乙型肝炎病毒p区变异及其用途
【专利摘要】本发明涉及乙型肝炎病毒P区变异及其用途。本发明首次揭示了乙型肝炎病毒P区多个位点上的碱基突变与肝癌的发生密切相关，可将这些位点的变异作为肝癌易感性标志。本发明还提供了可特异性检测所述突变位点的试剂或试剂盒。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物【技术领域】；具体地说，本发明涉及乙型肝炎病毒P区变异；基于这 些变异情况，本发明提供了可用于肝癌预测以及早期（辅助性）诊断的检测试剂或试剂盒。 乙型肝炎病毒P区变异及其用途 【背景技术】
[0002] 原发性肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，已占居民肿瘤死亡的第二位。乙型 肝炎病毒（HBV)慢性感染是导致我国肝癌发生的首要原因。我国约有HBV表面抗原（HBsAg) 携带者1. 2亿，他们中相当部分的慢性肝炎患者，经10?20年的发展会进入肝硬化状态， 而肝硬化患者中每十年即有30?50%的人将演变成肝癌。近年来，随着乙肝疫苗的普遍应 用，我国儿童中肝炎的发病得到了很好的控制。但在那些已经感染了乙肝病毒的人群中，肝 癌的发病率和死亡率却仍然呈上升趋势。
[0003] 乙型肝炎病毒属于嗜肝性DNA病毒科，其基因组为部分环状双链DNA，约3200bp， 由正链和负链构成（图1)。负链含有4个开放读码框（Open Reading Frame, 0RF):前S/ S区、X区、P区（聚合酶）以及P区（precore/core，pre-C/C);除此之外还有多个基因表 达调控序列，包括2个直接重复序列（DRI、DRII)、2个增强子（ENI、ENII)和4个启动子 (SP1、SP2、XP和CP)。HBV前S/S区包括前S1基因、前S2基因和S基因，分别编码病毒包 膜大蛋白（400aa)、中蛋白（271aa)和小蛋白（226aa) ;X区编码HBV X蛋白；HBV的前C基 因及C基因则共享另一个开放读码框P区，根据不同的起始密码子，分别编码病毒核心抗原 (Hepatitis B Core Antigen，HBcAg)和 e 抗原（Hepatitis B e Antigen，HBeAg), P 区编 码DNA聚合酶。
[0004] P基因是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠，具体的碱基相对位置见图2。P基 因主要编码HBV聚合酶。HBV聚合酶是乙肝病毒复制的物质基础。根据功能的不同，HBV聚 合酶从氨基端开始分为四个区，分别为末端蛋白区（TP)、间隔区（SD)、逆转录酶区（RT)和 RNase Η区。其中逆转录酶RT区是HBVDNA聚合酶的主要功能区，同时具有反转录酶及DNA 聚合酶活性，作用是将前基因组RNA反转录成负链HBV DNA，并以此负链DNA为模板合成正 链DNA。HBV的逆转录酶区可进一步分为五个主要的功能域，Α区（421?436氨基酸）、Β区 (506?528氨基酸）、C区（546?550氨基酸）、D区（576?589氨基酸）及Ε区（592? 600氨基酸）。这五个区域的氨基酸高度保守，为维持反转录酶活性所必须，其中A、C、D区 为聚合酶与三磷酸核苷结合的结合域，B、E区为RNA模板和引物定位域。目前临床应用的 拟核苷类药物主要的靶位点位于逆转录酶RT区的B及C区，HBV多聚酶的催化域即位于C 区的YMDD基序。也是拉米夫定等抗病毒药物治疗时HBV最常出现变异的区域。P基因变 异主要见于P0L/RT基因片段（349?692aa，即rtl?rt344)。在拉米夫定的抗病毒治疗 中，最常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD)变异，即由YMDD变异为 YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V)，并常伴有rtL180M变异，且受药物选择而逐渐成为对拉 米夫定耐药的优势株。较早的研究报道，多为P基因与拉米夫定等核苷酸耐药有关系，P基 因与肝癌的发生关系至今仍很少报道。
[0005] 目前常用的基因突变检测方法包括限制性片段长度多态性（RFLP)，单链构象多态 性（PCR-SSCP)，基因芯片及DNA序列测定技术。PCR-SSCP用于检测基因突变操作繁琐、检 测通量低，而且不能判断特异性位点的突变形式。而RFLP是使用核酸内切酶对扩增后的靶 序列特异性位点的切割，然后通过电泳检测判断不同的基因型，但是由于HBV基因组分子 进化速度较快、变异频繁，因此结果分析准确率较低。近年来，基因芯片技术已成功应用于 核酸分析，对检测HBV基因组多态性具有很大的优势，但因其检测费用昂贵而限制了该技 术在临床实验室的推广和应用。因此，本领域有必要开发优化的且切实可推广应用的临床 检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供乙型肝炎病毒P区变异及其用途。
[0007] 本发明的目的还在于提供用于肝癌预测以及早期（辅助性）诊断的检测试剂或试 剂盒。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒P区变异 的试剂盒，它包括：
[0009] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1055位碱基序列的引物；和/或
[0010] 与乙型肝炎病毒P区第1055位为碱基"A"的序列结合的探针。
[0011] 在一个优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0012] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第987位碱基序列的引物；和/或
[0013] 与乙型肝炎病毒P区第987位为碱基"G"的序列结合的探针。
[0014] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0015] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第799位碱基序列的引物；和/或
[0016] 与乙型肝炎病毒P区第799位为碱基"G"的序列结合的探针。
[0017] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0018] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第904位碱基序列的引物；和/或
[〇〇19] 与乙型肝炎病毒P区第904位为碱基"T"的序列结合的探针。
[0020] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0021] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第955位碱基序列的引物；和/或
[0022] 与乙型肝炎病毒P区第955位为碱基"T"的序列结合的探针。
[0023] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0024] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1229位碱基序列的引物；和/或
[0025] 与乙型肝炎病毒P区第1229位为碱基"A"的序列结合的探针。
[0026] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0027] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1230位碱基序列的引物；和/或
[0028] 与乙型肝炎病毒P区第1230位为碱基"G"的序列结合的探针。
[0029] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0030] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第2489位碱基序列的引物；和/或
[0031] 与乙型肝炎病毒P区第2489位为碱基"A"的序列结合的探针。
[0032] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0033] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第294位碱基序列的引物；和/或
[〇〇34] 与乙型肝炎病毒P区第294位为碱基"A"的序列结合的探针。
[0035] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
[0036] 扩增含有乙型肝炎病毒P区第895位碱基序列的引物；和/或
[0037] 与乙型肝炎病毒P区第895位为碱基"A"的序列结合的探针。
[0038] 在另一优选例中，所述的引物包括：
[0039] SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:25所示序列的引物对，用于扩增含有 乙型肝炎病毒P区第799、895、904、955、987、1055、1229或1230位碱基的序列；和/或
[0040] SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示序列的引物对，用于扩增含有 乙型肝炎病毒P区第294位碱基的序列；和/或
[0041] SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:31所示序列的引物对，用于扩增含有 乙型肝炎病毒P区第2489位碱基的序列。
[0042] 在另一优选例中，所述的与乙型肝炎病毒P区第1055位为碱基"A"的序列结合的 探针的序列如SEQ ID N0:12 ;
[0043] 所述的与乙型肝炎病毒P区第987位为碱基"G"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:10 ；
[0044] 所述的与乙型肝炎病毒P区第799位为碱基"G"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:2 ；
[0045] 所述的与乙型肝炎病毒P区第904位为碱基"T"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:6 ；
[0046] 所述的与乙型肝炎病毒P区第955位为碱基"T"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:8 ；
[0047] 所述的与乙型肝炎病毒P区第1229位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ;
[0048] 所述的与乙型肝炎病毒P区第1230位为碱基"G"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16 ;
[0049] 所述的与乙型肝炎病毒P区第2489位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:20 ；
[0050] 所述的与乙型肝炎病毒P区第294位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO: 18 ;或
[0051] 所述的与乙型肝炎病毒P区第895位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID N0:4。
[0052] 在另一优选例中，所述的探针连接有可检测信号；或所述的试剂盒中还包括阳性 控制探针；所述的阳性控制探针是与乙型肝炎病毒P区保守性序列结合的探针，待测样品 中有乙型肝炎病毒的DNA存在时呈现阳性。
[0053] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括可检测信号控制探针。
[0054] 在本发明的另一方面，提供一种体外检测（优选非诊断性地）乙型肝炎病毒P区 变异的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0055] 检测该核酸样品的乙型肝炎病毒P区，并与野生型的乙型肝炎病毒P区比较，存在 选自以下变异形式就表明该个体乙型肝炎病毒P区存在核苷酸变异：
[0056] 乙型肝炎病毒P区第1055位，T -A ;和/或
[0057] 乙型肝炎病毒P区第987位，A - G;和/或
[0058] 乙型肝炎病毒P区第799位，A - G;和/或
[0059] 乙型肝炎病毒P区第904位，A - T;和/或
[0060] 乙型肝炎病毒P区第955位，C - T ;和/或
[0061] 乙型肝炎病毒P区第1229位，G -A ;和/或
[0062] 乙型肝炎病毒P区第1230位，C - G ;和/或
[0063] 乙型肝炎病毒P区第2489位，G -A ;和/或
[0064] 乙型肝炎病毒P区第294位，C -A ;和/或
[0065] 乙型肝炎病毒P区第895位，T - A。
[〇〇66] 在本发明的另一方面，提供了一种乙型肝炎病毒P区核苷酸序列的用途，用于制 备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂或试剂盒。
[〇〇67] 在本发明的另一方面，提供了一种SEQ ID N0:1-31所述的引物和/或探针或其组 合的用途，它（或它们）被用作肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂；或者用于制备肝癌预 测或肝癌早期辅助诊断的试剂盒。
[〇〇68] 在另一优选例中，上述任一试剂盒中，包括了①容器，以及装于所述容器的特异性 扩增的引物；和②容器，以及装于所述容器的与含突变位点的序列结合的探针。
[0069] 在另一优选例中，所述的乙型肝炎病毒P区核苷酸位置编号基于GenBank登录号 ⑶434374乙型肝炎病毒基因序列。
[0070] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描 述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一 累述。 【专利附图】
【附图说明】
[0071] 图1、乙肝病毒分子结构模式图。
[0072] 图2、P基因区与其他开放读码框的相对碱基位置。
[0073] 图 3A、nt. 799，nt. 895，nt. 904，nt. 955，nt. 987，nt. 1055，nt. 1229，nt. 1230, nt. 294, nt. 2489 全野生型。
[0074] 图3B、799位点突变（A - G)，其余位点野生。
[0075] 图3C、895位点突变（T - A)，其余位点野生。
[0076] 图3D、904位点突变（A - T)，其余位点野生。
[0077] 图3E、955位点突变（C - T)，其余位点野生。
[0078] 图3F、987位点突变（A - G)，其余位点野生。
[0079] 图3G、1055位点突变（T - A)，其余位点野生。
[0080] 图3H、1229位点突变（G - A)，其余位点野生。
[0081] 图31、1230位点突变（C - G)，其余位点野生。
[0082] 图3J、1229和1230位点同时突变，其余位点野生。
[0083] 图3K、294位点突变（C - A)，其余位点野生。
[0084] 图3L、2489位点突变（G - A)，其余位点野生（因2489位点的序列是用反向引物 测得的，所以看到的序列图为C - T)。 【具体实施方式】
[0085] 为探索肝癌高发地区HBV变异位点与肝癌发生关系，本发明人通过对肝癌患者血 清HBV P基因的测序分析，筛选出了新的与肝癌发生密切相关的突变位点，为肝癌的高危 筛选、预防和干预提供新的分子标志物。因此，在本发明中首次揭示了乙型肝炎病毒（HBV) P 区第 1055、987、799、904、955、1229、1230、2489、294 和 / 或 895 位碱基的突变（HBV P 区 1055位T - A突变、987位A - G突变、799位A - G突变、904位A - T突变、955位C - T 突变、1229位G - A突变、1230位C - G突变、2489位G - A突变、294位C - A突变、895 位T -A突变）与肝癌的发生密切相关。可将该这些位点的变异作为肝癌易感性标志，从 而设计特异性检测所述突变位点的试剂或试剂盒。在此基础上完成了本发明。
[0086] 如本文所用，术语"乙型肝炎病毒P区"指乙型肝炎病毒P区，野生型核苷酸序列 为 GenBank 登录号⑶434374(SEQ ID N0:32)所示。
[0087] 如本文所用，术语"肝癌相关的乙型肝炎病毒P区变异"指乙型肝炎病毒P区第 1055、987、799、904、955、1229、1230、2489、294 和 / 或 895 位碱基突变，尤其是第 1055 位 T -A(简写为 T1055A)、987 位 A -G 突变（简写为 A987G)、799 位 A -G(简写为 A799G)、 904位A - T突变（简写为A904T)、955位C - T突变（简写为C955T)、1229位G -A突 变（简写为G1229A)、1230位C -G突变（简写为C1230G)、2489位G -A突变（简写为 G2489A)、294位C - A突变（简写为C294A)、895位T - A突变（简写为T895A)。应理解， 所述的变异可以是一个位点的突变，也可以是2、3或4个位点的突变的组合。
[0088] 基于本发明人的新发现，可以将乙型肝炎病毒P区第1055、987、799、904、955、 1229、1230、2489、294和/或895位碱基的相关突变作为标志，从而：从乙型肝炎病毒阳性 的人群中分离出对于肝癌易感性的人群，或作为肝癌疾病的鉴别诊断、和/或易感性分析 的辅助性工具；早期评估相关人群肝癌患病风险。
[0089] 例如，可从乙型肝炎病毒阳性患者人群中分离出乙型肝炎病毒P区第1055、987、 799、904、955、1229、1230、2489、294和/或895位碱基发生突变的人群，作为肝癌的高发人 群，从而达到早期监测早期预防的目的。
[0090] 此外，还可通过进一步检测乙型肝炎病毒P区其它位点的突变情况来评估肝癌 易感性。本发明人的研究发现，乙型肝炎病毒P区第1055、987、799、904、955、1229、1230、 2489、294和/或895位碱基的突变结合可提高肝癌发生的可能性。所述突变在肝癌患者中 的发生比例显著高于慢性肝炎患者中的比例。
[0091] 基于本发明人的上述发现，可采用各种技术来检测乙型肝炎病毒P区第1055、 987、799、904、955、1229、1230、2489、294和/或895位碱基的突变情况，这些技术均包含在 本发明中。例如，对相关位点进行序列测定，从而判断是否发生变异。
[0092] 在检测相关位点的变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。可用已有的 技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响 蛋白的表达，因此可用例如Western印迹法间接判断基因有无突变。
[0093] 此外，可用相关位点特异的引物进行聚合酶链反应（PCR)来进行体外鉴定；或者 可根据相关位点设计可特异性结合的探针来进行体外鉴定；或者可利用特异性的限制性内 切酶来进行体外鉴定。
[0094] 作为一种可选的方式，还可采用基于PCR技术的单碱基延伸技术来检测变异位 点，其原理是设计一条引物，位于待测变异位点的上游，并且该引物的3'端距离变异位点 一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，只有当加入的ddNTP与变异位点碱基互 补时，引物才得以延伸。可通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断变异的类型。
[0095] 作为本发明的优选方式，可结合已知的PCR-斑点印迹杂交技术，建立一种能在较 短时间内检测和分析HBV基因组P区基因突变的方法。
[〇〇96] 本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂。所述的试剂 例如是：对相关突变位点特异的引物；对相关突变位点特异的探针；或对相关突变位点特 异的限制性内切酶。
[0097] 本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂盒，该试剂盒 包括：
[0098] 装在适当容器中的、用于扩增含有乙型肝炎病毒P区第799、895、904、955、987、 1055、1229、1230位、294位、2489位碱基序列的引物。
[〇〇99] 作为本发明的优选方式，当应用探针进行检测时，可以在探针上设置可检测信号， 从而便于进行扩增产物的识别，所述的可检测信号例如是荧光信号、染料信号、显色剂信 号。作为本发明的一种实施方式，所述的可检测信号是生物素，基于生物素作为显色标记的 原位杂交技术已经是本领域技术人员熟知的技术。
[〇1〇〇] 当所述试剂盒中含有针对多于一个位点变异情况的检测试剂时，检测或评估的准 确性可能提1?。
[〇1〇1] 作为本发明的可选择的方式，所述的试剂盒中可包括：特异性与乙型肝炎病毒P 区发生 T1055A、A987G、A799G、A904T、C955T、G1229A、C1230G、G2489A、C294A、T895A 的基因 产物结合且不结合于相关位点未突变的基因产物的抗体。更优选的，所述试剂盒中还包括 常规的可用于检测抗原抗体结合状况的试剂。
[0102] 此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂， 包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
[0103] 此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。
[0104] 本发明的主要优点在于：
[0105] (1)通过大规模地对乙型肝炎或肝癌发病人群进行研究，发现并证实肝癌发生相 关的新的变异位点，研究病例多，准确性高。
[0106] (2)首次针对新的变异位点，设计出特异性的检测试剂和试剂盒，为早期评估相关 人群肝癌患病风险提供了新的途径。
[0107] (3)基于早期检测结果，对于携带新的变异位点的乙型肝炎病毒携带者个体，可采 取加强随访和复查等手段，以便能够尽早确诊和治疗。并开发新的可用于肝癌预测以及早 期（辅助性）诊断的检测试剂或试剂盒。
[0108] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0109] 实施例1、HBV P基因突变与肝癌相关性分析
[0110] 1、研究对象
[0111] 研究对象来自江苏启东肿瘤医院和启东市人民医院收治的病人，其中肝癌202 例，肝炎202例，肝癌患者平均年龄为51. 1±9. 2岁，男女性别比165:37 ;肝炎患者平均年 龄为50. 7±9. 5岁，男女性别比165:37。所有病例HBsAg及HBVDNA均为阳性。肝炎的诊 断符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准。 肝癌的诊断符合2001中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的《原发性肝癌的临床诊断与分 期标准》，其中含病理诊断242例，临床诊断162例。所有病例均已排除肝硬化患者且无合 并丙型肝炎病毒（hepatitis C viruS，HCV)感染。所有肝炎患者并没有接受抗病毒药物治 疗，血清分离后于-70°C冰箱冻存至检测。
[0112] 2、血清DNA抽提
[0113] 取 50ul 的血清，加 10ul 的裂解液(1 Ommol /1 的 Tis-HCl，lmmol/1 的EDTA，15mmol/ 1 的 NaCl，0. 5%SDS，PH8. 0)，混匀，煮沸 lOmin，5000xg 离心 5min，取上清液备用。
[0114] 3、HBV DNA P 基因扩增
[0115] (1)引物设计及扩增
[0116] 根据HBV DNA的结构和HBV P基因序列多重比较结果，设计巢式PCR引物。引物 由上海Invitrogen公司合成，见表1。
[0117] 通过两轮巢式PCR进行HBV P基因扩增，扩增所用引物见表1。
[0118] 表1、HBV P区PCR扩增引物核苷酸序列及位置
[0119]
【权利要求】
1. 一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒P区变异的试剂盒，其特征在于，它包 括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1055位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 1055位为碱基"A"的序列结合的探针。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第987位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 987位为喊基"G"的序列结合的探针。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第799位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 799位为碱基"G"的序列结合的探针。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第904位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 904位为碱基"T"的序列结合的探针。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第955位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 955位为碱基"T"的序列结合的探针。
6. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1229位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 1229位为碱基"A"的序列结合的探针。
7. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1230位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 1230位为喊基"G"的序列结合的探针。
8. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第2489位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 2489位为碱基"A"的序列结合的探针。
9. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第294位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 294位为碱基"A"的序列结合的探针。
10. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第895位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第 895位为碱基"A"的序列结合的探针。
11. 如权利要求1-10任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括： SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示序列的引物对，用于扩增含有乙型 肝炎病毒P区第799、895、904、955、987、1055、1229或1230位碱基的序列；和/或 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示序列的引物对，用于扩增含有乙型 肝炎病毒P区第294位碱基的序列；和/或 SEQ ID NO:29、SEQ ID N0:30和SEQ ID NO:31所示序列的引物对，用于扩增含有乙型 肝炎病毒P区第2489位碱基的序列。
12. 如权利要求1-10任一所述的试剂盒，其特征在于， 所述的与乙型肝炎病毒P区第1055位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:12 ； 所述的与乙型肝炎病毒P区第987位为碱基"G"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:10 ； 所述的与乙型肝炎病毒P区第799位为碱基"G"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:2 ； 所述的与乙型肝炎病毒P区第904位为碱基"T"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:6 ； 所述的与乙型肝炎病毒P区第955位为碱基"T"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:8 ； 所述的与乙型肝炎病毒P区第1229位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ; 所述的与乙型肝炎病毒P区第1230位为碱基"G"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16 ; 所述的与乙型肝炎病毒P区第2489位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:20 ； 所述的与乙型肝炎病毒P区第294位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID NO:18 ;或 所述的与乙型肝炎病毒P区第895位为碱基"A"的序列结合的探针的序列如SEQ ID N0:4。
13. 如权利要求1-10任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针连接有可检测信号； 或 所述的试剂盒中还包括阳性控制探针；所述的阳性控制探针是与乙型肝炎病毒P区保 守性序列结合的探针，待测样品中有乙型肝炎病毒的DNA存在时呈现阳性。
14. 一种体外检测乙型肝炎病毒P区变异的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步 骤： 检测该核酸样品的乙型肝炎病毒P区，并与野生型的乙型肝炎病毒P区比较，存在选自 以下变异形式就表明该个体乙型肝炎病毒P区存在核苷酸变异： 乙型肝炎病毒P区第1055位，T - A ;和/或 乙型肝炎病毒P区第987位，A - G ;和/或 乙型肝炎病毒P区第799位，A - G ;和/或 乙型肝炎病毒P区第904位，A - T ;和/或 乙型肝炎病毒P区第955位，C - T ;和/或 乙型肝炎病毒P区第1229位，G - A ;和/或 乙型肝炎病毒P区第1230位，C - G ;和/或 乙型肝炎病毒P区第2489位，G - A ;和/或 乙型肝炎病毒P区第294位，C - A ;和/或 乙型肝炎病毒P区第895位，T - A。
【文档编号】C12Q1/70GK104109720SQ201310139142
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月19日 优先权日:2013年4月19日
【发明者】屠红, 赵芝梅, 金晏, 高付敏, 陈陶阳, 吴燕, 甘愉 申请人:上海市肿瘤研究所