，提 取质粒并进行PCR和酶切鉴定。设计引物，利用PCR方法在BmK CT基因两端加上EcoRV和Xho I酶切位点(图2)， 将PCR产物经酶切后回收；同时对中间载体pShuttle-IRES-hrGFP-2进行EcoR V和Xho I 双酶切，酶切产物回收；用酶切后的PCR产物和载体，按比例混合，用T4连接酶16°C过夜连 接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂含卡那霉素的LB固体培养基平板，37°C过夜培养，挑取 单菌落在LB液体培养基中大量培养，纯化质粒做PCR鉴定和酶切鉴定(图4)，图中A图为 构建的重组中间质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT的PCR检测电泳图。M =DNA标准分 子量；1 以重组质粒为模板扩增得到BmK CT基因产物，129bp ；2 以空载体为模板的PCR扩 增产物；B图为重组质粒EcoRV和Xho I酶切鉴定。(2)重组腺病毒pAdEasy-l-BmK CT基因组的构建及鉴定构建好的腺病毒中间载体pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT用Pme I酶切线性化 后酚氯仿抽提，纯化线性化的中间载体，转化携带有PAdEasy-I的BJ5183细菌，涂含卡那 霉素的LB固体培养基平板，37°C过夜培养，挑取单菌落在LB液体培养基培养，纯化重组的 pAdEasy-I-BmK CT并转化XLlOGold细菌大量培养，纯化质粒做PCR鉴定和酶切鉴定(图 5)，图中A图为重组腺病毒AdEasy-I-BmK CT基因组中外源基因BmK CT的PCR检测电泳 图。M =DNA标准分子量；1、2 以重组腺病毒基因组为模板检测到BmK CT基因的PCR产物， 129bp ；3 空腺病毒基因组为模板检测的PCR产物；4 以水为模板的PCR阴性对照；5 以重 组中间载体为模板的PCR扩增产物(阳性对照)；B图为Pac I酶切鉴定。并测序证实构建 成功(图6)。(3)重组腺病毒的包装，大量扩增和纯化用限制性内切酶Pac I将pAdEasy-l-BmK CT酶切线形化后，酚氯仿抽提，无水乙 醇沉淀，溶解到40 μ 1无菌水中备用。培养AD293细胞，待AD293细胞有80% -90%以上汇 合时，将线性化的pAdEasy-l-BmK CT加入到等量的脂质体Lipofectamine2000中，37°C孵 育5-6小时，转染AD293细胞，转染12小时后换上新鲜配置的细胞培养基(含有15% FBS 的DMEM细胞培养液)。转染3天后荧光显微镜下观察，可以看到有部分细胞内表达绿色荧 光(图7A)，8天后观察到表达绿色荧光的细胞明显增多(图7B)，15天后观察到成堆的细 胞表达绿色荧光(图7C)，待绿色荧光达到95%以上时收集细胞。-80°C /37°C反复冻融4次，5500rpm离心收集上清(含重组腺病毒)。将上清侵染3瓶(75cm2)AD293细胞扩增腺 病毒，4天后观察到细胞葡萄串样聚集并开始脱落且绿色荧光在95%以上时(图7D)，收集 细胞，同上处理后侵染30瓶(75cm2)AD293细胞大量扩增，3天后观察细胞状态如图5D时， 600g离心收集细胞后，收集上清，4°C保存，沉淀中加入15ml PBS, -80°C /37°C反复冻融4 次，6000rpm离心5分钟收集上清，氯化铯密度梯度35000rpm离心(图8)，1小时后继续吸 取中间病毒层氯化铯密度梯度35000rpm离心2小时，吸取中间层，用IL无菌透析液(1M MgCl2, Iml ； 1MPH7. 4Tric_HCl，IOml ；甘油，IOOml ；去离子水补足 1L)4°C透析 24 小时，重复 透析2次，分装重组腺病毒液-80°C保存。实施例2重组腺病毒抑制神经胶质瘤细胞增殖和扩散的实验(1)重组腺病毒的浓度测定及纯度鉴定腺病毒浓度测定采用光密度测定方法，设空白管为PBS 960 μ 1，10% SDS 40 μ 1 ； 测定管为PBS 860 μ 1，重组病毒液100 μ 1，10% SDS 40 μ 1。56°C孵育1小时后，离心取上 清。紫外分光光度计测定0D260值和0D280值，病毒滴度=A260X稀释倍数X IO12 vp/ml ； A260/A280比值反映了腺病毒纯度，> 1. 3说明腺病毒纯度较高。本实验包装的病毒测定 A260 = 0. 246，A280 = 0. 170 ；病毒滴度为 2. 46 X IO12, A260/A280 = 1. 45，纯度较高。重组腺病毒的鉴定采用提取纯化后的Ad-BmK CT病毒DNA和对照组AchcGFP病毒 DNA为模板，进行PCR鉴定。(2)体外对大鼠神经胶质瘤C6细胞的感染效率及外源蛋白表达的测定利用流式细胞仪和荧光显微镜检测10，20，50，100M0I重组腺病毒和对照组腺病 毒对C6细胞的感染效率。具体方法为10瓶(25cm2) C6细胞培养至70%汇合时更换新鲜培 养基，且随机5瓶分别加入0，10，20，50，100M0I重组腺病毒AdEasy-I-BmK CT,另外5瓶分 别加入0，10，20，50，100M0I对照组腺病毒AdEasy-cGFP ；12小时后更换新鲜培养基继续培 养至48小时荧光显微镜观察；收集细胞，PBS洗涤细胞2遍后流式检测；重复3遍统计感染 效率数据(见图9)。图中=A :10-100M0I AdEasy-I-BmK CT腺病毒感染C6细胞48小时的流 式评价；B :10-100M0I AdEasy-cGFP腺病毒感染C6细胞48小时的流式评价；C 重复感染测 定3次后标准差比较，#为最佳感染效率(AdEasy-I-BmK CT 92. 4士 1. 85% ；AdEasy-cGFP 91. 37士 1. 68% ) ；D 荧光镜下观察到的最佳感染效率(上面为AdEasy-I-BmK CT感染，下 面为AdEasy-cGFP感染)；E F =DAPI染核观察在50M0I AdEasy-cGFP感染C6细胞148小时 的感染效率。利用RT-PCR检测重组腺病毒在AD293细胞表达BmK CT的情况，用50M0I重组腺病 毒AdEasy-I-BmK CT和对照组腺病毒Ad-cGFP分别感染2瓶(25cm2) AD293细胞，48小时后 收集细胞，提取AD293细胞总RNA反转录cDNA，以cDNA为模板进行PCR鉴定(图10A)。同 时利用RT-PCR检测50M0I重组腺病毒不同时间点在C6细胞中的表达量(图10B)。图IOA 检测BmK CT在重组腺病毒感染AD293细胞后的表达情况。1 :50M0I AdEasy-cGFP感染细 胞48小时后，提取RNA反转录cDNA为模板PCR产物；2 :50M0I AdEasy-I-BmKCT感染细胞 48小时后，提取RNA反转录cDNA为模板PCR产物；3 正常AD293细胞提取RNA反转录cDNA 为模板PCR的产物(阴性对照)；4 重组中间载体为模板PCR的产物(阳性对照)；5 以水 为模板的空白对照；6 :DNA标准分子量；7-11 模板对应1-5PCR检测β-actin基因表达情 况；图IOB 检测50M0I AdEasy-I-BmK CT感染C6细胞后不同时间点表达量。1 β -actin空白对照；2-7 重组腺病毒感染12-72小时间隔12小时PCR检测3 -actin ；8 :DNA标准分 子量；9-14 对应2-7模板PCR检测BmK CT基因；15 空白对照。(3)体外检测重组腺病毒抑制C6细胞增殖的研究见图11，MTT 法检测 AdEasy-l-BmK CT 和 AdEasy-cGFP 腺病毒感染 C6 细胞 48 小时(A)，72小时(B)，96小时(C)在不同腺病毒浓度作用下的的抑制率曲线(半抑制率 IC50 在 48 小时 AdEasy-l-BmK CT 50M0I, AdEasy-cGFP 200M0I ；72 小时 AdEasy-l-BmK CT 25M0I, AdEasy-cGFP 80M0I ；AdEasy-l-BmK CT 25M0I, AdEasy-cGFP 50M0I)以及 48 小时 AdEasy-l-BmK CT半抑制率的剂量50M0I不同时间点的抑制率曲线⑶。(4)体内检测重组腺病毒在荷瘤鼠内抑制C6肿瘤生长的研究利用SD大鼠构建了腋附侧荷C6胶质瘤动物模型，用以检测重组腺病毒在体治疗 效果。当模型鼠的肿瘤块体积长到约为2cm3，随机分为3组，每组6只，分别在瘤块原位皮 下注射了不同剂量的AdEasy-l-BmK CT，AdEasy-cGFP和PBS，4天后测量瘤块体积，做体 积-时间、抑制率-时间依赖性曲线(图12)。图中A为注射病毒后时间-瘤块体积依赖 性曲线，由于自身免疫，瘤块体积整体趋向消减，但在4天可以看出AdEasy-l-BmK CT治疗 组相比AdEasy-cGFP治疗组和PBS对照组瘤块体积消减幅度较大；B为注射病毒后时间-抑 制率曲线，显示出在4天AdEasy-l-BmK CT对瘤块体积的抑制率达到50%。SEQUENCE LISTING<110>山西大学<120> 一种重组腺病毒及其制备方法和应用<130〉.<160>4<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>111<212>DNA<213>Buthus matensii Karsch<400>1atgtgtgggc cttgctttac aacggatgct aatatggcaa ggaaatgtag ggaatgttgc 60ggaggtattg gaaaatgctt tggcccacaa tgtctgtgta accgtatatg a111<210>2<211>111<212>DNA<213>Aritifical<400>2atgtgcggcc cctgcttcac caccgacgcc aacatggccc gcaagtgccg cgagtgctgc 60ggcggcatcg gcaagtgctt cggcccccag tgcctgtgca accgtatctg a111<210>3<211>26<212>DNA
<213>Aritifical
<400>3
ttgatatcat gtgcggcccc tgcttc26
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>Aritifical
<400>4
atctcgagtc agatacggtt gcacaggc28
8
权利要求
一种能在哺乳动物细胞中高效表达的东亚钳蝎氯离子通道毒素(BmK CT)的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID No.2。
2.一种重组腺病毒，含有核苷酸序列为SEQ ID No. 2的基因。
3.如权利要求2的重组腺病毒，其特征在于保藏号CGMCCNo. 3499。
4.如权利要求3所述的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤(1)利用偏爱密码子表合成能在哺乳动物细胞中高效表达的东亚钳蝎氯离子通道毒素 基因(BmK CT)；合成特异性引物上游-tt gat ate atg tgc ggc ccc tgc ttc_3'-at ctc gag tea gat acg gtt gca cag gc_3，经PCR扩增获得蝎氯离子通道毒素基因，且分别在5’端和3’端加上Xho I 和Hind III酶切位点并连接到中间载体pShuttle-IRES-hrGFP-2中获得重组质粒 pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT ；(2)将重组质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT用Pme I酶切线性化后转化含 有腺病毒基因组pAdEasy-Ι的BJ5183细菌中发生同源重组，筛选出重组腺病毒基因组 PAdEasy-I-BmKCT后转化到XLlO Gold细菌中大量复制，将重组的腺病毒基因组酶切线性 化后转染AD293细胞，包装复制后获得重组腺病毒AdEasy-I-BmK CT ；(3)将步骤(2)获得的重组腺病毒AdEasy-I-BmKCT感染AD293细胞并在细胞内大 量扩增，待细胞全部出现病变时收集细胞，-SO0C /37°C反复冻融3-4次使细胞裂解，收集 裂解液，CsCl密度梯度离心，取中间层透析去除病毒液中CsCl，获得大量的重组腺病毒 AdEasy-I-BmK CT0
5.如权利要求2或3所述的重组腺病毒在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。
全文摘要
利用哺乳动物偏爱密码子表优化并合成东亚钳蝎氯离子通道毒素(BmK CT)基因，将其克隆到腺病毒中间载体中获得含该毒素基因的重组质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT，将该重组质粒转化到含有腺病毒骨架基因组的大肠杆菌BJ5183中，同源重组后获得pAdEasy-1-BmK CT，重组的腺病毒基因组转染到AD293细胞中，经包装和纯化获得含东亚钳蝎氯离子通道毒素基因的重组腺病毒颗粒AdEasy-1-BmK CT。氯离子通道毒素对神经胶质瘤有抑制作用，以腺病毒为载体可以提高对神经胶质瘤的感染效率和作用时间，该重组腺病毒作为药物在神经胶质瘤的基因治疗方面有良好的应用前景。
文档编号C12N15/12GK101921769SQ201010033368
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月11日 优先权日2010年1月11日
发明者付月君, 张志云, 杜军, 杨仁佳, 柴宝峰, 梁爱华, 王伟, 申泉 申请人:山西大学