小型猪细胞色素p450重组酶的构建表达及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法及应用。本发明通过克隆表达小型猪CYP3A22和CYP3A46基因，获得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重组酶，并应用于小型猪与人CYP3A的单酶的相似性评价，为药物临床前药代动力学研究提供指导。本发明提供的重组酶可在临床前药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用，通过体外孵育实验考察某经CYP3A代谢药物被小型猪CYP3A和人CYP3A重组酶的代谢情况是否相似，判断该药物的临床前试验是否适合选用小型猪作为其药代动力学研究的动物模型。该体外结果同时可为体内研究提供基础数据及参考依据。
【专利说明】小型猪细胞色素P450重组酶的构建表达及应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物医药领域，特别涉及小型猪细胞色素P450基因的蛋白重组表达及应用。
技术背景
[0002]细胞色素P450 (cytochrome P450，CYP)是一类含有非共价结合血红素的蛋白，主要位于细胞内质网膜上，在人和动物体内普遍存在。P450酶是人体内重要的药物代谢酶，负责催化内源性物质或外源性物质的I相代谢，参与了接近90%左右的临床药物的代谢[1]。该酶主要存在于肝脏中，在一些肝外组织(如:肺，小肠，肾脏等)中也广泛存在。编码该酶的P450基因是一个基因超家族，含有多个家族和亚家族，其中CYP3A亚家族含量最多，代谢底物谱最广，是人类最主要的药物代谢酶。另外，CYP3A与许多癌症的发生、治疗及预后都密切相关，大大提闻了人们对它的关注程度。
[0003]新药上市前必须经过临床前动物研究考察药物的安全性和有效性，动物研究能够初步判断药物在体内的药效及药代动力学行为，为药物进行临床试验提供基础数据及重要的参考依据。因此，临床前研究中使用的实验动物需能较好的模拟人体中的情况，才能对后续的人体临床试验产生更好的指导意义。细胞色素P450的差异是实验动物与人药物代谢特性差异的重要原因[2]，其介导的药物代谢对药物的ADME具有重要影响，其介导药物生成代谢产物的种类和转化快慢在很大程度上决定了药物的药代动力学、药效及清除率，决定了药物的有效性和安全性。因此，在药物临床前研究时我们应根据药物性质的不同，尽量选择与人体内ADME代谢特性相似的动物模型。考虑到CYP3A酶在药物代谢中的主导地位，不同实验动物的CYP3A代谢特性就成为动物模型选择的重要依据。
[0004]随着动物保护运动的兴起，国际动物保护组织对实验动物的限制更加严格，“3R”原则(Reduce, Replace, Refine)逐渐推广，使得灵长类动物及犬等高等动物使用受到限制，以小型猪进行药物的药理、毒理、药代、药效的研究日渐增多。肝微粒体水平的研究表明小型猪与人CYP酶代谢特性相似，其中猪的CYP3A在催化活性及抑制特性上与人最为接近[3]。然而肝微粒体为混合酶系，并不能反应小型猪单酶的代谢特性，本研究通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统，能够获得活性良好的小型猪CYP3A家族最主要的单酶CYP3A22和CYP3A46[4]，为体外研究小型猪与人CYP3A的单酶的相似性，以及体外评价小型猪是否适合用作某药物临床前药代动力学研究的实验动物提供理想的工具。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供代谢活性良好的小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法，通过以下步骤实现:
[0006](1)以巴马小型猪的肝cDNA为模板，通过设计CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，获得巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2所示，将该基因片段添A后与pMD18_T连接得pMD18_T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒，再将其转入大肠杆菌E.coli DH5 α感受态细胞进行质粒扩增。
[0007]所设计的引物序列如下:
[0008]SEQ ID No:3CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTT
[0009]SEQ ID No:4CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTC
[0010]SEQ ID No:5CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTT
[0011]SEQ ID No:6CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC。
[0012](2)以获得的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒为模板，通过设计含有BamHI, SAlI两个酶切位点的特定引物，获得两端含特定酶切位点的巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，Sail两个酶进行双酶切得到CYP3A22、CYP3A46两个基因片段。
[0013]引物序列如下:
[0014]SEQ ID No:7CYP3A22 h游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT,
[0015]SEQ ID No:8CYP3A22 下游引物:
[0016]ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC,
[0017]SEQ ID No: 9CYP3A46 h.游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC,
[0018]SEQ ID No:10CYP 3A46 上游引物:
[0019]ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC。
[0020](3)将载体质粒pFastBacl也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述两个基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将CYP3A22、CYP3A46基因片段与载体片段连接，构建 pFastBac-CYP3A22，pFastBac_CYP3A46 两种质粒。
[0021](4)再将质粒转化入E.coli DHlOBac感受态细胞进行转座，获得Bacmid_CYP3A22和Bacmid-CYP3A46重组粘粒。将重组粘粒别转染草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)，获得重组病毒V-CYP3A22和V-CYP3A46，再分别将以上两种重组病毒与v-CYPOR和v_CYPb5共感染Sf9细胞，即可在细胞内高表达CYP3A22和CYP3A46重组蛋白；通过Western Bolt验证重组蛋白的表达，通过CYP3A经典底物睾酮和咪达唑仑验证CYP3A22和CYP3A46活性。
[0022]本发明的另一个目的是提供该小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶在临床前药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用。本发明的用途通过以下步骤实现:(1)以研究药物作为底物，分别与PCYP3A22/46孵育，检测该药物经pCYP3A22/46代谢生成的代谢产物种类及相对含量，将该结果与hCYP3A4/5的结果进行比较，若生成的主要代谢产物和相对含量较为一致，则小型猪与人CYP3A代谢该药物的代谢物谱相似；(2)将系列浓度的研究药物分别与PCYP3A22/46孵育，绘制酶动力学曲线，通过GraphPad Prism5软件计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax、和内在代谢清除率Clint (Vmax/Km)等酶动力学参数,将所得结果与hCYP3A4/5的结果进行比较，若软件拟合所得的酶动力学参数相近，则可以说明小型猪与人CYP3A对该药物的亲和力和转化速率相近。综合以上结果，小型猪与人CYP3A对该药物的代谢特性相近，则可以推断该药物的临床前药代动力学研究适合选用小型猪作为实验动物模型。
[0023]本发明的积极效果是:随着小型猪在药物的药理、毒理、药代、药效的研究日渐增多，考察小型猪CYP酶的功能特性并与人体进行相似性比较，从而判断小型猪是否适合用作该药物临床前研究的动物模型变得更加关键。本发明首次克隆表达小型猪CYP3A22和CYP3A46基因，获得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重组酶可应用于小型猪与人CYP3A的单酶的相似性评价并为药物临床前药代动力学研究提供指导，通过体外孵育实验考察某经CYP3A代谢药物被小型猪CYP3A和人CYP3A重组酶的代谢情况是否相似，可以初步判断该药物的临床前试验是否适合选用小型猪作为其药代动力学研究的动物模型，该体外结果同时可为体内研究提供基础数据及参考依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1A是cDNA文库PCR产物电泳鉴定，条带1、2分别为用CYP3A22和CYP3A46特异引物PCR的产物电泳图。
[0025]图1B是PCR产物连T载体后转化入DH5 α后菌液抽提质粒的电泳鉴定，条带1、2分别是 PMD18-T/CYP3A22 和 pMD18_T/CYP3A46 质粒。
[0026]图1C 是 pMD18-T/CYP3A22 和 pMD18_T/CYP3A46 两种质粒 PCR 产物电泳鉴定。
[0027]图1D是pFastBac_CYP3A22，pFastBac_CYP3A46两种质粒的双酶切产物电泳鉴定。
[0028]图1E是重组Bacmid粘粒PCR产物电泳鉴定，条带1、2分别是Bacmid_CYP3A22，Bacmid-CYP3A46的PCR产物电泳图。
[0029]图2是鉴定重组蛋白的表达的Western Blot图，条 带1、2、3、4分别是空白Sf9、P0R+CYPb5、pCYP3A22、pCYP3A46 样品。
[0030]图3A-E 是 pCYP3A22、pCYP3A46、对照 hCYP3A4、pCYP3A5、及阴性对照蛋白液代谢睾酮生成产物的液相色谱图，图3A、3B、3C、3D、3E分别是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5和阴性对照CYP0R+CYPb5蛋白液的孵育结果。
[0031]图4A-E 是 pCYP3A22、pCYP3A46、对照 hCYP3A4、pCYP3A5、及阴性对照蛋白液代谢咪达唑仑生成产物的液相色谱图，图A、B、C、D、E分别是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5和阴性对照CYP0R+CYPb5蛋白液的孵育结果。
[0032]图5是pCYP3A22、pCYP3A46及对照hCYP3A4、hCYP3A5代谢睾酮生成6 β -羟基睾酮的酶动力学曲线，其中图A、B、C、D分别是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5的拟合结果。
[0033]图6是pCYP3A22、pCYP3A46及对照hCYP3A4、hCYP3A5代谢咪达唑仑生成1_羟基咪达唑仑的酶动力学曲线，其中图A、B、C、D分别是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5的拟合结果。
【具体实施方式】
[0034]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0035]实施例1:目的基因的制备
[0036]1.lpCYP3A22 和 pCYP3A46cDNA 的克隆
[0037](I)用PCR方法从巴马小型猪肝脏cDNA文库中获得小型猪CYP3A22和CYP3A46的基因片段。所用引物如下:
[0038]SEQ ID No: 3CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTT
[0039]SEQ ID No: 4CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTC
[0040]SEQ ID No:5CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTT
[0041]SEQ ID No:6CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC[0042]反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5 μ 1、浓度为10mmol/L的dNTPs2.5 μ 1、浓度为10 μ mol/L的上、下游引物各2 μ 1、模板2 μ 1、浓度为5U/μ I的DNA聚合酶0.5 μ 1、浓度为50mmol/L的MgC12溶液2 μ 1、双蒸水补充至总体积为25 μ I ；
[0043]反应条件为:温度96°C预变性5分钟，然后95°C变性30秒、58 °C退火30秒、72°C延伸I分钟，共12个循环，每循环I次退火温度降低0.50C ;再95°C变性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸I分钟，共33个循环；最后72°C延伸5分钟；经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，得到长度约1.5kb的条带(见图1A)，位置正确，认为获得目的基因。
[0044](2)将位置正确的PCR产物胶回收，回收产物进行添A反应，反应产物进行电泳鉴定并且胶回收，回收产物与PMD18-T Vector (T载体)相连。
[0045](3)转化将连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，于含氨苄LB固体培养基上，37°C孵箱培养过夜。待次日培养基上长出菌斑后，挑取培养基上的单菌落至液体含氨苄的LB培养基中，37°C摇床培养10-12h。将菌液用试剂盒抽提质粒，质粒进行电泳鉴定，结果符合一般质粒的特征(见图1B)，最亮一条为环形质粒，认为得到了 pMD18-T/CYP3A22和PMD18-T/CYP3A46 质粒。
[0046]取所得阳性克隆质粒，从pMDlS-Τ载体的多克隆位点两端分别测序，测定插入片段的序列，均获得1512bp的ORF序列。测序结果表明得到CYP3A22和CYP3A46基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。
[0047]1.2pFastBac-CYP3A22, pFastBac-CYP3A46 的构建
[0048]以1.1中得到的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒为模板进行PCR反应获得CYP3A22和CYP3A46基因片段，并引入SalI和BamHI两个酶切位点(下划线标示)，如此可通过酶切、连接与pFastBac载体连接。PCR引物如下:
[0049]SEQ ID No: 7CYP3A22 h.游引物 GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT
[0050]SEQ ID No:8CYP3A22 下游引物
[0051 ] ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC;
[0052]SEQ ID No: 9CYP3A46 h.游引物 GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC
[0053]SEQ ID No: 10CYP3A46 上游引物
[0054]ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC
[0055]PCR的反应体系(50 μ I)和过程:
[0056]
【权利要求】
1.一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (I)以巴马小型猪的肝cDNA为模板，通过设计CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，获得巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1、SEQ IDNo: 2所示，将该基因片段添A后与pMD18-T连接得pMD18_T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒，再将其转入大肠杆菌疋cWi DH5a感受态细胞进行质粒扩增； 所述引物序列如下: SEQ ID No:3 CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTT， SEQ ID No:4 CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTC， SEQ ID No:5 CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTT， SEQ ID No:6 CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC ; (2 )以获得的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒为模板，通过设计含有BamHI，SAlI两个酶切位点的特定引物，获得两端含特定酶切位点的巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，Sail两个酶进行双酶切得到CYP3A22、CYP3A46两个基因片段； 引物序列如下:
SEQ ID No:7 CYP3A22 h.游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT, SEQ ID No:8 CYP3A22下游引物:ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC, SEQ ID No:9 CYP3A46 h游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC,
SEQ ID No: 10 CYP3A46 h游引物:ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC ； (3)将载体质粒pFastBacl也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述两个基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将CYP3A22、CYP3A46基因片段与载体片段连接，构建 pFastBac-CT/^^^，pFastBac-CT/^4必两种质粒； (4)再将质粒转化入疋co7iDH10Bac感受态细胞进行转座，获得Bacmi和^>acmid-CYP3A46 重组粘粒； (5)将重组粘粒别转染草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)，获得重组病毒V-CYP3A22和V-CYP3A46,再分别将以上两种重组病毒与v-CYPOR和v_CYPb5共感染Sf9细胞，即在细胞内高表达CYP3A22和CYP3A46重组蛋白；通过Western Bolt验证重组蛋白的表达，通过CYP3A经典底物睾酮和咪达唑仑验证CYP3A22和CYP3A46活性。
2.根据权利要求1构建的所述的一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶在药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现:(1)以研究药物作为底物，分别与PCYP3A22/46孵育，检测该药物经pCYP3A22/46代谢生成的代谢产物种类及相对含量，将该结果与hCYP3A4/5的结果进行比较，若生成的主要代谢产物和相对含量较为一致，则小型猪与人CYP3A代谢该药物的代谢物谱相似；(2)将系列浓度的研究药物分别与PCYP3A22/46孵育，绘制酶动力学曲线，通过GraphPad Prism5软件计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax、和内在代谢清除率Clint的酶动力学参数，将所得结果与hCYP3A4/5的结果进行比较，若软件拟合所得的酶动力学参数相近，则说明小型猪与人CYP3A对该药物的亲和力和转化速率相近；综合以上结果，小型猪与人CYP3A对该药物的代谢特性相近，则推断该药物的药代动力学研究适合选用小型猪作为实验动物模型。
【文档编号】C12N15/53GK103468722SQ201310405336
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月8日 优先权日:2013年9月8日
【发明者】边诣聪, 魏泓, 余露山, 商海涛, 曾苏, 郭科男, 马利萍, 刘宇, 郑小丽, 姚青青 申请人:浙江大学, 中国人民解放军第三军医大学