一种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法，可以用较少的时间，简便地从样品中获得高纯度的目标成分，减少检测结果中的干扰峰；同时又能在不影响检测效果的前提下，减少检测所需的样品量以及其它试剂的用量，从而降低核酸序列分析中的成本，有较高的应用价值。
【专利说明】—种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法。
【背景技术】
[0002]在核酸序列分析中，聚合酶链式反应被广泛应用于各种核酸测序仪平台。经聚合酶链式反应之后获得的样品成分复杂，在用0嫩测序仪检测前必须进行纯化，并且纯化的效果对于最终的检测效果极为重要。目前广泛采用的乙醇沉淀法，通过向样品溶液中加入乙醇，经沉淀，离心后实现样品中目标成分与杂质成分分离。该方法比较难获得纯度很高的样品中的目标成分，检测结果中容易出现干扰峰；操作繁琐，耗时；需要大量人工操作，难以实现自动化。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法，可以用较少的时间，简便地从样品中获得高纯度的目标成分，减少检测结果中的干扰峰；同时又能在不影响检测效果的前提下，减少检测所需的样品量以及其它试剂的用量，从而降低核酸测序的成本。
[0004]本发明提供了一种应用于核酸序列分析中的样品前处理方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
(1)将用功能基团改性的纳米磁珠溶液分散于待纯化的样品溶液中并混合均匀，在室温下培育5分钟；
(2)将混合溶液放置于磁力装置上2-3分钟；
(3)用移液器将混合溶液中的液体吸干后，再加入乙醇的水溶液，在室温下培育30秒，再将混合溶液中的液体吸干；
(4)再重复第3步1次；
(5)撤去磁力装置，向吸干液体的混合溶液剩余物中加入缓冲液，再混合均匀；
(6)将混合溶液放置于磁力装置上1分钟后，将混合溶液中的上清液吸取出来，可以直接在核酸序列分析仪上进行检测。
[0005]所述的方法中，用功能基团改性的纳米磁珠溶液与待纯化的样品溶液中的体积比为1:1-3:1,用功能基团改性的纳米磁珠溶液的浓度为101118/1^-1001118/1^。磁珠的直径为50-800纳米，磁珠的组分和重量含量百分比为:氧化钆20-50%，四氧化三铁20-40%，二氧化硅:10-60%。乙醇水溶液的体积浓度为50%-95%。
[0006]所述的磁力装置的磁场强度为0.1-1特斯拉。
[0007]所述的缓冲液的主要成分为水，三羟甲基氨基甲烷和氯化氢；三羟甲基氨基甲烷和氯化氢的摩尔比为1 ；1，邱值在7-9，浓度为0.005-0.0511101/1。操作过程中，加入缓冲液与待纯化的样品溶液的体积比1:2-1:4。
[0008]所述的待纯化样品为经过聚合酶链式反应或者测序反应之后获得的样品。测序前的聚合酶链式$(?)反应体系参见各种用于核酸序列分析的聚合酶链式$(?)反应体系，以八81公司的81^76 ^3.1体系为例，聚合酶链式反应体系(10 1x1反应体系)的成分为:0.5 —4此0？ 81^76反应混合物，0-3 1x1的2丨5乂缓冲溶液，10卿01弓丨物，50-500叩的0嫩模板，加入去离子蒸懼水至10此。
[0009]本发明操作简便，可以用较少的时间，简便地从样品中获得高纯度的目标成分，减少检测结果中的干扰峰；同时又能在不影响检测效果的前提下，减少检测所需的样品量以及其它试剂的用量，从而降低核酸测序的成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1.反应体系的体积为5沿，使用0.5耵81^76 ^3.1进行反应，反应产物用乙醇沉淀法进行纯化的核酸片断检测图，采用八卯116(1 0108781:61118公司的3730X1核酸序列分析仪进行分析。
[0011]图2.反应体系的体积为5沿，使用0.125沿81^76 ^3.1进行反应，反应产物用本发明中的方法进行纯化的核酸片断检测图，采用八卯116(1 0108781:61118公司的3730X1核酸序列分析仪进行分析。
【具体实施方式】
[0012]通过下述实施例有助于进一步理解本发明，但并不限制发明的内容。
[0013]具体实施中采用八卯116(1 8108781:61118公司的81^76 ^3.1试剂盒，进行聚合酶链式反应，结果用八卯116(1 0108781:61118公司的3730核酸序列分析仪进行分析。
[0014]实施例1对照实验
按照八卯116(1 0108781:61118公司的81^76末端染色系统的操作要求，5)^1反应体系中应加入0.5 1^1 81^1)76 (八卯116(1 8108781:61118公司的试剂)，2卿01引物〈5’ -161^^06^06600^61)，50叩的0嫩模板(普洛麦格公司，113^18重组噬菌体然后直接用去离子蒸馏水稀释至5叱，进行反应，用乙醇沉淀法纯化后，再用0嫩测序仪进行检测，作为对照实验。
[0015]反应的条件为:在75 0条件下预热3分钟；45个循环，每个循环包括:95 0变性10秒，50 0退火20秒，60 0延伸4分钟。
[0016]乙醇沉淀法的具体步骤如下:
(1)向待纯化的聚合酶链式反应产物中加入150沿混合溶液(1-丁醇:无水乙醇，35%:65^,/^)；
(2)用移液枪吸入压出混合，确保反应产物完全分散在混合溶液中；
(3)室温下离心30分钟，离心力为3500吨；
(4)将卩⑶板倒扣在净化无尘滤纸上除去上清液；
(5)将？⑶板翻转后放回离心机，室温下离心1分钟，离心力为500(父邑)；
(6)加入150耵洗液，洗液成分为:65%无水乙醇:35%0.1禮(乙二胺基四乙酸)，室温下离心10分钟，离心力为3，500 ( X 0 ；再将板倒扣在净化无尘纸上除去上清液；
(7)将步骤6和步骤？重复操作一次； (8)将？⑶板放回离心机，室温下离心1分钟，离心力为500(父邑)；
(9)干燥后，用上样缓冲液0嫩II(八卯11也6！11公司)重新溶解，即可进行分析。
[0017]结果见附图1。
[0018]实施例2，将实施例1中的反应体系各组分的量降低到1/4，即5叱反应体系中应加入0.125 1^1 81^1)76 (八卯116(1 8108781:61118公司的试剂)，0.4卿01引物〈5’ -161^^06^06600^61)，12.5叩的0嫩模板(普洛麦格公司，肌3卹18重组噬菌体然后直接用去离子蒸馏水稀释至5叱，进行聚合酶链式反应后采用本发明的方法进行纯化，再用0嫩测序仪进行检测。
[0019]？?:！？反应的条件与实施例1中的反应条件相同。
[0020]本实施例中的纳米磁珠溶液制备方法如下:
^0.0511101/1^56(:12^^501111, 0.111101/1 的？6?:13 溶液 50?[和 0.111101/1 的(^(勵3〉3
溶液50此混合均匀，加热至801，再向溶液中缓慢加入50此0.7^1/1的氢氧化钠溶液。搅拌30分钟后，将上述混合溶液加入到5001 0.5001/1正硅酸钠溶液与5.84^1 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，再向混合溶液中加入0.018磺酸钠，用此1溶液将邱值调节至6.0，待液体成为凝胶后，在2001的烘箱中干燥6小时，所得样品粉碎后用去离子蒸馏水洗涤3次。再将所得的样品粉末加入到5此水和300此甲醇的混合溶液中，与150此甘油混合后，用超声波处理30分钟。然后将混合溶液加热至851搅拌3小时。冷却后，用磁力装置将反应体系中的颗粒物质吸附到反应容器壁，将液体吸干后，移走磁力装置，加入10001去离子蒸馏水搅拌后，再用磁力装置将反应体系中的颗粒物质吸附到反应容器壁，将其余液体吸干。最后加入50“ 3%丙二醛磷酸缓冲盐溶液，磷酸缓冲盐的浓度为0.1001/1,邱值为7.4),室温下放置2小时即可使用。
[0021]本发明中的纯化方法的操作程序如下:
(1)将纳米磁珠溶液9叱分散于待纯化的样品溶液中并混合均匀，在室温下培育5分钟；
(2)将混合溶液放置于磁力装置上2-3分钟；
(3)用移液器将混合溶液中的液体吸干后，再加入150虬乙醇的水溶液(7090,在室温下培育30秒，再将混合溶液中的液体吸干；
(4)再重复第3步1次；
(5)撤去磁力装置，向吸干液体的混合溶液剩余物中加入
0.05001/1,邱8.0),再混合均勻；
(6)将混合溶液放置于磁力装置上1分钟后，将混合溶液中的上清液吸取出来，转移到新板中即可直接在核酸序列分析仪上进行检测。
[0022]结果见附图2。
[0023]对比检测结果可发现，采用本发明所述方法，将核酸序列分析中各组分的用量降低50%以上，获得的检测结果也能达到甚至超过采用乙醇沉淀法进行样品处理所获得的检测结果。
【权利要求】
1.一种应用于核酸序列分析中的样品前处理方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)将用功能基团改性的纳米磁珠溶液分散于待纯化的样品溶液中并混合均匀，在室温下培育5分钟； (2)将混合溶液放置于磁力装置上2-3分钟； (3)用移液器将混合溶液中的液体吸干后，再加入乙醇的水溶液，在室温下培育30秒，再将混合溶液中的液体吸干； (4)再重复第3步I次； (5)撤去磁力装置，向吸干液体的混合溶液剩余物中加入缓冲液，再混合均匀； (6)将混合溶液放置于磁力装置上I分钟后，将混合溶液中的上清液吸取出来，可以直接在核酸序列分析仪上进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中用功能基团改性的纳米磁珠溶液与待纯化的样品溶液中的体积比为1:1-3:1，用功能基团改性的纳米磁珠溶液的浓度为 lOmg/mL-lOOmg/mLo
3.磁珠的直径为50-500纳米，磁珠的组分和重量含量百分比为:氧化钆20-50%，四氧化三铁20-40%，二氧化硅:10-60%。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，磁力装置的磁场强度为0.1-1特斯拉。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，乙醇水溶液的体积浓度为50%-95%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，加入缓冲液与待纯化的样品溶液的体积比1:2-1:4，缓冲液的主要成分为水，三羟甲基氨基甲烷和氯化氢；三羟甲基氨基甲烷和氯化氢的摩尔比为I ;1，ρΗ值在7-9，浓度为0.005-0.05mol/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，核酸序列分析仪是指ABI.310，3100，3730 或 3730XL DNA 测序仪，Illumina HiSeq 1000，HiSeq 2000，HiSeq.2500, HiSeq 3000,或 MySeq DNA 测序仪，Megbase 1000 DNA 测序仪。
【文档编号】C12Q1/68GK104419760SQ201310405339
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月7日 优先权日:2013年9月7日
【发明者】不公告发明人 申请人:上海毕欧桥生物科技有限公司