一种通过非流失共价结合将酶结合于电极的无介体电化学葡萄糖检测过程及其产品的制作方法

一种通过非流失共价结合将酶结合于电极的无介体电化学葡萄糖检测过程及其产品的制作方法
【专利摘要】本发明总体涉及通过在胺功能化电极上共价结合葡萄糖氧化酶以开发葡萄糖氧化酶结合电极的仪器和方法。更具体的，本发明涉及用于连续葡萄糖监测的无渗漏以及高稳定的共价结合酶包被电极。所述葡萄糖氧化酶结合电极用于开发不受生物物质和药物影响的非介体电化学葡萄糖传感程序。
【专利说明】一种通过非流失共价结合将酶结合于电极的无介体电化学 葡萄糖检测过程及其产品
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年月3日提交的序列号No. 61/641，886,名称为"一种通过非流 失共价结合将酶结合于电极的无介体电化学葡萄糖检测过程及其产品"的美国临时专利申 请的优先权并且是该申请的一个非临时转换，通过整体引用的方式将其并入本申请。

【技术领域】
[0003] 本文总体涉及通过利用在胺功能化电极（amine-functionalized electrodes)上 共价结合葡萄糖氧化酶以开发葡萄糖氧化酶结合电极的仪器和方法。更具体的，共价结合 酶包被电极（covalently-bound enzyme-coated electrodes)被用于开发没有生物物质和 药物干扰的无介体（mediator-less)电化学葡萄糖检测程序。
[0004] 本文也涉及开发一种制造用于葡萄糖的无介体电化学检测的稳定的和非渗漏 (leach-proof)的葡萄糖氧化酶结合电极的高度简化的过程。所述开发的技术可以应用于 高稳定性连续葡萄糖监测（CGM)系统，葡萄糖计或用于糖尿病检测的封闭系统。在一种实 施方式中，所述开发的葡萄糖检测方案采用所设计的酶结合电极可以应用于或者部分来自 于一个连续葡萄糖监测系统（CGMS)。
[0005] 本文进一步涉及开发一种以双酶为基础的无介体电化学（EC)葡萄糖检测技术 以及检测过程。所开发的葡萄糖检测技术具有宽的动态幅度以及增加的灵敏性。所开发 的葡萄糖检测技术可以用于血液葡萄糖监测仪器（BGMD's)，即一个连续葡萄糖检测系统 (CGMS)，葡萄糖计或封闭系统。两种酶的使用，即葡萄糖氧化酶（GOx)以及辣根过氧化物酶 (HRP)，消除了葡萄糖测定的氧限制，从而增加了葡萄糖检测的动态幅度。

【背景技术】
[0006] 糖尿病已经全球流行并且是所有国家的主要关切。每年用于处理糖尿病的花费 占全球健康护理支出总额的11. 2%，是无法承受的经济负担。该疾病正以令人担忧的速度 增长。糖尿病患者血糖的监测因而是最主要的诊断测试，具有每年超过167亿次测试以及 年 61 亿美元的市场（http://www. researchandmarkets. com/reports/338842)。市场目前 主要由例如Abbott、Bayer、Roch、LifeScan、Dexcom和Minimed这样的大公司服务。一名 糖尿病人不得不每天以频繁的周期监测其葡萄糖水平以将葡萄糖水平控制在生理范围内 从而避免糖尿病综合症。血糖监测结果有大量问题，本发明的发明人打算进行阐述。首先 是测量软片有限的耐久性，基本上购买后只是用一次。其次，如已经在某些商品化产品中 观察到的，在葡萄糖测量中测量系统中特异性电子介体可以引起潜在的致命错误。随之而 来是在2009年FDA的公共健康通知后厂商迅速召回这些商品化产(http：//www. fda. gov/ MedicalDevices/Safety/AlertsandNotices/PubIicHealthNotifications/ucm 176992. htm)
[0007] 然而，介体仍然被使用于葡萄糖计中，并且一些报道证实了来自于生理物质和用 药的干扰（DiabeticMedicine，D0I:10·llll/j·1464-5491·2011·03362·x;Am·J·Clin· Pathol. 113, 75-86, 2000 ;more ref. s)。相似的，使用阳性外加电压例如0. 4V与参比电极 相对在许多葡萄糖计中可以引起相似的葡萄糖估算的错误，这是由于许多生理物质和药物 有300至700mV的氧化还原电位。
[0008] 已经有多种技术被应用于葡萄糖的检测，包括电化学技术，电化学技术已经被几 乎所有公司使用从而制造 BFMD。然而许多其他葡萄糖检测概念，例如那些以非侵入性葡萄 糖监测为基础的葡萄糖检测概念（Diab. Res. Clin. Prac. 77, 16-40, 2007)已经被指出。美 国Cygnus的GlucoWatch Biographer是已经被FDA批准的系统，该系统基于反向电离子 透入法（reverse iontophoresis)经皮肤提取间质液，由于其准确性差、虚报、皮肤刺激、出 汗、和长加热时间而被市场放弃因此被迅速被淘汰。相似的，来自BICO公司的Diasensor 以及来自Pendragon医疗有限公司的Pendra也由于市场对它们的准确性的强烈担忧而被 淘汰。尽管进行了显著的研宄努力，仍然没有可使用的可靠的非侵入性的BGMD。
[0009] 葡萄糖的非酶检测也已经被证明，许多成果只用纳米材料，这包括被多次引用的 Pi 团队的结果(Electrochemistry Communications 6, 66-70, 2004 ；Electroanalysis 17, 89-96, 2005 ；Nano techno logy 17, 2334-2339, 2006 ；Analytica Chimica Acta 594, 175-183, 2007)，然而该方法也因为检测血清中葡萄糖浓度的整体病理范围的选择性、 可信度以及生物分析过程的再现性而失败。
[0010] 概要
[0011] 根据本申请的一个方面包括电化学（EC)葡萄糖生物传感器，所述电化学生物传 感器是无介体的并且应用负电位对应基准电极（reference electrode)，这使得该仪器在 葡萄糖检测中不受生理干扰、传感、测量、和/或读取，并且考虑到了患者服用的药物。更具 体的，利用诸如石墨烯或多壁碳纳米管（MWCNTs)的第二底物可以避免使用介体，这是由于 石墨烯和MWCNTs具有优异的导电性并且可以作为电线在酶的还原中心、葡萄糖氧化酶和 电极表面之间促进直接的电子传递。由于其大的表面积例如石墨烯的第二底物或电极上的 其他第二底物提供电化学信号，这提高了葡萄糖检测的敏感性。
[0012] 根据本发明的相关方面，公开了一个用于制备共价偶联非渗漏葡萄糖氧化酶包 被的电极的生物分析程序以及一个使用-450mv外加电势的，用于连续葡萄糖监测的非 介体电化学葡萄糖传感方案。更具体的，所开发的技术能够在人的病理-生理性音域 (patho-physiological range)即0.5-32mM检测葡萄糖，而没有任何暴露的电极或来自生 理底物/药物的生物污垢（biofouling)。当连续的将一个相同的电极用于检测一个特定葡 萄糖浓度至少4周后，没有显著的葡萄糖监测信号的减少。因此，所设计的方案可以用于开 发一个连续葡萄糖检测系统（CGMS)。
[0013] 根据本发明的一个更进一步的方面，本文所述的所开发的技术克服了我们在新的 综合评述中提出的的现有技术的问题，即"Technology behind commercial devices for blood glucose monitoring in diabetic management:A review^in Analytica Chimica Acta(2011), volume 703, pp. 124-136,将其通过整体引用的方式并入本文。
[0014] 根据本发明的另一个方面，所述开发的技术不仅仅用于开发CGMS仪器，也应用了 一个用于其它被分析物的电化学检测的制备共价偶联酶包被电极的标准方案。因此，所述 开发的技术可以用于发展以酶为基础的电化学传感器。
[0015] 所开发的无介体电化学葡萄糖传感技术具有用于发展CGMS的广阔的潜力，基于 其更宽的动态范围，使用负外加点位以及缺少来自于生理干扰物的潜在干扰。多所开发的 方案的多种变形已经被用于设计许多用于葡萄糖检测的方案。此外，如前所述的，所开发的 方案实现了可以用于制备检测其他分析物的共价结合酶包被电极的标准方案。
[0016] 再者，或者作为前述的实施方式的替代，本发明的实施方式可以为修改的方案，使 用多种纳米材料作为第二底物，例如石墨烯纳米板（GNPs)，多壁碳纳米管（MWCNTs)以及聚 左旋赖氨酸（PLL)。该方案可以在多种不同形式的纳米材料中应用。因此，可以制造多种纳 米复合物并用于电化学血糖传感。
[0017] 本发明开发了一种高度简化的程序，该程序使得能够制备高度稳定和非渗漏 (leach proof)葡萄糖氧化酶结合电极。所开发的酶结合电极具有宽的0.5-48mM的动态范 围，当在环境条件下室温储存约四周后没有任何葡萄糖传感信号的降低。即使在血液样品 中保存5天后也没有发现生物污垢。此外，所述应用于使用所开发的酶结合电极进行葡萄 糖检测的电化学方案是非介体的并且使用_450mV作为外加电势（applied potential)，因 此，没有生理性物质的干扰，而这正是开发商业化血糖计的关键点。所开发的用于制备酶结 合电极的程序以及开发的电化学葡萄糖传感方案的目的是开发一种CGMS、葡萄糖计或用于 糖尿病监测的封闭系统，它们可以容易的转换或转换为在工业和临床设备中实践。所开发 的简化的程序使用例如丝网印刷的技术适合于酶结合电极的商业化大规模生产。
[0018] 另外也开发了一种基于双酶的非介体EC葡萄糖传感程序，其具有用于葡萄糖检 测的宽的动态范围和增加的灵敏度。使用具有GOx的HRP消除了 EC葡萄糖传感中的氧限 制，由于其减少了过氧化氢，通过将葡萄糖转化为葡萄糖内酯，产生水和氧气。然而，在通过 所开发的技术制备的酶包被电极中，减少的过氧化氢将显著的增强对生物污垢的抵抗。在 没有介体以及使用负外加电势（_450mV)相对于Ag/AgCl基准电极使得开发的葡萄糖传感 程序更不易于受生理物质和药物的影响。所开发的多种方案使用基于双酶非介体EC葡萄 糖传感程序具有宽的动态范围并且覆盖糖尿病临床相关病理-生理范围，例如〇.5-28mM葡 萄糖。因此，所开发的双酶技术具有开发CGMS、葡萄糖计或用于葡萄糖检测的封闭系统的巨 大的潜力。所开发的生物分析程序简单并且可以容易的转换或转换为使用例如丝网印刷的 简单技术商业化大规模生产酶结合电极。
[0019] 本发明的第一个方面提供了一种用于在检测环境中检测被分析物的非介体生物 传感器，所述非介体生物传感器包括：
[0020] 共价结合了功能化试剂的具有电传导化学修饰表面的基底；以及
[0021] 通过共价结合于所述功能化试剂中的一种而与所述表面固定连接的第一酶，一个 化学结合于功能化试剂的多聚体，以及一个化学结合于所述功能化试剂的纳米工程化材 料。
[0022] 其中，非介体生物传感器配制为用于在分析物和第一酶之间指导电子转移 (direct electron transfer)以适于对关联于检测环境的表面施加一个负电势。
[0023] 在【具体实施方式】中，在接近20天的周期中，上述的非介体生物传感器保持基本稳 定的分析物检测能力。
[0024] 在【具体实施方式】中，电传导化学修饰表面负载与功能化试剂共价结合的羟基。
[0025] 在【具体实施方式】中，所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷 (organofunctional alkoxysilane)化合物。在【具体实施方式】中，所述功能化试剂含有一 个有机官能烷氧基硅烷化合物，其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约4% (体积）的 功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在【具体实施方式】中，所述功能 化的试剂中含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物，通过将表面暴露于存在浓度低于约2% (体积）的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在【具体实施方式】中， 所述功能化的试剂中含有有机官能烷氧基硅烷化合物，通过将表面暴露于存在浓度低于约 1%(体积）的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
[0026] 在【具体实施方式】中，所述多聚体包括胺功能化多聚体。在【具体实施方式】中，所述多 聚体包括氨基酸多聚体（例如，聚左旋赖氨酸）和基于葡萄糖胺的多聚体中的一种（如壳 聚糖）。
[0027] 在【具体实施方式】中，纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳纳米管和纳米 晶纤维素 （nanocrystalline cellulose)中的至少一种。
[0028] 在【具体实施方式】中，所述非介体生物传感器进一步包括选择性扩散膜，其在检测 环境下限制第一酶在物质中的暴露。
[0029] 在【具体实施方式】中，所述基底负载有金属（例如，铂、金）以及以碳为基础的材料。 在【具体实施方式】中，所述基底包括玻璃化碳电极。
[0030] 在【具体实施方式】中，除包括生物物种（biological species)和药物代谢产物的被 分析物以外，第一生物分子和第一酶中的一个与被分析物之间的直接电子转移基本上没有 被分子物质（molecular substances)影响。
[0031] 在【具体实施方式】中，第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、 胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。在【具体实施方式】中，所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
[0032] 在【具体实施方式】中，所述非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整个糖尿病病理 浓度范围的葡萄糖。在【具体实施方式】中，所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约 0. 5-32mM的范围的葡萄糖。
[0033] 在【具体实施方式】中，第一酶通过以下方式共价结合于所述表面，将所述表面暴露 于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面暴露于第一酶。
[0034] 在【具体实施方式】中，通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试剂的混合物的液 体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
[0035] 在【具体实施方式】中，通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂的悬浮液的方式 将所述多聚体共价结合于所述表面。
[0036] 在【具体实施方式】中，多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于多聚体的 方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质中。
[0037] 在【具体实施方式】中，纳米工程化材料通过以下共价结合于所述表面，将表面暴露 于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面暴露于携带有纳米工程化材 料的极化分散剂。
[0038] 在【具体实施方式】中，通过将表面暴露于含有纳米工程化材料和功能化试剂的悬浮 液的方式将纳米工程化材料共价结合于所述表面。
[0039] 在【具体实施方式】中，纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于 纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化材料和第一酶的 液体介质中。
[0040] 在【具体实施方式】中，所述非介体生物传感器进一步包括一个第二酶，通过与功能 化试剂、多聚体和纳米工程化材料中的一种共价结合的方式固定于所述表面。
[0041] 在【具体实施方式】中，第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的副产物。在具体 实施方式中，所述第二酶包括辣根过氧化物酶。在【具体实施方式】中，所述第二酶增加动态分 析物检测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
[0042] 在【具体实施方式】中，第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传感器能够在约 0. 5-48mM的浓度范围检测葡萄糖。
[0043] 在【具体实施方式】中，所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、第 一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
[0044] 在【具体实施方式】中，所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、多 聚体、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于多聚体。
[0045] 在【具体实施方式】中，第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、纳米工 程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
[0046] 本发明的第二个方面提供了一种制造非介体生物传感器的方法，所述非介体生物 传感器被配置用于在检测环境下检测被分析物，所述方法包括：
[0047] 提供一个具有电传导化学修饰表面的基底；将功能化试剂结合于表面；以及
[0048] 实施一个固定过程，所述固定过程包括以下过程中的一种：
[0049] (a)将第一酶共价结合于功能化试剂；
[0050] (b)将多聚体共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于多聚体；以及
[0051] (C)将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于纳米工程化 材料，
[0052] 其中所述非介体生物传感器被配置为检测响应负电势在相对于所述检测环境的 表面的应用的被分析物与第一酶之间的直接电子转移。
[0053] 在【具体实施方式】中，提供具有电传导化学修饰表面的基底包括：
[0054] 提供一个具有电传导表面的基底；以及
[0055] 将表面暴露于表面修饰试剂从而所述使得表面携带有羟基。
[0056] 在【具体实施方式】中，功能化试剂包括有机官能烷氧基硅烷化合物。在具体实施方 式中，功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物，其中，通过将表面暴露于存在浓度 低于约4% (体积）的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在具体 实施方式中，所述功能化的试剂中含有有机官能烷氧基硅烷化合物，通过将表面暴露于存 在浓度低于约2%(体积）的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。 在【具体实施方式】中，所述功能化的试剂中含有有机官能烷氧基硅烷化合物，通过将表面暴 露于存在浓度低于约1% (体积）的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价 结合。
[0057] 在【具体实施方式】中，所述多聚体包括胺功能化多聚体。在【具体实施方式】中，所述多 聚体包括氨基酸多聚体、和以葡萄糖胺为基础的多聚体中的一种。
[0058] 在【具体实施方式】中，纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳纳米管和纳米 晶纤维素中的至少一种。
[0059] 在【具体实施方式】中，制造用于在上述检测环境中检测一种被分析物的非介体生物 传感器的方法进一步包括一个选择性扩散膜，所述选择性扩散膜在检测环境下限制第一酶 在物质中的暴露。
[0060] 在【具体实施方式】中，所述基底携带金属和以碳为基础的材料中的一种，在具体实 施方式中，所述基底含有一个玻璃质碳电极（glassy caron electrode)。
[0061] 在【具体实施方式】中，除含有生物物种（biological species)和药物代谢产物的被 分析物以外，被分析物和第一酶之间的直接电子转移基本上没有被分子物质影响。
[0062] 在【具体实施方式】中，第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、 胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。在【具体实施方式】中，所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
[0063] 在【具体实施方式】中，所述非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整个糖尿病病理浓 度范围的葡萄糖。
[0064] 在【具体实施方式】中，所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约0. 5-32mM的范 围的葡萄糖。
[0065] 在【具体实施方式】中，第一酶通过以下方式共价结合于所述表面，将所述表面暴露 于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面暴露于第一酶。
[0066] 在【具体实施方式】中，通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试剂的混合物的液 体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
[0067] 在【具体实施方式】中，通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂的悬浮液的方式 将所述多聚体共价结合于所述表面。
[0068] 在【具体实施方式】中，多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于多聚体的 方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质中。
[0069] 在【具体实施方式】中，纳米工程化材料通过以下共价结合于所述表面，将所述表面 暴露于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面暴露于携带有纳米工程 化材料的极化分散剂。
[0070] 在【具体实施方式】中，通过将所述表面暴露于含有纳米工程化材料和功能化试剂的 悬浮液的方式将纳米工程化表面共价结合于所述表面。
[0071 ] 在【具体实施方式】中，纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于 纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化材料和第一酶的 液体介质中。
[0072] 在【具体实施方式】中，所述固定过程涉及第一酶以及不同于第一酶的第二酶，并且 其中所述固定过程包括以下过程中的一种：
[0073] (a)将第一酶和第二酶共价结合于功能化试剂；
[0074] (b)将多聚体共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于多聚体； 以及
[0075] (C)将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于 纳米工程化材料。
[0076] 在【具体实施方式】中，第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的副产物。在具体 实施方式中，所述第二酶包括辣根过氧化物酶。在【具体实施方式】中，所述第二酶增加动态分 析物检测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
[0077] 在【具体实施方式】中，第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传感器能够在约 0. 5-48mM的浓度范围检测葡萄糖。
[0078] 在【具体实施方式】中，所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、第 一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
[0079] 在【具体实施方式】中，所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、多 聚体、第一酶和第二酶的方式共价结合于多聚体。
[0080] 在【具体实施方式】中，第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、纳米工 程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
[0081] 本发明的第三个方面提供了一种非介体酶包被电极，包括：
[0082] a. 一个一级基底；以及
[0083] b.共价结合于所述一级基底的酶。
[0084] 在【具体实施方式】中，所述非介体酶包被电极包括一个选择性扩散膜。
[0085] 本发明的第四个方面提供了一种非介体酶包被电极，包括：
[0086] a. 一个一级基底；
[0087] b. -个二级基底；以及
[0088] c.共价结合于所述一级基底和二级基底的酶。
[0089] 本发明的第五个方面提供了制备非介体酶包被电极的方法，包括：
[0090] a.将酶至少共价结合于一个一级基底以形成一个非介体酶包被电极。
[0091] 本发明的第六个方面提供了一种在没有介体的情况下在样品中检测被分析物的 方法，包括：
[0092] a.将非介体酶包被电极暴露于含有被分析物的样品；
[0093] b.在所述非介体酶包被电极施加负电势；以及
[0094] c.在所述被分析物中检测被分析物。
[0095] 本发明的第七个方面提供了 一种稳定酶包被电极包括：
[0096] a. 一个第一基底；
[0097] b. -个附着于所述基底的酶；以及
[0098] c. 一个选择性扩散膜。
[0099] 其中所述电极在至少20天内保持一个稳定被分析物传感信号。
[0100] 在【具体实施方式】中，所述稳定酶包被电极进一步包括一个二级基底。
[0101] 在【具体实施方式】中，所述电极具有约0. 5mM至约48mM的动态范围。
[0102] 本发明的第八个方面提供了一种减少电化学被分析物检测反应的副产物的方法， 包括：
[0103] a.提供一种含有至少两种酶的非介体酶包被电极；
[0104] b.对所述非介体酶包被电极施加一个负电势；
[0105] c.将具有负外加电势的所述非介体酶包被电极暴露于一个含有被分析物的样品 以引发一个电化学被分析物检测反应；以及
[0106] d.在样品中检测所述被分析物的水平，
[0107] 其中，所述至少两种酶中的至少一种催化所述电化学被分析物检测反应的副产品 的还原。
[0108] 本发明的第九个方面提供了一种在不存在介体的条件下增加酶包被电极灵敏度 的方法，包括：
[0109] a.提供一种含有至少两种酶的酶包被电极，其中所述至少两种酶中的至少一种包 括过氧化氢酶；
[0110] b.对所述酶包被电极施加一个负电势；
[0111] c.将施加有负电势的酶包被电极暴露于含有被分析物的没有介体的样品中，以引 发一个电化学被分析物检测反应；以及
[0112] d.在不存在介体的情况下，用所述过氧化氢酶对所述电化学被分析物检测反应的 副产物催化还原反应，进而增加所述酶包被电极对所述被分析物的灵敏度。

【专利附图】

【附图说明】
[0113] 1)多步骤电化学葡萄糖传感
[0114] 图IA :为所开发的用于发展共价结合酶包被电极的程序的原理示意图。路径1:基 于被动吸附的方案，如I. 1. 3中所描述以及路径2 :基于共价结合的方案，如I. 1. 2所述。
[0115] 图1B:利用Nafion/GOx/APTES/GCEl的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES)集中 于葡萄糖电化学检测的作用。
[0116] 图1C:显示用于检测葡萄糖的电化学葡萄糖传感分析曲线。
[0117] 图ID:显示用于检测Streck人工血糖标准的葡萄糖的电化学葡萄糖传感分析曲 线。
[0118] 图IE:干扰物对所开发的电化学葡萄糖传感方案的影响。
[0119] 图IF:显示利用开发的共价结合酶包被电极对4niM葡萄糖的连续检测。
[0120] 图1G:显示生物污垢对开发的共价结合酶包被电极在电化学葡萄糖传感中的影 响。
[0121] 图1H:显示开发的基于直接GOx的方案的生产再现性。
[0122] 图2A:开发的用于电化学葡萄糖传感的基于石墨烯纳米板（GNPs)的方案的示意 图。
[0123] 图2B:显示APTES浓度对利用开发的基于GNPs的方案的葡萄糖电化学检测的影 响。
[0124] 图 2C:利用 Naf ion/GOx-EDC 活化的 /GNPs-APTES/GCE 以及 Naf ion/GOx/APTES/ GCE.的葡萄糖电化学检测的分析曲线比较。
[0125] 图2D:检测Streck人工血糖的葡萄糖传感曲线。
[0126] 图2E:干扰物对开发的基于GNPs的方案的影响。
[0127] 图2F:显示开发的基于GNPs的方案的生产再现性。
[0128] 图2G:显示开发的基于GNPs葡萄糖传感在干燥环境室温（RT)下的稳定性。
[0129] 图2H:用于检测GOx结合于所开发的已用于葡萄糖检测9周时间的葡萄糖传感的 BCA蛋白分析，
[0130] 图21:显示通过将传感器浸泡于ImM Sugar-Chex血糖线性标准中7天的方式检 测生物污垢的影响，期间每天检测三个重复的6. 8mM Sugar-Chex线性标准。
[0131] 图3A:为所开发的基于聚左旋赖氨酸（PLL)的电化学葡萄糖传感方案的示意图。
[0132] 图3B:显示利用Nafion/GOx-EDC活化的/PLL-APTES/GCE的葡萄糖电化学检测的 分析曲线。
[0133] 图3C:显示利用Streck人工血糖的葡萄糖电化学检测。
[0134] 图3D:显示干扰物对利用Naf ion/GOx-EDC活化的/PLL-APTES/GCE的葡萄糖电化 学检测的影响。
[0135] 图3E:显示所开发的基于PLL的方案的生产可再现性。
[0136] 图4A:为所开发的用于电化学葡萄糖传感的基于多壁碳纳米管（MWCNTs)的方案 的示意图。
[0137] 图4B:显示多种APTES浓度对MWCNT (分散于DMF)的影响。
[0138] 图4C:显示多种APTES浓度对基于MWCNT (分散于APTES)的电化学葡萄糖生物传 感形式的影响。
[0139] 图4D:显示基于用于特定形式的优化的APTES浓度的各种形式的叠加图。
[0140] 图4E:显示用于检测多个Streck血糖线性标准的基于MWCNT(分散于DMF)的电 化学葡萄糖生物传感形式的应用。
[0141] 图4F:显示生理干扰物和药物对葡萄糖检测准确性的影响。
[0142] 图4G:显示为基于4mM葡萄糖检测的25uLG0x-功能化GCEs开发的产品再现性。
[0143] 2)电化学葡萄糖传感
[0144] 图5A:为所开发的高度简化的用于发展酶结合电极的程序的示意图。
[0145] 图5B:显示利用所开发的酶结合电极的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
[0146] 图5C:显示利用所开发的酶结合电极在Streck人工血糖标准中的葡萄糖电化学 检测的分析曲线。
[0147] 图5D:显示干扰物对所开发的电化学葡萄糖传感的影响。
[0148] 图5E:显示已开发的简化的用于制备GOx结合玻璃化碳电极（GCE)程序的可再现 性，其通过利用25个新鲜制备的GOx结合GCEs电化学检测SmM葡萄糖的方式证明。
[0149] 图5F:显示当在室温干燥条件下储存时，以电化学检测SmM葡萄糖的方式显示所 开发的GOx结合GCE的稳定性。
[0150] 图5G:显示当在室温50mM PBS，pH 7. 4中储存时，以电化学检测8mM葡萄糖的方 式显示所开发的GOx结合GCE的稳定性。
[0151] 图5H:显示当在4°C干燥条件下储存时，以电化学检测SmM葡萄糖的方式显示所开 发的GOx结合GCE的稳定性。
[0152] 图51:显示当在4°C，50mM PBS，pH 7. 4条件下储存时，以电化学检测8mM葡萄糖 的方式显示所开发的GOx结合GCE的稳定性。
[0153] 图5J:显示生物污垢对所开发的电极的电化学葡萄糖传感的影响，通过将所开发 的GOx结合电极储存于Streck' s Sugar-Chex血糖线性标准中若干天的方式证明，没有在 所开发的电极上发现生物污垢。
[0154] 图5K:显示当将所开发的方案用于不同底物以确定其普遍的多底物相容性质时， 一个基于BCA蛋白质测定的，GOx结合的总量的测定。
[0155] 图6A:为经修改的所开发的简化的用于制备GOx结合电极的程序的示意图，利用 石墨烯纳米板（GNPs)作为外加的中间基底或二级基底。
[0156] 图6B:显示利用所开发的高度简化的制备程序的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
[0157] 图6C:显示Streck血糖线性标准的分析曲线。
[0158] 图6D:显示干扰物对所开发的利用高度简化的制备程序的电化学葡萄糖传感的 影响。
[0159] 图6E:显示所开发的简化的用于制备GOx结合GNPs包被GCE的程序的可再现性， 利用25新鲜制备的GNPs-GOx-bound GCEs对8mM葡萄糖进行电化学检测。
[0160] 图7A:为经修改的所开发的简化的用于制备GOx结合电极的程序的示意图，利用 据左旋赖氨酸（PLL)作为外加的中间基底或二级基底。
[0161] 图7B:为利用Nafion/PLL-GOx/GCE的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
[0162] 图7C:为利用Nafion/PLL-GOx/GCE对Streck人工血糖标准中的葡萄糖的电化学 检测的分析曲线。
[0163] 图7D:显示干扰物对所开发的基于PLL的葡萄糖传感的影响。
[0164] 图8A:为经修改的所开发的简化的用于制备GOx结合电极的程序的示意图，利用 多壁碳纳米管（MWCNTs)作为外加的中间基底或二级基底。
[0165] 图8B:显示利用Nafion/APTES-MWCNTs-GOx/GCE的电化学葡萄糖检测的分析曲 线。
[0166] 图8C:显示利用Nafion/APTES-MWCNTs-GOx/GCE对Streck人工血糖标准中的葡 萄糖的电化学检测的分析曲线。
[0167] 图8D:显示干扰物对所开发的基于丽CNTs的葡萄糖传感方案的影响。
[0168] 3) -步电化学葡萄糖传感
[0169] 图9A:为所开发的基于双酶的非介体EC传感程序示意图，其中GOx和HRP被结合 于胺功能化的GCE，而后用Naf ion包被。
[0170] 图9B:显示利用所开发的方案的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
[0171] 图9C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
[0172] 图10A:为所开发的利用石墨烯纳米板（GNPs)的基于双酶的非介体EC传感程序 的示意图。
[0173] 图10B:显示利用所开发的方案的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
[0174] 图10C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
[0175] 图11A:为所开发的利用聚左旋葡萄糖（PLL)的基于双酶的非介体EC传感程序的 示意图。
[0176] 图11B:显示利用所开发的方案的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
[0177] 图11C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
[0178] 图12A:为所开发的利用多壁碳纳米管的基于双酶的非介体EC传感程序示意图。
[0179] 图12B:利用所开发的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
[0180] 图12C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
[0181] 图13A:为对所开发的利用壳聚糖的（CS)基于双酶的非介体EC传感程序示意图。
[0182] 图13B:显示利用所开发的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
[0183] 图13C:显示利用干扰物对利用所开发的方案的EC葡萄糖传感的影响。

【具体实施方式】
[0184] 在以下【具体实施方式】中，引用了相应附图，这形成一个部分。在附图中，类似的符 号通常识别类似的组件，除非上下文另有所指。以下所描述的具体的实施方式、附图以及权 力要求并非用于限制作用。在没有脱离本发明精神或本文所体现的主旨范围的前提下，可 以利用其他变形、以及进行其他变化。
[0185] 除非特别说明，否则本文中所使用的术语"包括"和"含有"以及其在语法上的变 形意在表示"开放"或"包含的"语言因此它们包括已提及的元素以及允许包含其他未提及 的元素。
[0186] 本文中所使用的术语"大约"在用于表示成分浓度、条件、其他测值等背景下，表示 给出数值的+/-5 %，或者给出数值的+/_4 %，或给出数值的+/-3 %或给出数值的+/-2 %， 或给出数值的+/-1 %，或给出数值的+/_〇. 5%，或给出数值的+/-0%。
[0187] 在本发明中，具体的实施方式可能通过一个范围形式公开，应当理解的是，范围形 式的描述仅仅是为了方便和简洁并且不应被解释为对已公开的范围的不可变的限制。相应 地，对于范围的描述应当被理解为已经具体公开了所有的可能的亚范围以及该范围内的独 立数值。例如，描述1至6的范围应当被理解为已经具体的公开了亚范围，例如从1至3、 从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、 3、4、5、和6。这适用于任何宽度的数值范围。
[0188] 根据本发明的多种实施方式都指向非介体（mediator-less)电化学被分析物（例 如，葡萄糖）传感装置以及程序。至于特定实施方式指向固定化酶例如关联至电极构造的 葡萄糖氧化酶，这种实施方式中的以下包括以下几种：
[0189] (1)通过葡萄糖氧化酶固定关联于一个胺功能化电极从而开发葡萄糖氧化酶结合 电极，例如通过葡萄糖氧化酶关于或在与胺-功能化电极相一致的表面共价结合。
[0190] (2)用于制备高稳定以及非渗漏葡萄糖氧化酶结合电极的高度简化的程序。
[0191] (3)基于双酶的非介体电化学葡萄糖传感。
[0192] 开发非介体电化学葡萄糖传感程序以及仪器。根据本发明的实施方式的用于开发 非介体电化学葡萄糖传感程序和仪器的实施例：
[0193] 实施例1 :通过葡萄糖氧化酶在胺功能化电极上的共价结合所开发的葡萄糖氧化 酶结合电极。
[0194] 表1显示共价葡萄糖传感方案与多种主流商业化葡糖糖计的对比。
[0195] 表 1
[0196]

【权利要求】
应当注意的是，关于下列代表性的权利要求，术语"第一酶"可以被术语"第一生物分 子"取代；类似的，术语"第二酶"可以被术语"第二生物分子"取代。
1. 一种用于在检测环境中检测一种被分析物的非介体生物传感器，所述非介体生物传 感器包括： 一个共价结合了功能化试剂的具有电传导化学修饰表面的基底；以及 通过共价结合于所述功能化试剂中的一种而与所述表面固定连接的第一酶，一个化学 结合于功能化试剂的多聚体，以及一个化学结合于所述功能化试剂的纳米工程化材料， 其中，非介体生物传感器配制为用于在分析物和第一酶之间直接电子转移（direct electron transfer)以适于对关联于检测环境的表面施加一个负电势。
2. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述非介体生物传感器在接近20 天的周期中保持基本稳定的分析物检测能力。
3. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述电传导化学修饰表面负载与 功能化试剂共价结合的羟基。
4. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述功能化试剂含有一个有机官 能烷氧基硅烷化合物。
5. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述功能化试剂含有一个有机官 能烷氧基硅烷化合物，并且其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约4体积％的功能化试 剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
6. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述功能化试剂含有一个有机官 能烷氧基硅烷化合物，并且其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约2体积％的功能化试 剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
7. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述功能化试剂含有一个有机官 能烷氧基硅烷化合物，并且其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约1体积％的功能化试 剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
8. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述多聚体包括胺功能化多聚体。
9. 根据权利要求8所述的非介体生物传感器，其中，所述多聚体包括氨基酸多聚体（例 如，聚左旋赖氨酸）和葡萄糖胺基多聚体中的一种（如壳聚糖）。
10. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，纳米工程化的材料包括石墨烯纳 米板、多壁碳纳米管和纳米晶纤维素中的至少一种。
11. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述非介体生物传感器进一步包 括选择性扩散膜，其在检测环境下限制第一酶在物质中的暴露。
12. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述基底负载有金属（例如，铂、 金）和碳基材料中的一种。
13. 根据权利要求12所述的非介体生物传感器，其中，所述基底包括玻璃化碳电极。
14. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，除包括生物物种（biological species)和药物代谢产物的被分析物以外，第一生物分子和第一酶中的一个与被分析物之 间的直接电子转移基本上没有被分子物质（molecular substances)影响。
15. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，第一酶适合于检测葡萄糖、胆固 醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。
16. 根据权利要求15所述的非介体生物传感器，其中，所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
17. 根据权利要求16所述的非介体生物传感器，其中，非介体生物传感器能够检测涵 盖几乎整个糖尿病病理浓度范围的葡萄糖。
18. 根据权利要求16所述的非介体生物传感器，其中，所述非介体生物传感器能够检 测涵盖浓度约0. 5-32mM的范围的葡萄糖。
19. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，第一酶通过以下方式共价结合于 所述表面，将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面 暴露于第一酶。
20. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，通过将表面暴露于携带有第一酶 和功能化试剂的混合物的液体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
21. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，通过将表面暴露于含有多聚体和 功能化试剂的悬浮液的方式将所述多聚体共价结合于所述表面。
22. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，多聚体共价结合于所述表面以及 第一酶共价结合于多聚体的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的 液体介质中。
23. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，纳米工程化材料通过以下方式共 价结合于所述表面，将表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化 表面暴露于携带有纳米工程化材料的极化分散剂。
24. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，通过将表面暴露于含有纳米工程 化材料和功能化试剂的悬浮液的方式将纳米工程化材料共价结合于所述表面。
25. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，纳米工程化材料共价结合于所述 表面以及第一酶共价结合于纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、 纳米工程化材料和第一酶的液体介质中。
26. 根据权利要求1所述的非介体生物传感器，其中，所述非介体生物传感器进一步包 括一个第二酶，通过与功能化试剂、多聚体和纳米工程化材料中的一种共价结合的方式固 定于所述表面。
27. 根据权利要求26所述的非介体生物传感器，其中，第二酶可以减少电化学被分析 物检测反应的副产物。
28. 根据权利要求27所述的非介体生物传感器，其中，所述第二酶包括辣根过氧化物 酶。
29. 根据权利要求26所述的非介体生物传感器，其中，所述第二酶增加动态分析物检 测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
30. 根据权利要求28所述的非介体生物传感器，其中，第一酶包括葡萄糖氧化酶并且 非介体生物传感器能够检测涵盖约〇. 5-48mM的浓度范围的葡萄糖。
31. 根据权利要求26所述的非介体生物传感器，其中，所述第一酶和第二酶通过将表 面暴露于携带功能化试剂、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试 剂。
32. 根据权利要求26所述的非介体生物传感器，其中，所述第一酶和第二酶通过将表 面暴露于携带功能化试剂、多聚体、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于多聚体。
33. 根据权利要求26所述的非介体生物传感器，其中，所述第一酶和第二酶通过将表 面暴露于携带功能化试剂、纳米工程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合 于纳米工程化材料。
34. -种制造非介体生物传感器的方法，所述非介体生物传感器被配置用于在检测环 境下检测被分析物，所述方法包括： 提供一个具有电传导化学修饰表面的基底；将功能化试剂共价结合于表面；以及 实施一个固定过程，所述固定过程包括以下过程中的一种： (a) 将第一酶共价结合于功能化试剂； (b) 将多聚体共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于多聚体；以及 (c) 将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于纳米工程化材 料， 其中所述非介体生物传感器被配置为检测响应负电势在相对于所述检测环境的表面 的应用的被分析物与第一酶之间的直接电子转移。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中，提供具有电传导化学修饰表面的基底包括： 提供一个具有电传导表面的基底；以及 将表面暴露于表面修饰试剂从而所述使得表面携带有羟基。
36. 根据权利要求34所述的方法，其中，功能化试剂包括有机官能烷氧基硅烷化合物。
37. 根据权利要求34所述的方法，其中，功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化 合物，并且其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约4体积％的功能化试剂的液体介质使 功能化试剂与所述表面共价结合。
38. 根据权利要求34所述的方法，其中，功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化 合物，并且其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约2体积％的功能化试剂的液体介质使 功能化试剂与所述表面共价结合。
39. 根据权利要求34所述的方法，其中，功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化 合物，并且其中，通过将表面暴露于存在浓度低于约1体积％的功能化试剂的液体介质使 功能化试剂与所述表面共价结合。
40. 根据权利要求34所述的方法，其中，所述多聚体包括胺功能化多聚体。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中，所述多聚体包括氨基酸多聚体、和葡萄糖胺基 多聚体中的一种。
42. 根据权利要求34所述的方法，其中，纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳 纳米管和纳米晶纤维素中的至少一种。
43. 根据权利要求34所述的方法，进一步包括一个选择性扩散膜，所述选择性扩散膜 在检测环境下限制第一酶在物质中的暴露。
44. 根据权利要求34所述的方法，其中，所述基底携带金属和碳基材料中的一种。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中，所述基底含有一个玻璃质碳电极。
46. 根据权利要求34所述的方法，其中，除含有生物物种和药物代谢产物的被分析物 以外，被分析物和第一酶之间的直接电子转移基本上没有被分子物质影响。
47. 根据权利要求34所述的方法，其中，第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸 盐、乙酰胆碱、胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中，所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中，所述非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整 个糖尿病病理浓度范围的葡萄糖。
50. 根据权利要求48所述的方法，其中，所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约 0. 5-32mM的范围的葡萄糖。
51. 根据权利要求34所述的方法，其中，第一酶通过以下方式共价结合于所述表面， 将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面暴露于第一 酶。
52. 根据权利要求34所述的方法，其中，通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试 剂的混合物的液体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
53. 根据权利要求34所述的方法，其中，通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂 的悬浮液的方式将所述多聚体共价结合于所述表面。
54. 根据权利要求34所述的方法，其中，多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价 结合于多聚体的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质 中。
55. 根据权利要求34所述的方法，其中，纳米工程化材料通过以下方式共价结合于所 述表面，将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面，接下来将所述功能化表面暴 露于携带有纳米工程化材料的极化分散剂。
56. 根据权利要求34所述的方法，其中，通过将所述表面暴露于含有纳米工程化材料 和功能化试剂的悬浮液的方式将纳米工程化表面共价结合于所述表面。
57. 根据权利要求34所述的方法，其中，纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第 一酶共价结合于纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化 材料和第一酶的液体介质中。
58. 根据权利要求34所述的方法，其中，所述固定过程涉及第一酶以及不同于第一酶 的第二酶，并且其中所述固定过程包括以下过程中的一种： (a) 将第一酶和第二酶共价结合于功能化试剂； (b) 将多聚体共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于多聚体；以及 (c) 将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于纳米 工程化材料。
59. 根据权利要求58所述的方法，其中，第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的 副产物。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中，所述第二酶包括辣根过氧化物酶。
61. 根据权利要求58所述的方法，其中，所述第二酶增加动态分析物检测范围和分析 物检测灵敏度中的至少一种。
62. 根据权利要求61所述的方法，其中，第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传 感器能够检测约0. 5-48mM的浓度范围的葡萄糖。
63. 根据权利要求58所述的方法，其中，所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带 功能化试剂、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
64. 根据权利要求58所述的方法，其中，所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带 功能化试剂、多聚体、第一酶和第二酶的方式共价结合于多聚体。
65. 根据权利要求58所述的方法，其中，第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能 化试剂、纳米工程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
66. -种非介体酶包被电极，包括： a. -个一级基底；以及 b. 共价结合于所述一级基底的酶。
67. 根据权利要求66所述的非介体酶包被电极，进一步包括一个选择性扩散膜。
68. -种非介体酶包被电极，包括： a. -个一级基底； b. -个二级基底；以及 c. 共价结合于所述一级基底和二级基底的酶。
69. 制备非介体酶包被电极的方法，包括： a.将酶至少共价结合于一个一级基底以形成一个非介体酶包被电极。
70. -种在没有介体的情况下在样品中电化学检测被分析物的方法，包括： a. 将非介体酶包被电极暴露于含有被分析物的样品； b. 在所述非介体酶包被电极施加负电势；以及 c. 在所述样品中检测被分析物。
71. -种稳定酶包被电极包括： a. -个第一基底； b. -个附着于所述第一基底的酶；以及 c. 一个选择性扩散膜， 其中所述电极在至少约20天保持一个稳定被分析物传感信号。
72. 根据权利要求71所述的稳定酶包被电极进一步包括一个第二基底。
73. 根据权利要求71所述的稳定酶包被电极，其中，所述电极具有约0. 5mM至约48mM 的动态范围。
74. -种减少电化学被分析物检测反应的副产物的方法，包括： a. 提供一种含有至少两种酶的非介体酶包被电极； b. 对所述非介体酶包被电极施加一个负电势； c. 将具有负外加电势的所述非介体酶包被电极暴露于一个含有被分析物的样品以引 发一个电化学被分析物检测反应；以及 d. 在样品中检测所述被分析物的水平， 其中，所述至少两种酶中的至少一种催化所述电化学被分析物检测反应的副产品的还 原。
75. -种在不存在介体的条件下增加酶包被电极灵敏度的方法，包括： a. 提供一种含有至少两种酶的酶包被电极，其中所述至少两种酶中的至少一种包括过 氧化氢酶； b. 对所述酶包被电极施加一个负电势； c. 将施加有负电势的酶包被电极暴露于含有被分析物的没有介体的样品中，以引发一 个电化学被分析物检测反应；以及 d.在不存在介体的情况下，用所述过氧化氢酶对所述电化学被分析物检测反应的副产 物催化还原反应，进而增加所述酶包被电极对所述被分析物的灵敏度。
【文档编号】C12M1/40GK104487565SQ201380035541
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2012年5月3日
【发明者】桑迪普·库马尔·瓦施斯特, 郑丹, 许福山, 哈立德·阿里·阿尔鲁宾 申请人:新加坡国立大学, 沙特国王大学