肠炎沙门氏菌双基因敲除减毒突变株及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种肠炎沙门氏菌双基因敲除减毒突变株及其制备与应用。本发明的肠炎沙门氏菌减毒突变株，为将肠炎沙门氏菌C50041的crp基因及spiC基因敲除后获得。本发明还进一步公开了所述肠炎沙门氏菌减毒突变株的制备方法与用途。本发明实现了对肠炎沙门氏菌减毒菌株进一步减毒。为研制肠炎沙门氏菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。
【专利说明】肠炎沙门氏菌双基因敲除减毒突变株及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体涉及一种肠炎沙门氏菌双基因敲除减毒突变株及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]沙门菌是一种重要的食源性人兽共患细菌病的致病菌，是研究最为广泛和深入的细菌之一，其中肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌两种血清型在许多发达国家占主导，在家禽，肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌被认为是最重要的两种血清型。沙门菌可引起禽类的无症状隐性感染，但是在小于两周龄的幼雏，有引起高致死率和全身系统性感染的爆发的可能。肠炎沙门菌对禽类制品的污染，长久以来是其进入人食物链的主要污染源。且鸡盲肠携带沙门菌是一个很重要的祸源，因为它可以导致水平感染，经粪便污染蛋壳，在屠宰期间污染肉制品，而且可能污染卵巢。
[0003]国内常采用药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系列问题。最近几年，许多国家逐渐转向使用疫苗预防来控制沙门氏菌病，取得了很好的效果，近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的新型减毒沙门菌作疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，活疫苗可在免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应，可对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，比灭活·疫苗和亚单位疫苗在预防控制沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。
[0004]已有学者采用转座子随机插入法鉴定了一些鸡白痢沙门氏菌毒力相关基因功能的研究(耿士忠，焦新安，陈晓娟，潘志明，张辉，陈祥，鸡白痢沙门氏菌Min1-Tn5转座子插入突变[J]，畜牧兽医学报，2008，39(5):621-626) ；Red同源重组法和高效重组自杀之列法应用于基因敲除与基因替换，得到了广泛应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种肠炎沙门氏菌减毒突变株及其制备与应用。
[0006]本发明首先提供了一种肠炎沙门氏菌减毒突变株，为将肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis) C50041 的 crp 基因及 spiC 基因敲除后获得。
[0007]野生型肠炎沙门氏菌C50041的crp基因的阅读框序列为SEQ ID NO:1。
[0008]进一步的，如实施例具体列举的，野生型肠炎沙门氏菌C50041的crp基因中序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段被缺失，替换成了序列为SEQ ID N0:3的多核苷酸片段。
[0009]SEQ ID NO:2 中 626_637bp 部分 ttccgtcagaat 为非编码区序列。
[0010]野生型肠炎沙门氏菌C50041的spiC基因序列的完整阅读框为如SEQ ID NO:4 ；在本发明实施例中，上述crp和spiC基因序列被完整缺失。
[0011]进一步的，如实施例具体列举，野生型肠炎沙门氏菌C50041的spiC基因中，序列为SEQ ID NO:5的多核苷酸片段被缺失，替换成了序列为SEQ ID NO:6的多核苷酸片段。[0012]SEQ ID NO: 5 中 35_418bp 为 spiC 完整阅读框。
[0013]进一步的，为便于筛选，本发明的肠炎沙门氏菌减毒突变株在spiC基因完整阅读框缺失处插入抗性基因，如卡那霉素抗性基因。更为精确的，如本发明实施例列举，可在野生型C50041的spiC基因的完整阅读框缺失处插入卡那霉素抗性基因。该肠炎沙门氏菌减毒突变株具有卡那霉素抗性。
[0014]进一步的，所述卡那霉素抗性基因的序列为SEQ ID N0:6。
[0015]本发明进一步提供了所述肠炎沙门氏菌减毒突变株的构建方法，包括下列步骤:
[0016]I)以肠炎沙门氏菌C50041为出发菌株，经采用Red同源重组法将肠炎沙门氏菌crp基因敲除，获得突变株Λ C50041 (crp)；
[0017]2)用重组自杀质粒方法敲除突变株Λ C50041 (crp)的spiC基因并插入卡那霉素抗性基因，获得变株AC50041(crp，spiC/Km)即为本发明的肠炎沙门氏菌减毒突变株。
[0018]进一步的,步骤I)中，采用Red同源重组法,将野生型肠炎沙门氏菌C50041的crp基因中序列为SEQ ID NO: 2的多核苷酸片段替换成了序列为SEQ ID NO: 3的多核苷酸片段。
[0019]进一步的，步骤2)中，采用重组自杀质粒方法,将突变株Λ C50041 (crp)的spiC基因中序列为SEQ ID NO:5的多核苷酸片段重组替换为序列为SEQ ID N0:6的卡那霉素抗性基因。
[0020]步骤2)具体包括下列步骤:
[0021 ] a)从肠炎沙门菌C50041基因组中扩增出spiC基因的上下游同源臂spiC12和spiC34片段；将获得的spi C12和spiC34片段分别T克隆构建到pMD18-T载体，得到pMD-spiC12,和 pMD-spiC34 ；
[0022]b)将步骤a)获得的pMD-spiC12和pMD_spiC34用Hind III和XhoI分别双酶切，回收pMD-spiC12和spiC34，将两回收产物连接，构建质粒pMD-AspiC ;( AspiC为spiC12和spiC34的拼接片段)
[0023]c)将步骤b获得的重组质粒的spiC12和spiC34片段之间插入Km抗性基因，构建质粒pMD-Λ spiC/Km，用BamH I单酶切酶切获得两端分别为spiC基因的上下游同源臂spiC12和spiC34片段，中间为Km抗性基因的重组片段；
[0024]d)将步骤c获得的重组片段克隆入自杀性质粒PGMB151，获得重组自杀性质粒PGMB151 Δ spiC/Km (保存于 E.coli Spy372)；
[0025]e)将步骤d获得的重组自杀性质粒转化入合适的宿主E.coli x 7213作为供体菌，以步骤I)获得的突变株Λ C50041(crp)为受体菌进行接合转移与重组，利用抗性和蔗糖敏感性筛选获得突变株Λ C50041 (crp, spiC/Km)。
[0026]本发明进一步公开了本发明的肠炎沙门氏菌减毒突变株在制备禽类肠炎沙门氏菌病的活疫苗上的用途。
[0027]所述禽类肠炎沙门氏菌病为鸡肠炎沙门氏菌病。
[0028]本发明还公开了一种鸡肠炎沙门氏菌病疫苗，包括本发明的肠炎沙门氏菌减毒突变株。
[0029]所述疫苗中还可进一步包括佐剂。
[0030]本发明实现对肠炎沙门氏菌减毒菌株进一步减毒。为研制肠炎沙门氏菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1.spiC基因的PCR扩增产物电泳图谱。
[0032]M:DL2000bp DNA marker ；
[0033]1、2:为菌株C50041spiC基因的PCR扩增结果。
[0034]图2.质粒pMD-spiC12，pMD_spiC34酶切鉴定电泳图谱。
[0035]Ml:DNA marker ( λ -EcoT14)；
[0036]M2:DL2000DNA marker ；
[0037]l_2:pMD_spiC12 质粒用 EcoR 1、Xho I 酶切的条带:3_4:pMD_spiC34 质粒釆用BamH I酶切的条带。
[0038]图3.重组质粒pMD- Δ spiC酶切鉴定电泳图谱。
[0039]M:DNA marker ( λ -EcoT14)
[0040]Lane 1-2:质粒 pMD- Δ spiC 用 Xho I 酶切的条带。
[0041]图4.重组质·粒pMD- Δ spiC/Km酶切鉴定电泳图谱。
[0042]M:DNA marker ( λ -EcoT14)；
[0043]1-4: Plasmid pMD- Δ spiC/Km 米用 Xho I 酶切的条带；
[0044]5_8:Plasmid pMD- Δ spiC/Km 用 BamH I 酶切的条带。
[0045]图5.重组pGMB151_ASpiC/Km的酶切鉴定电泳图谱。
[0046]M:DNA marker ( λ -EcoT14)；
[0047]l_3:Plasmid pGMB151-Λ spiC/Km 用 BamH I 酶切的条带。
[0048]图6.pMD-crpU 质粒图。
[0049]图7.pMD-crpD 质粒图。
[0050]图8.pMD- Δ crp 质粒图。
[0051 ]图 9.pMD- Δ crp/Cm 质粒图。
[0052]图10.打靶片段PCR扩增电泳图，
[0053]M:DL2000marker, I:crp-YZ-F/R 引物扩增片段。
[0054]图11.crp-U-F/R、crp-D-F/R 引物验证图
[0055]M:DL2000marker，1，5:阴性对照，2，3:转化子crp-U引物验证，6，7:转化子crp-D-F/R 引物验证，4，8:C50041 (WT)阳性对照。
[0056]图12.crp-YZ-F/R 引物验证图
[0057]M:DL2000marker, I, 2:转化子 crp-yz-F/R 验证图，3:C50041 (WT)阳性对照。
[0058]图13.去除抗性基因后crp-YZ-F/R引物PCR验证图
[0059]M:DL2000maker, 1，2，3，4: Δ C50041 (crp)。
[0060]图14.Δ C50041 (crp，spiC/Km) PCR 鉴定结果电泳图谱
[0061]M:DL2000bp DNA marker ；
[0062]1-2:C50041 野生型；
[0063]3-5: Δ C50041 (crp，spiC/Km)用引物Λ spiC-YZ - F/R。
[0064]图15.Δ C50041 (crp, spiC/Km) PCR 鉴定结果电泳图谱；
[0065]M:DL20001adder ;1_4: Δ C50041 (crp, spiC/Km)用引物Λ crp-YZ-F/R。[0066]图16.细菌在肝脏中的持续带菌情况。
[0067]图17.细菌在脾脏中的持续带菌情况。
[0068]图18.免疫试验结果。
[0069]左图为突变株AC50041 (crp, spiC/Km)免疫试验结果
[0070]右图为对照PBS免疫试验结果。
【具体实施方式】
[0071]本发明的肠炎沙门氏菌减毒突变株的具体的构建方法是:将spiC上下游序列分别连接到卡那霉素抗性基因(KmR)两端，将连接片段构建至自杀质粒PGMB151，经接合转移导入肠炎沙门氏菌Λ C50041 (crp)，伤寒沙门氏菌spiC基因部分缺失并于其中插入KmR，获得抗卡那霉素的转化子命名为Λ C50041(crp，spiC/Km)。以I日龄海兰白雏鸡为模型，t匕较基因缺失突变株与野生株之间毒力的差异，致死率试验结果表明，Λ C50041(crp，spiC/Km)突变株的毒力显著低于野生型C50041，是潜在的肠炎沙门氏菌减毒候选活疫苗。
[0072]本发明中所说的C50041，是指保藏编号为CMCC50041。保藏单位中国医学微生物菌种保藏管理中心。
[0073]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0074]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何 一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0075]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本【技术领域】常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ;the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METHODS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0076]实施例1
[0077]C50041基因突变株的构建
[0078]C50041来源:中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CMCC50041[0079]1.C50041 的鉴定:
[0080]1.1.细菌鉴定
[0081]1.1.1染色镜检革兰氏法染色后，普通光学显微镜下观察菌体形态、测量细菌大小。革兰氏染色结果显示镜检可观察到散在排列的红色短小直杆菌，大小约为Iy mX4ym。
[0082]1.1.2生化试验
[0083]挑取纯培养的单菌落接种生化鉴定管，37°C培养24h后观察结果。
[0084]2.C50041基因突变株的构建
[0085]2.1靶基因序列测定
[0086]2.1.1靶基因的扩增
[0087]根据GenBank上已发表的沙门菌基因组序列,用引物设计软件Primer5.0设计出特异性的引物，如表2所示。以肠炎沙门菌C50041基因组DNA为模板，PCR方法扩增spiC。50 μ I PCR扩增体系如表1:
[0088]表1，spiC基因PCR扩增体系
【权利要求】
1.一种肠炎沙门氏菌减毒突变株，为将肠炎沙门氏菌C50041的crp基因及SpiC基因尚支除后获得。
2.如权利要求1所述肠炎沙门氏菌减毒突变株，其特征在于，所述肠炎沙门氏菌减毒突变株的基因组中，肠炎沙门氏菌C50041的crp基因中序列为SEQ ID N0:2的多核苷酸片段被缺失，替换成了序列为SEQ ID N0:3的多核苷酸片段；同时，所述肠炎沙门氏菌C50041的spiC基因中序列为SEQ ID NO:5的多核苷酸片段被缺失重组替换为序列为SEQ ID NO:6的卡那霉素抗性基因。
3.如权利要求1所述肠炎沙门氏菌减毒突变株的构建方法，包括下列步骤: 1)以肠炎沙门氏菌C50041为出发菌株，经采用Red同源重组法将肠炎沙门氏菌crp基因敲除，获得突变株Λ C50041 (crp)； 2)用重组自杀质粒方法敲除突变株ΛC50041 (crp)的spiC基因并插入卡那霉素抗性基因，获得变株AC50041(crp，spiC/Km)即为所述肠炎沙门氏菌减毒突变株。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤I)中，采用Red同源重组法，将野生型肠炎沙门氏菌C50041的crp基因中序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段替换成了序列为SEQ ID NO:3的多核苷酸片段。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中，采用重组自杀质粒方法，将突变株Λ C50041 (crp)的spiC基因中序列为SEQ ID NO: 5的多核苷酸片段恰好重组替换为序列为SEQ ID NO:6的卡那霉素抗性基因。
6.如权利要求1-3任一权利要求所述的肠炎沙门氏菌减毒突变株在制备禽类肠炎沙门氏菌病的活疫苗上的用途。
7.如权利要求，6所述的用途，其特征在于，所述禽类肠炎沙门氏菌病为鸡肠炎沙门氏菌病。
8.一种鸡肠炎沙门氏菌病疫苗，包括权利要求1-3任一权利要求所述的肠炎沙门氏菌减毒突变株。
【文档编号】C12N1/21GK103436478SQ201310405101
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】焦新安, 耿士忠, 李宝利, 潘志明, 陈祥, 孙林 申请人:扬州大学