筛选植物的在植物中诱导孤雌生殖的遗传元件的方法
【专利摘要】本发明公开了用于产生缺少由有性方式获得的胚的植物群体的组合物和方法。组合物包括编码多核苷酸的抑制盒和导致孤雌生殖的启动子。本发明还提供了用于抑制自繁殖植物中的有性繁殖的孤雌生殖遗传元件。方法包括利用母本胚缺陷隐性突变，所述突变随后作为不育自交保持系统得以保持，从而允许产生对于所述隐性突变等位基因而言是纯合的、但在转基因上是互补的群体。方法还包括利用通过卵细胞特异性启动子表达的毒素基因，从而产生不能通过所述雌配子传递的显性无胚表型。然后将用驱动用于鉴定转基因种子的所述解毒剂、花粉消融PTU以及种子颜色标记的卵细胞启动子转化所得的半合子植物。本发明涉及产生50％雌性可育的植物，所述植物的种子在下一代生长时将产生具有50％可存活且为转基因的种子，和50％不能存活且为无胚种子的植物。
【专利说明】筛选植物的在植物中诱导孤雌生殖的遗传元件的方法
【技术领域】
[0001]本公开涉及植物分子生物学领域，更具体地讲涉及植物雌性繁殖生物学、改变植物雌性繁殖生物学以及筛选改变的生殖机制性能的方法。
【背景技术】
[0002]单性生殖是指无性繁殖，其在不受精的情况下导致种子的产生、得到在遗传上与母株相同的后代(Koltunow, et al.， (1995) Plant Phys1l.108:1345-1352 (Koltunow 等人，1995 年，《植物生理学》，第 108 卷，第 1345-1352 页)；Ravi, et al.，(2008)Nature451:1121-4 (Ravi等人，2008年，《自然》，第451卷，第1121-1124页))。它是一个绕开雌性减数分裂和有性生殖来产生与母本相同的胚的繁殖过程。单性生殖增大了开发优良基因组合的可能性，并有利于所需性状的快速掺入。单性生殖不仅提供繁殖保证，而且避免了后代的杂合性丢失，因为卵细胞保持了亲代的基因型。因此，单性生殖避免了由于近亲交配造成的活力丧失效应，并由于杂种优势的影响可能另外赋予一些优点。
[0003]在物种水平上，单性生殖的发生率不足物种的1%。单性生殖出现在多个野生物种和少数农艺上重要的物种(例如柑桔属和芒果)中，但未出现在任何主要的谷类作物中(Eckhardt, (2003) The Plant Celll5:1449-01 (Eckhardt，2003 年，《植物细胞》，第 15 卷，第1449-01页))。单性生殖的一种形式是不定胚生殖，其中胚由胚珠内位于胚囊外部的体细胞组织直接形成。不定胚生殖通常与正常的有性繁殖平行出现。单性生殖的第二种形式是二倍体孢子生殖，其取代了有性繁殖。在二倍体孢子生殖中，形成了未减数分裂的卵细胞，其随后经历称为孤雌生殖(不经过受精的胚发生过程)的过程而形成胚。单性生殖的第三种形式是无孢子生殖，其与不定胚生殖类似地在有性胚囊外部的组织中发生。无孢子生殖涉及形成无性的未减数分裂的胚囊，其与二倍体孢子生殖类似地经历孤雌生殖而形成单性生殖胚。单性生殖的所有三种形式都依赖于不经过受精而生成胚(孤雌生殖)。因为其提供了对所需基因型的固定和无限增殖的保证，所以工程化该能力以将无性系种子培育成作物(尤其是谷物)引起了极大关注(Spillane, et al., (2001)Nat.B1technol.22:687-91 (Spillane等人，2001年，《自然生物技术》，第22卷，第687-691页))。
[0004]在商业化植物品系中将单性生殖工程化的分子方法是非常可取的。对基因转录的调控在种子特异性发育程序的表达中具有至关重要的作用。因此，早期胚珠发育期间在有性繁殖途径和单性生殖过程之间的趋异点处分子开关的调控，是在其处可对类单性生殖性状加以控制的点。
[0005]本公开描述了一种维持缺乏由有性方式获得的胚的植物/种子大群体的方式。这可以用于生成针对诱导孤雌生殖的遗传元件的筛选群体。此外，一旦鉴定出孤雌生殖遗传元件，便可使用该相同方法来预防自繁殖植物中的有性繁殖。
【发明内容】
[0006]存在两种不同但类似的方法。第一种方法利用母本胚缺陷(胚致死)隐性突变，该包标记，其用于允许将保持系群体从所产生言是纯合的群体，但由于半合子状态的构建中应当分离成1: 1的存活的转基因(八八/
户的孤雌生殖的遗传元件。此外，所述系统之解毒剂构建体的自繁殖杂交体(不丧失杂能包括:隐性胚致死突变/卵细胞消融品分消融转基因、种子颜色标记和(自繁殖植
电雄性不育品系鉴定不依赖受精的种子形二胚发生的带激活标签的体细胞组织(根)亭人，2002年，《植物杂志》，第30卷，第:224-235 0^叩等人，2009年，《细胞研究》，含鉴定产生种子中的体细胞胚发生的基因。7'法。这些方法描述了产生大量无胚种子的。这些方法的一个优 点是将不阻止胚乳受[0013]图3是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，显示出位于正常发育的中央细胞中的7-8个胚乳核。没有存在接合子或胚(红色)的迹象，也没有存在任何助细胞(绿色)的迹象。可将胚乳描述为在不存在胚的情况下发育。
[0014]图4是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其具有接合子(红色)和宿存助细胞(绿色)的残迹，其中接合子和宿存助细胞均显示出正在凝聚和解体。中央细胞显示为不健全的并处于解体的早期阶段(如通过中央细胞的空泡形成增多所指示)。
[0015]图5是在受精将要开始前2个未受精的拟南芥胚囊的荧光图像。左边的胚囊具有中央细胞(青色)，该中央细胞具有2个胚乳核和2个助细胞(黄色)，但缺少卵(红色)。右边的胚囊具有中央细胞(青色)，该中央细胞具有单个初生胚乳核，但缺少助细胞(黄色)和卵(红色)。
[0016]图6是受精的拟南芥胚囊的荧光图像和微分干涉相差(DIC)荧光重叠图像。中央细胞(青色)具有单个胚乳核和I个助细胞(黄色)，但缺少卵(箭头)。
[0017]图7是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其具有位于正常发育的中央细胞中的4个胚乳核。仅存在非常弱的红色荧光信号(箭头)，其指示胚或接合子的残迹的存在。宿存助细胞(绿色)正在解体。胚乳正在不存在胚的情况下发育。
[0018]图8是具有良好发育的胚乳的2个拟南芥胚囊的荧光图像。左边的胚囊在其中央细胞(青色)中具有多个胚乳核，并且在其珠孔端处(箭头)是胚或接合子(红色)的残迹。在正常条件下，该胚在心形阶段应当发育地完全得多。右边的较小胚囊具有多个胚乳核(青色)，但缺少胚(箭头)。到该最后阶段为止，助细胞自然地降解。
[0019]图9至11示出了来自种子的保持无胚群体的种子。
[0020]图9是对无胚条件进行分离的拟南芥种子的宽场显微图。在该取样中，较亮的种子是饱满的，并且包含胚。较暗的种子是皱缩的，并且缺少胚。无胚种子已明显发育，与在不存在胚的情况下的明显胚乳发育一致。
[0021]图10是与图A相同的样品视场的宽场荧光显微图。从饱满的含胚种子观察到亮红色荧光。从皱缩的无胚种子观察到极少的荧光或未观察到荧光。
[0022]图11示出了被设计用于筛选孤雌生殖的库构建体的一个预想实施例的组分。在TDNA骨架内，启动子例如AT DDlPRO(反足细胞启动子)将驱动来自边界在3’端处(此处为终止子)的单性生殖遗传来源的cDNA或gDNA片段。独特于保持系构建体的种子颜色标记的种子颜色标记也在TDNA边界内。
[0023]图12和13示出了筛选孤雌生殖cDNA群体，以及在筛选群体中对孤雌生殖胚进行预测性鉴定的方法。
[0024]图12示出了由反足细胞发育的发绿色荧光的孤雌生殖胚。生成了预测性无红色荧光的发绿色荧光的种子，随后在高通量筛选系统例如得自Un1n B1metrica公司的复杂对象参数分析仪和分选机(Complex Object Parameter Analyzer and Sorter, COPAS)中进行鉴定。
[0025]图13示出了在COPAS上分析的约15，000个无胚/保持系群体种子。数据在对数标度上朝向红色荧光偏移。绿色多边形和单个数据点预测性地展示了在限定的挑选标准内对发绿色荧光的包含孤雌生殖胚的种子的鉴定。
[0026]图14图示了用于PHP47029/PHP50940 (无胚品系)植物的超转化的载体PHP57122。在农杆菌(Agrobacterium)转化之前，用来自异源来源的cDNA取代ATTR1//CAM/CCDB/ATTR2。所得的TDNA在反足细胞中驱动来自AT-DD1PR0的cDNA表达，并在胚中驱动来自KTI3PR0的AC-GFPl表达。
[0027]图15示出了在使用旨在筛选反足细胞孤雌生殖的cDNA表达库进行转化之后，在Un1n B1metrica的复杂对象参数分析仪和分选机(COPAS)上分选的PHP47029/PHP50940(无胚品系)成熟种子。X轴=绿色荧光；￥轴=红色荧光；蓝色=单个数据点，红色=两个数据点，绿色=多于两个数据点。可以看到数据点尾部朝向右方偏移，其中数据点尾部代表由于使用cDNA表达库进行了转化而具有红色和绿色荧光的种子。多边形是选择用于分选命中点的区域；在COPAS上进行筛选期间，在该屏幕截图中选择了六个推定的命中点。
[0028]图16示出了在使用旨在筛选反足细胞孤雌生殖的cDNA表达库进行转化之后，在Un1n B1metrica的复杂对象参数分析仪和分选机(COPAS)上分选的PHP47029/PHP50940(无胚品系)成熟种子的六个推定命中点的PCR结果。使用在反足细胞孤雌生殖筛选载体PHP57122中cDNA插入位点旁侧的引物对粗略的种子分离物执行巢式PCR。将PCR产物置于I %琼脂糖凝胶上于TAE中运行，并用溴化乙锭染色。从7个推定命中点中的3个点观察到了常见的1.7-1.9kb条带。
[0029]发明详沭
[0030]下文将参照附图更完整地描述本发明，其中附图示出了本发明的一些但并非全部实施例。事实上，这些公开内容可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。
[0031]借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
[0032]1.概沭
[0033]提供了防止在植物胚珠中形成有性胚并使用该状态以鉴定和促进无性胚形成(孤雌生殖)的方法和组合物。
[0034] 可使用各种方法来测定向胚细胞样状态的这种转化。例如，卵细胞优选启动子可以可操作地连接到标记。此类报道基因构建体在大多数胚珠植物细胞中将是无活性的，但报道基因构建体在胚细胞样状态形成时将变得有活性。胚细胞优选启动子可用于检测胚细胞样转录状态，所述胚细胞优选启动子包括例如difl (决定性不育基因1)45下调的拟南芥(Arabidopsis thaliana)启动子(AT-DD45PR0 ；SEQ ID NO:10)和 EASE 启动子(卵器优选增强子启动子；SEQ ID NO:19)、KTI3 启动子(Perez-Grau and Goldberg, (1989)Plant Celll:1095-1109 (Perez-Grau 和 Goldberg, 1989 年，《植物细胞》，第 I 卷，第 1095-1109 页))。另参见 Yang，et al.，(2005) Plant Phys1logyl39:1421-1432 (Yang 等人，2005 年，《植物生理学》，第139卷，第1421-1432页)。另参见与本文同时提交且其全文以引用方式并入本文的名称为 “Ovule Specific Promoters and Methods of Their Use” (胚珠特异性启动子及其应用方法）的美国临时专利申请序列号_。当利用此类可操作地连接到适当标记的
胚细胞优选启动子时，可通过测定标记在胚珠细胞中的表达来测定胚样转录状态。以该方 式，可测定在植物胚珠的组织（包括适合于孤雌生殖的任何组织和子结构）中的胚细胞样 状态。
[0035]可监测另外的雌配子体特异性标记基因，以测定卵/胚细胞样状态，所述基因包 括任何雌配子体优选表达基因，例如AT1G18770(MYB98)、AT1G26795 (与自交不亲和性蛋白 相关）、AT2G20070、at4g25530(同源盒蛋白，fwa)和at5g40260 (结瘤素mtN3家族蛋白）。 参见例如 Koszegi, et al.，(2011)Plant Journal67 :280_291 (Koszegi 等人，2011 年，《植物 杂志》，第67卷，第280-291页），该文献以引用方式并入本文。
[0036]在另一个实施例中，卵细胞样状态可通过类似于接合子细胞形态的细胞形态发育 指示，值得注意的是致密细胞质的极性分布占据了细胞容积的一大部分，且细胞核位于细 胞的与大液泡相对的致密细胞质顶端处，而大液泡占据细胞内的中间至基部位置。一个实 施例将包括与尺寸为大约26 y m高X 15 y m宽的天然接合子细胞类似的拟南芥细胞。此类 形态学实施例是分子决定因素的补充，并且不是独立于其他决定因素的胚细胞样状态的诊 断因素。
[0037]在另外的其他实施例中，可表征胚细胞样状态并测定其在胚囊外部的组织和子结 构中的胚样结构的发育，包括在适合于孤雌生殖的任何组织和子结构中此类结构的形成。 胚样状态可通过显示出胚的形态学发育状态的细胞的邻接分群来表征。胚样状态的形态学 特征可包括通常有液泡的细胞变为细胞质稠密的细胞，或等径细胞变为伸长的以及卵形或 接合子形的。暗示胚/接合子样状态的其他细胞学特征可包括细胞极性的变化，“顶点”变 宽，而“基部”变细且逐渐变小。其他特征可包括大部分的细胞质占据顶端位置，而大液泡占 据细胞内的中间至基部位置。该接合子样细胞的细胞核将占据细胞内的顶端位置。在拟南 芥的例子中，形态学状态将是卵、接合子、原胚、球形或心形胚、鱼雷胚、手杖胚和卷曲子叶。 胚柄或子叶（一个或多个）的发育将是另一个形态学实施例。此类结构也可以表达分子标 记，诸如AT-DD45直到早期球形阶段的表达。晚期球形阶段直到成熟，胚样结构可表达KTI3 报道基因或其他胚特异性标记表达。
[0038]在具体的实施例中，“卵/接合子/胚细胞样状态”可发展为产生孤雌生殖或引发 胚生殖。此类方法和组合物在本文的其他地方进一步详细讨论。在不定胚生殖（孢子体单 性生殖）中，胚由胚珠内位于胚囊外部的体细胞组织直接形成。换句话讲，胚不由配子体， 而是例如由珠心和/或珠被组织形成。在不完全胚生殖中，胚发育是不完全的。在一些实 施例中，这可能表明缺少胚柄。在其他实施例中，这可能表明停留在成熟前的胚发育阶段。 在另外的其他实施例中，这可能表明缺少球状头部、子叶或其他胚器官。
[0039]表1
[0040]
【权利要求】
1.一种用于生成缺少由具有繁殖能力的有性方式获得的胚的大型种子群体的方法，包括: a)用包含三个部分的第一转基因盒转化第一植物，所述三个部分为:1)表达驱动同源解毒剂的启动子的卵细胞， ?)花粉消融PTU iii)种子选择标记； b)用第二表达盒转化所述植物，其中所述第二表达盒包含编码通过卵细胞特异性启动子表达的毒素基因的核酸分子，生成显性半合子无胚表型，从而产生对于所述毒素而言是纯合的但对于能育性而言是半合子的植物群体；以及 c)使来自用所述第二盒转化的所述植物的所述种子生长，产生其种子的50%存活并且所述第一和第二表达盒为转基因的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一表达盒包含编码同源解毒剂的核酸分子，其中所述解毒剂选自:SEQ ID NO:49或其活性变体或片段。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一表达盒包含编码含有荧光团的种子颜色标记的核酸分子，所述荧光团选自:DS-RED、ZS-GREEN、ZS-YELLOW、AC-GFP, AM-CYAN和AM-CYANl、AC-GFP、eGFP、eCFP、eYFP、eBFP、“水果”荧光蛋白(UC 系统);tagRFP、tagBFP、mKate、mKate2、 tagYFP、tagCFP、tagGFP、TurboGFP2> TurboYFP> TurboRFP> TurboFP602>TurboFP635> TurboFP650> NirFP 或 Cerulean。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一表达盒包含花粉消融植物转录单元(PTU)，其具有的启动子选自包含下列的组:SEQ IDNO:53、54、55和56。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一表达盒还包含可操作地连接到编码同源解毒剂多肽的所述核酸分子的组织特异性启动子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组织特异性启动子是卵细胞组织特异性启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述卵细胞组织特异性启动子选自包含下列的组:SEQ ID NO:1-9、11、13、15、17、19-21、31 和 33。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第二盒还包含可操作地连接到毒素基因的卵细胞组织特异性启动子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二盒启动子选自:SEQID N0:53、54、55和56。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述植物用孤雌生殖PTU转化，并且移除所述毒素和/或解毒剂互补构建体，以允许产生自繁殖植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述双子叶植物为芸苔属物种(Brassicasp.)、向日葵、棉花、低芥酸油菜(canola)、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis sp.)或苜猜。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述自繁殖植物是大豆。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述自繁殖植物是单子叶植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。
16.—种通过权利要求1-15中任一项所述的方法产生的自繁殖植物。
17.—种权利要求 16所述的自繁殖植物的种子。
【文档编号】C12N15/82GK104039967SQ201280066347
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年4月12日 优先权日:2012年1月6日
【发明者】A.M.西甘, S.J.拉维特 申请人:先锋高级育种国际公司