专利名称：重组鲤鱼PKCδ基因、蛋白及其制备与检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组鲤鱼PKC S基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。
背景技术：
蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)与许多细胞生物效应有关，在细胞信息传递中具有重要作用。由于P K C是促癌剂佛波酯在细胞内的高亲和力受体，因而在肿瘤发生发展中的作用引起人们重视，已发现多种肿瘤组织中PKC含量高于正常。到目前为止，在哺乳动物组织内已确定10种PKC亚类(8-3)，分为A、B、C三组，A组称为典型或传统的 PKC (classicalor conventional PKC，CPKC),包括 a、0 1、II 和Y亚类,其中@1和P II有高度的同源性,是由同一 mRNA的不同剪接而成，A组成员分子量在 76_78kDa。B 组为新型 PKC (atypical PKC，aPKC)，包括 S、e、n (L)和 0 亚类，分子量在77_83kDa。C组为非典型PKC(atypicalPKC，aPKC)，由(和入亚类组成，分子量较小为67kDa。其中，PKC S在调控人和鼠肝细胞生长和抗氧化中起着重要作用。迄今，关于PKC S在哺乳动物细胞生长、增殖和抗氧化中发挥调节作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物的细胞中开展，并取得了许多成果，但未见有鲤鱼PKC S基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组鲤鱼PKC 6基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。 本发明解决上述问题所采用的技术方案是一种重组鲤鱼PKC S基因，为下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No I所不的基因序列；2)将SEQ ID NO :1所不的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No :1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。一种重组鲤鱼PKC S氨基酸序列，为下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求I所述重组鲤鱼PKC A基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。一种上述重组鲤鱼PKC 6基因的制备方法，包括下述步骤
1)采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一
链；
2)以步骤I)中的cDNA第一链为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增，得到SEQID NO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步骤2)中以P1、P2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50 u I PCR扩增体系中各组分及其比例为CDNA第一链，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25 U I ;501^的卩2，0. 25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8. Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反应循环条件94°C 预变性 lmin ；94°C变性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40个循环；最后72°C延伸10 min,反应完成。一种上述制备的重组鲤鱼PKC 6基因的检测方法，包括下述步骤
1)将Pl和P2的PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaqPCR MasterMix进行，50 y IPCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的PKCS回收产物，l.Oiil ;50iiM的P3，0. 25u I ；50uM 的 P4，0.25ii I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反应循环条件94°C预变性lmin ;94°C变性30sec, 6CTC退火30sec, 72°C延伸lmin,共35个循环；最后72°C延伸5 min，反应完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列；
2)取5ill PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。具体地，该检测方法中，所述50倍稀释的PKC 6回收产物指重组鲤鱼PKC 6基因cDNA编码区核苷酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼PKC 8基因cDNA序列。一种上述制备的重组鲤鱼PKC 6基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤
1)将Pl和P2PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaq PCR Master Mix进行，50 PCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的？1((8回收产物，l.Oiil ;50iiM的P5，0. 25iil ；50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反应循环条件94°C预变性 lmin ;94°C变性 30sec,60°C (P5, P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；最后72°C延伸5min，反应完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQ ID NO :8所示的序列； 2)取5ill PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。上述重组鲤鱼PKC S基因在检测鲤鱼PKC S基因的表达情况中的应用。具体地，鲤鱼PKC S基因的表达情况包括鲤鱼PKC S基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况。为了检测上述应用的表达情况，根据SEQ ID NO :1所示序列设计上游引物ro1、下游引物ro2，所述roi具有seq id no :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用荧光定量PCR扩增，20 PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA，2.0iil ；10uM 的 NDl，1.0iil ；10uM 的 ND2，1.0iil ；
SYBR Premh Es Tag n (2X), 10. Ou I ；dH2o,6. o u I;反应循环条件％°C 预
变性30sec ;95°C变性5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44个循环；最后72°C延伸2min，反应完成。本发明研究和开发与鲤鱼PKC S蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚鲤鱼的PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养存活率、提高细胞抗氧化能力，以调控细胞生长等方面，由重组PKCS蛋白制备的抗体可以检测PKC 6基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。
本发明获得的重组PKC S基因的编码区长2061bp，并且确定了其核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。通过比对已知的斑马鱼、人、大鼠、小鼠的PKC S基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据斑马鱼胚胎的PKC S基因(NM_214708. l)cDNA编码区的序列，在不打破氨基酸编码的前提下设计上游引物(5’_从起始密码子ATG的开始)，下游引物5’端起始于斑马鱼PKC 6基因的天然终止密码子TGA，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增鲤鱼PKC 6基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了鲤鱼PKC 6基因的cDNA编码区2061bp片段，序列分析表明与斑马鱼的序列(NM_214708.1)同源性为88%，且保持了正确的编码。这一 cDNA片段称为 “cPKCS ”。所以，本发明的目的是通过己知的不同物种的PKC S的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法得到重组鲤鱼PKC S基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码鲤鱼PKC 6蛋白的基因的cDNA的编码区2061bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。综上所述，本发明的有益效果是本发明的重组鲤鱼PKC S蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚重组鲤鱼PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养存活率、提高细胞抗氧化能力，防止细胞氧化损伤，以调控细胞生长等方面，由重组PKC S蛋白制备的抗体可以检测PKC S基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。
图1是重组鲤鱼PKC 8基因序列的电泳 图2是以P3、P4为引物进行PCR鉴定的电泳 图3是以P5、P6为引物进行PCR鉴定的电泳图； 图4是鲤鱼不同肠段信号分子PKC 6 mRNA相对表达量的检测示意 图5是肌醇对幼建鲤前肠PKC 6磷酸化的影响的检测示意 图6是肌醇对幼建鲤中肠PKC 6磷酸化的影响的检测示意 图7是肌醇对幼建鲤后肠PKC 6磷酸化的影响的检测示意图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例1 :
本实施例的重组鲤鱼PKC S基因，为下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)将SEQ ID NO :1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No :1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。如903位的C替换成G，序列编码的氨基酸序列是相同。本实施例的重组鲤鱼PKC S氨基酸序列，为下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求1所述重组鲤鱼PKC A基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。如323位的K替换成L，蛋白质的生物活性不会发生改变。实施例2
为了获取实施例1中所述的重组鲤鱼PKC 6基因序列，可以采用本实施例的方法，具体如下
首先按照提取总RNA的标准要求采集鲤鱼(Common carp, Cyprinus carpio)的各类组织样本。现场宰杀鲤鱼后立即取肾脏、肠道、肌肉、脾脏及肝胰脏等组织块，放入冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于_80°C冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取鲤鱼肠道、肌肉、肾脏、肝胰脏及脾脏等组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物PKC S基因在各类组织中的表达情况和总RNA提取结果，选定以肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，以巢式PCR方法对扩增产物进行鉴定。Pl和P2引物对的扩增产物通过P3和P4、P5和P6的PCR扩增，电泳鉴定的得到预期大小的DNA片段，初步验证了 Pl和P2扩增产物的正确性。将Pl和P2引物对的扩增产物的样品送上海生工生物工程有限公司测序。作为结果，获得了 2061bp的鲤鱼cPKC 6基因cDNA编码区的核苷酸序列。 显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物Pl和P2，可以利用RT-PCR方法扩增出鲤鱼的cPKC 6基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的鲤鱼PKC 6基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测PKC 6基因的组织表达特异性，也可进一步实现鲤鱼PKC S基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的PKC S蛋白，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的PKC 6基因的表达情况等等。鲤鱼PKC 8基因的cDNA编码区2061bp片段的克隆
为了克隆来自鲤鱼肠道组织细胞的PKC 6基因包含2061bp编码区的cDNA，根据斑马鱼公开的核苷酸序列(NM_214708.1),首先设计合成允许扩增2061bp的cDNA的PCR引物对，即
上游引物 5’- ATGGCCCCTTTCCTGAGGATTGCT -3’(Pl)
下游引物 5’-GACCACAirGTGTCTCACITTTGCA -3’(P2)。然后设计合成了另外两对用于鉴别Pl和P2扩增产物的引物，即
上游引物 P3，5’ -AAATCCACCAAGCGACCTGA-3’，
下游引物 P4，5’ -TACCCACAATCCCTAACCGG-3’ ；
上游引物 P5，5’ -ACCTCTACTCCACTITTCAA-3’，
下游引物 P6，5’ -ATATTACCCACAATCCCTAA-3’ ；
为了利用RT-PCR方法克隆PKC S基因的cDNA，从鲤鱼肠道组织提取总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取鲤鱼肠道组织总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80°C冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA
第一链。
以上面得到的cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，利用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶进行 PCR 反应。50ii I PCR 扩增体系cDNA，2. 5 u I ；P1 (50uM),0. 25 u I ；P2 (50 uM),
0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；dNTP Mixture (each 2.5 mM),
8.0 ill ；ddH20, 33. 5 u1-,TaKaRa LA Taq (5 U/u 1),0. 5 u I0 反应循环条件94°C 预变性lmin ;94°C变性30sec，60 °C退火30sec，72°C延伸2 min，共40个循环；最后72°C延伸8min，反应完成。取5iil PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳检测(100V，10 min)，凝胶成像系统观察分析结果。作为结果，得到了 2061bp的特异性目的片段(SEQ ID NO :1所示序列)。Pl 和 P2 PCR 回收产物的 PCR 扩增采用 2 X Taq PCR Master Mix (KT201)进行，50 u I PCR 扩增体系PKCS 回收产物(50X 稀释)，1. Oii I ;P3 (50 y M)，0. 25 y I 和 P4(50iiM)*P5(50iiM)，0. 25 u I 和 P6(50 y M)，0. 25 u I ；2XTaq PCR Master Mix, 25. Ou I ；ddH20,23. 5 u I0 反应循环条件94°C预变性 lmin ;94°C变性 30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸5min，反应完成。取5 PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳检测(100V，lOmin)，凝胶成像系统观察分析结果。作为结果，分别得到了约900和约550 bp的扩增产物。其大小与P3P4引物对设计的扩增产物922bp和P5P6引物对设计的扩增产物556bp相符，表明扩增产物的特异性。经过两次鉴定的P1P2扩增产物送往上海生工生物工程有限公司用测序。作为结果，获得了 2061bp的鲤鱼PKC 6基因的cDNA编码区的核苷酸序列。鲤鱼PKC 6基因的cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:1显示了本实施实·例所获得的cDNA克隆的核苷酸序列，SEQ ID NO: 2是由此推断的氨基酸序列。PKC 6基因的核苷酸序列，它包括了 cDNA编码区的2061bp的开放阅读框，该开放阅读框编码686个氨基酸残基，分子量为78498. 36Da。本发明所获得的重组鲤鱼PKC S基因cDNA的核苷酸序列与斑马鱼(NM_214708.1)、人(NM_001090993.1)、小鼠(NM_0111)和大鼠(NM_133307.1)的 PKC S 基因cDNA的核苷酸序列的比较。结果表明鲤鱼PKC S与斑马鱼、人、小鼠和大鼠的同源性分别为 90. 1%、70. 7%、71. 0% 和 70. 3%。正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆鲤鱼PKC 6基因cDNA编码区的引物和编码鲤鱼的PKC S蛋白质的2061bp的cDNA和由此推断的氨基酸序列。此cDNA包括了 2061bp的核苷酸序列，它编码含有686个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如PET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的PKC S蛋白多肽段，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的PKC 6基因的表达情况等等。实施例3
本实施例为实施例1和实施例2记载的重组鲤鱼PKC S蛋白在测定鲤鱼不同肠段PKC 6基因表达的应用。本实例以荧光定量PCR技术研究PKC 6基因在鲤鱼各肠段的表达情况。选取体重接近的6尾健康鲤鱼取样。试验鱼肠道依据Villanueva等(1997)的方法分成几乎等长的7肠段，分别测定各肠段PKC 6 mRNA丰度。样品液氮研磨，提取总RNA。荧光定量用鲤鱼肠道cDNA第一链采用Prime Script RT reagent Kit (宝生物工程(大连)有限公司，DRR037AS)合成，按试剂盒说明书的方法操作。PKC 6 cDNA荧光定量扩增根据本发明克隆得到的重组鲤鱼PKC S基因的cDNA编码区序列，设计成一对PKC S特异性定量扩增引物
上游引物 PDl，5’- AAATCCACCAAGCGACCT -3’ ；
下游引物 PD2，5’- CGAACCCTCCCACAGACG -3’ ；
荧光定量PCR扩增采用 SYBR Pllllie Scupt RT-PCR Kit II (Perfect Real
Time)(宝生物工程(大连)有限公司，DRR083A)进行，20iil PCR扩增体系cDNA，2. Oyl ；PD1
(10uM),1.0u I ；PD2( 10 u M),1. 0 u I ；Premh E-yII(2X),10.0u I ；
dH20,6. Ou I。反应循环条件95°C预变性 30sec ;95°C变性 5sec，55°C退火 15sec，72°C延伸15sec，共44个循环；最后72°C延伸2min，反应完成。结果表明鲤鱼各肠段均有PKC S mRNA表达，第I和第4肠段显著其他各肠段Gd< 0.05)，第6肠段最低，其余肠段差异不显著Gd > 0.05)。实施例4
本实施例为实施例1和实施例2记载的重组鲤鱼PKC 6蛋白在测定肌醇对鲤鱼肠道PKC 6蛋白磷酸化影响的应用。本实例根据PKC S蛋白序列筛选的磷酸化抗体，检测量肌醇对鲤鱼不同肠段PKC 6蛋白磷酸化的影响。结果表明肌醇显著提高了前肠和中肠中PKC S的磷酸化水平CF < 0. 05);肌醇对后肠PKC S磷酸化水平没有影响0° > 0.05)。通过检测鲤鱼PKC 6基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况，可以对检测的中间数据结果进行进一步的分析和研究，对鲤鱼PKC S基因的表达情况、其表达蛋白的磷酸化及相关情况，做进一步研究，进而可用于抗体生产。如上所述， 可以较好的实施本发明。
权利要求
1.一种重组鲤鱼PKC S基因，为下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)将SEQ ID NO:1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQID No 1所不的基因序列表达的氣基酸序列相同的基因序列。
2.一种重组鲤鱼PKC S氨基酸序列，为下述序列之一 1) SEQ ID N0:2所示的由权利要求I所述重组鲤鱼PKC A基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID N0:2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID N0:2序列衍生的蛋白质。
3.一种权利要求1所述重组鲤鱼PKC S基因的制备方法，其特征在于，包括下述步骤 1)采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链； 2)以步骤I)中的cDNA第一链为模板，利用引物PUP2进行PCR扩增，得到SEQ IDNO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步骤2)中以P1、P2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50iU PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA第一链，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25yl ;501^的卩2，0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8.Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反应循环条件94°C 预变性 Imin ；94°C变性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40个循环；最后72°C延伸10 min,反应完成。
4.一种权利要求3所述制备的重组鲤鱼PKC S基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤 1)将Pl和P2的PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaqPCR MasterMix进行，50 ii IPCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的？1((6回收产物，l.Oiil ;5011|1的？3，0.25u I ；50uM 的 P4，0. 25 u I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反应循环条件94°C预变性Imin ;94°C变性30sec, 60°C退火30sec, 72°C延伸lmin,共35个循环；最后72°C延伸5 min，反应完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列； 2)取5ill PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。
5.根据权利要求4所述重组鲤鱼PKCS基因的检测方法，其特征在于，所述50倍稀释的PKC 6回收产物指重组鲤鱼PKC 6基因cDNA编码区核苷酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼PKC S基因cDNA序列。
6.一种权利要求3所制备的重组鲤鱼PKC S基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤 I)将Pl和P2 PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaq PCR Master Mix进行，50 PCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的？1((8回收产物，l.Oiil ;50iiia^P5，0.25iil ；·50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反应循环条件·94°C预变性 lmin ;94°C变性 30sec，60°C (P5P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；最后72°C延伸5min，反应完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQID NO :8所示的序列；2)取5 ill PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。
7.权利要求1所述重组鲤鱼PKCS基因在检测鲤鱼PKC S基因的表达情况中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，鲤鱼PKCS基因的表达情况包括鲤鱼PKC 6基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，在检测中，根据SEQID NO :1所示序列设计上游引物ro1、下游引物PD2，所述roI具有SEQ ID NO :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用荧光定量PCR扩增，20 ill PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA，2. Ou I ；10uM 的 ND1，1. 0 y I ;10 y M 的 ND2，l.Oul Premix Ex TagmII (2X)，10. Oii I ；dH20,6. Ou I ;反应循环条件95°C预变性 30sec ;95°C变性 5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44个循环；最后72°C延伸2min，反应完成。
全文摘要
本发明公开了一种重组鲤鱼PKCδ基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。重组鲤鱼PKCδ基因具有SEQ ID NO:1所示的序列。重组鲤鱼PKCδ蛋白具有SEQ ID NO:2所示的序列。本发明的重组鲤鱼PKCδ蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚重组鲤鱼PKCδ基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞抗氧化能力，防止细胞氧化损伤，以调控细胞生长等方面，由重组PKCδ蛋白制备的抗体可以检测PKCδ基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。
文档编号C12N15/10GK103060347SQ20131004651
公开日2013年4月24日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者周小秋, 姜维丹, 冯琳, 姜俊, 刘扬, 李树红 申请人:四川农业大学