一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-2A与转基因方法
【专利摘要】本发明“一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-2A与转基因方法”属于植物转基因技术及其应用。(1)制备抗病毒的转基因砧木；(2)使接穗嫁接到所述转基因砧木上生长发育；其特征在于：所述抗病毒的转基因砧木为转入RNA干扰载体而获得，所述RNA干扰载体的靶标序列为目标病毒基因组内的基因片段。本发明的方法用于番茄接穗品种获得病毒抗性的试验获得了良好的效果，针对番茄的具体实施例中，构建的RNA干扰载体为为pCAMBIA2300-1A、pCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP或pCAMBIA2300-CMV5。本发明还提供了一种改进的转基因方法。上述方法获得的抗病毒植株能够有效规避转基因食品的安全隐患，且能够大大提高了获得抗病毒转基因品种的效率。
【专利说明】一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体PCAMBIA2300-2A与转基因方法
[0001]母案第一次和第二次审查意见通知书中，审查员指出母案存在多项发明，不具备单一性，因此 申请人:决定对母案中未获得保护的发明进行分案申请。本申请为申请号201110315208.9 (发明名 称:一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法)的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及植物转基因技术及其应用，特别是一种使番茄接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法。
【背景技术】
[0003]植物病毒是导致果树、蔬菜、花卉等园艺植物产量下降和品质变劣的重要原因，在农业生产中病毒病是仅次于真菌的第二大类病害，由于防治困难，素有“植物癌症”之称。目前植物病毒常用的防治措施有消灭病毒源和传统媒介、应用脱毒技术、药剂防治与选育抗病品种等，其中选育抗病品种是防治病毒病害最有效、最经济的方法。RNA干扰技术为基础的植物抗病技术因其高效性、特异性等特点，在植物抗病毒育种上展现了可观的前景。
[0004]基因沉默或称RNA干扰(RNA interference ；RNAi)是指由于转基因序列或外侵病毒与被沉默的内源或外源基因序列具有高度的同源性，其转录产物形成双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)结构，从而特异性地降解同源祀基因mRNA,使之发生沉默(Fire A., Xu S., Montgomery Μ.Κ., et al.Potent and specificgenetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature, 1998，391 (6669):806_811)。由于其干扰作用是发生在靶基因的转录后水平，因此，也成转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing ;PTGS)。植物 RNAi 具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利用RNAi技术进行基因功能研究；或直接利用RNAi创造的特殊性状变异体进行植物改良。其中RNAi技术在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸(如病毒)入侵的防御机制，同时现有研究进一步表明病毒产生交叉保护是由于诱导病毒(弱株系)所产生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒(强株系)的结果(Frank G.R., Stuart A.M.and David C.B.GeneSilencing without DNA:RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses[J].PlantCell, 1999，11:1207-1216)。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是:选择一段植物病毒基因的序列，以反向重复序列的方式构建成转录后含发夹结构的双链RNA (hairpin RNA, hpRNA)或含内含子的ihpRNA (intron-hairpin RNA)表达载体,通过基因枪、病毒载体转染或者农杆菌介导转化整合到植物基因上，体内表达dsRNA，直接或间接诱导RNAi的产生，起到抵抗病毒的目的。而在发夹结构研究中，认为ihpRNA表达载体比hpRNA表达载体沉默效率高(Helliwell C, Waterhouse P.Constructs and methods for high-throughput genesilencing in plants[J].Methods, 2003, 30 (4):289-295)。[0005]园艺植物种类与品种繁多，通过营养繁殖途径繁衍的园艺植物后代普遍经受着病毒的威胁。目前生产中栽培的众多蔬菜，水果和花卉均有几十到上百个品种，几乎每个品种都有数种到数十种病毒病害，病毒病抑制了植物的生长、结果，降低了果品的产量、质量，甚至引起死树，植物一旦被病毒侵染，将终生带毒持久受害。利用基因工程技术针对每一个品种进行改良，提高其抗病毒的能力，虽可行但需花费大量的人力与财力。嫁接是许多园艺植物繁殖的方法之一，绝大多数的果树和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品种的优良性状，又能利用砧木的有利特性。在应用嫁接繁殖时，一般同一种类中的不同品种采用同一砧木，甚至有些同属中的不同种类也采用同一砧木。这样一砧多用的情况，使得改良砧木品种比单独改良接穗品种要高效的多。
[0006]所谓植物系统性基因 沉默是指:dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信号既可以通过胞间连丝进行的短距离传递，也可以通过植物中的维管系统长距离传递(Brosnan C.A., Mitter N., Christie M., et al.Nuclear gene silencing directsreception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis[J].Proc Natl AcadSci U S A, 2007，104(37):14741-14746), (Kalantidis K., Schumacher H.T.,AlexiadisT., et al.RNA silencing movement in plants[J].Biol Cell, 2008，100(I):13-26),并诱导整个植物产生系统沉默。Daniel H.等(Daniel H.C，Fabio T.S., Miya D.H, etal.Pattern formation via small RNA mobility [J].Genes&Dev, 2009，23:549-554)研究表明小分子RNA可以作为一种移动的信号分子参与植物发育的调控。关于沉默信号在植物中的传递方向存在着不同的报道。Palauqui等(Palauqui J.C., Elmayan T., PollienJ.M., et al.Systemic acquired silencing:transgene-specific post-transcriptionalsilencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non—silencedscions [J], EMBO J, 1997，16(15):4738-4745.)以烟草为试材，发现 PTGS 的传导是单方向的，即只能从沉默的站木传向非沉默的接穗；而Sonoda等(Sonoda S.and NishiguchiM.Graft transmission of post-transcriptional gene silencing:target specificityfor RNA degradation is transmissible between silenced and non—silencedplants, but not between silenced plants [J].Plant J, 2000，21 (I): 1-8)研究表明，PTGS的传导是双方向的，从砧木到接穗或从接穗到砧木都可传导，但是PTGS从接穗到砧木的传导效率明显低于从砧木到接穗的传导。李明等(李明，姜世玲，王幼群，等.转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递[J].科学通报，2006，51 (2):142-147)的结果表明，无论用RNAi型植株作为砧木或接穗，基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中靶基因mRNA的减少，说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递。但mi RNA (micro RNA)或amiRNA (artificial mi RNA)还未发现能在嫁接体间传递，据此，本发明人推测系统性基因沉默方向可能与物种或检测水平或方法有关，但可以肯定以转基因方式获得超表达的siRNA相关的沉默信号能从砧木向上传递给接穗。
[0007]植物中，关于系统性基因沉默的最初线索来自烟草嫁接试验。1997年 Palauqui 等(Palauqui J.C., Elmayan T.,Pollien J.M., et al.Systemicacquired silencing:transgene-specific post-transcriptional silencing istransmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions[J].EMBOJ, 1997，16(15):4738-4745)把一个芽嫁接到另一植株上时，先将该植株的硝酸盐还原酶基因沉默，嫁接的幼芽上该基因也沉默。在幼芽中被沉默的基因与砧木中被沉默的基因相同，具有序列特异性。Sonoda 等(Sonoda S.and Nishiguchi M.Graft transmission ofpost-transcriptional gene silencing:target specificity for RNA degradation istransmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silencedplants [J], Plant J, 2000, 21 (I): 1-8)的研究也得出了相似的的结论，并同时证明经嫁接后，接穗所获得的PTGS即使在沉默的砧木不存在时也能保持。
[0008]近年来，围绕转基因生物育种，我国在转基因生物安全管理和安全性评价研究方面实现了与国际接轨，并取得了令人瞩目的进展。但有关基因工程中所涉及的抗性选择性标记基因对食品安全性的影响，部分人一直存有疑虑，而本项目研究巧妙的避开了这一议题，因为接穗所获得的系统性抗性，来源于砧木中的小分子RNA的沉默效应，因此理论上，嫁接转基因沉默植株接穗品种中将不含抗性标记。为了提高接穗品种抗目标病毒的能力，若只需通过改良砧木，嫁接后达到增强接穗品种抗该目标病毒的目的，这将为园艺嫁接植物的品种改良开 辟一条崭新的途径。但到目前为止，通过嫁接方式使接穗品种获得基因沉默效应的研究中，靶标基因都为植物自身的一些基因，未见到以致病菌或病毒基因为靶标的研究报道。
【发明内容】
[0009]本发明根据上述领域的空白及需求，提供一种使番茄植株获得抵御病毒能力的方法，以及该方法涉及到RNA干扰载体，改进的转基因方法等，该方法获得的抗病毒植株能够有效规避转基因食品的安全隐患，且能够大大提高了获得抗病毒转基因品种的效率。
[0010]一种使接穗品种获得病毒抗性的方法，其步骤如下:
[0011](I)制备抗病毒的转基因砧木；
[0012](2)使接穗嫁接到所述转基因砧木上生长发育；
[0013]其特征在于:所述抗病毒的转基因砧木为转入RNA干扰载体而获得，所述RNA干扰载体的靶标序列为目标病毒基因组内的基因片段。
[0014]所述目标病毒指黄瓜花叶病毒CMV，所述接穗品种和转基因砧木都为番茄品种，所述RNA干扰载体的靶标序列如Seq ID N0.1, 2，3，4，5或6所示。
[0015]所述RNA 干扰载体为 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
[0016]所述制备抗病毒的转基因砧木，转基因包括如下步骤:
[0017](I).番茄播种，(2).切子叶预培养，(3).抑菌筛选培养根癌农杆菌工程菌侵染后的子叶，(4).促分化培养，(5).生根培养，其特征在于:
[0018]所述番茄的种子播种前经无菌水浸润5~8小时；20%次氯酸钠灭菌lOmin，无菌水洗5次，每次5min ;30°C培养箱催芽两天；
[0019]所述切子叶预培养，是在真叶未出现前切取子叶进行预培养；
[0020]所述抑菌筛选培养:被根癌农杆菌侵染并暗培养2天的子叶，培养基C中:pH6.0,Medium Base+2mg/L反式玉米素核苷+200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，叶背朝上光照培养，IOd转接一次，直至出现绿色愈伤或芽点；将带芽点的外植体转入培养基Cl中:pH6.0，Medium Base+lmg/L反式玉米素核苷+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀中培养10~14d,待分化出芽；
[0021]所述促分化培养:抑菌培养中筛选到的抗性芽转入到培养基C3中:pH6.0,MediumBase+0.5mg/L反式玉米素核苷+1.5mg/L3-吲哚乙酸+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀；
[0022]所述生根培养的培养基为:ρΗ6.0, Medium Base+2mg/LIBA+200mg/L特美汀。
[0023]一种以黄瓜花叶病毒基因为靶标的的RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体的革巴标序列如Seq ID N0.1, 2，3，4，5或6所示。
[0024]所述RNA 干扰载体为 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
[0025]转化有上述RNA干扰载体的菌株或植物细胞。
[0026]所述菌株指根癌农杆菌菌株EHA105。
[0027]所述植物细胞指转基因番茄砧木的外植体前体细胞。
[0028]一种制备转基因番茄砧木的方法，包括如下步骤:
[0029](I).番茄播种，(2).切子叶预培养，(3).抑菌筛选培养根癌农杆菌工程菌侵染后的子叶，
[0030](4).促分化培养，(5).生根培养，其特征在于: [0031]所述番茄的种子播种前经无菌水浸润5~8小时；20%次氯酸钠灭菌lOmin，无菌水洗5次，每次5min ;30°C培养箱催芽两天；
[0032]所述切子叶预培养，是在真叶未出现前切取子叶进行预培养；
[0033]所述抑菌筛选培养:被根癌农杆菌侵染并暗培养2天的子叶，培养基C中:pH6.0,Medium Base+2mg/L反式玉米素核苷+200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，叶背朝上光照培养，IOd转接一次，直至出现绿色愈伤或芽点；将带芽点的外植体转入培养基Cl中:pH6.0，Medium Base+lmg/L反式玉米素核苷+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀中培养10~14d,待分化出芽；
[0034]所述促分化培养:抑菌培养中筛选到的抗性芽转入到培养基C3中:pH6.0,MediumBase+0.5mg/L反式玉米素核苷+1.5mg/L3-吲哚乙酸+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀；
[0035]所述生根培养的培养基为:ρΗ6.0, Medium Base+2mg/LIBA+200mg/L特美汀。
[0036]本发明目的在于，通过系统性基因沉默与嫁接技术的结合，先使砧木获得对入侵病毒的抗性，然后砧木将其病毒抗性转导至接穗中使嫁接于该砧木上的接穗品种获得病毒抗性。本发明区别于现有技术的思路是:构建的用于转化砧木的RNA干扰载体的基因沉默对象是入侵病毒的基因，而非植物本身的基因。
[0037]本发明中以番茄为砧木和接穗试材，以寄主较为广泛的黄瓜花叶病毒CMV为靶标病毒进行具体试验验证，实验数据显示，接穗番茄获得了良好的CMV病毒抗性。基于本发明的构思，说明书中记载的实验方法的指导以及本领域普通技术人员所具备的常规实验技能，本领域技术人员可以将本发明的方法应用到很多种易于受病毒侵染的并且可以嫁接的植物中，这种应用都在本发明请求保护的范围内。即，本发明的方法不限于应用到具体实施例中记载的番茄上。
[0038]本发明以番爺为试材，以黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus; CMV)为祀标对象，验证本发明的构思。即通过分别选择CMV5个基因OPF片段以及I个融合了 5个基因片段的共6个ihpRNA植物表达载体，采用农杆菌介导转化番茄，使转化植株产生siRNA，接种CMV筛选出高抗病毒的转基因植株。之后以抗性植株的TO或Tl代为砧木，嫁接未转基因的番茄，砧木中的siRNA转运到接穗中，以增强接穗对CMV的抗性。目前，在栽培番茄品种中还未发现有对CMV病毒的抗性基因，且栽培番茄品种也仅存在耐病性品种，利用常规杂交方法难以获得CMV抗性番茄品种。因此通过RNA干扰转基因的方法，是快速获得CMV抗性材料的有效途径。近年来，围绕转基因生物育种，我国在转基因生物安全管理和安全性评价研究方面实现了与国际接轨，并取得了令人瞩目的进展。但有关基因工程中所涉及的抗性选择性标记基因对食品安全性的影响，部分人一直存有疑虑。而本发明巧妙的避开了这一议题，因为接穗所获得的系统性抗性，来源于砧木中的小分子RNA的沉默效应。因此理论上，嫁接转基因沉默植株接穗品种基因组以及所产生的雌/雄配子中将不含抗性标记基因，防止了抗生素抗性基因的漂移。
[0039]本发明包括以下步骤:
[0040]a.针对黄瓜花叶病毒(CMV) 5个基因，通过比对番茄EST数据库，选取CMV5个基因ORF区间的片段，通过PCR和重叠PCR构建5个含CMV特异基因片段和I个融合了 5个基因片段的ihpRNA植物沉默表达载体；
[0041]b.利用改良后的遗传转化体系，通过农杆菌介导转化番茄植株，检测获得转基因阳性植株，扦插繁殖转基因植株(T0代)；
[0042]c.通过接种CMV病毒 ，比较不同载体转基因株系的CMV抗性，筛选出高抗病毒的转基因株系；
[0043]d.利用抗性扦插苗(T0代)或Tl代植株为砧木，嫁接野生型植株(未转基因植株)，接种CMV病毒，检测获得病毒抗性的嫁接植株；
[0044]e.提取砧木与接穗总RNA，反转为cDNA，RT-PCR检测抗生素抗性基因的表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1:黄瓜花叶病毒(CMV)基因组结构特征
[0046]图2:本发明采用的载体构建方案
[0047]图3:5个含CMV基因特异片段载体的构建
[0048]M2K/15K:Marker2K/15K ；
[0049]A:用Pstl/Sall酶切验证克隆载体pUCCRNAi_lA~CP，所切出小片段为构建入克隆载体的反向重复序列；
[0050]B:将从pUCCRNA1-lA~CP酶切后的反向重复序列，构建入表达载体得到PCAMBIA2300-1A ~CP 载体；
[0051]C:1~3:PstI/SalI酶切验证表达载体pCAMBIA2300-lA~CP，所切出小片段为构建入克隆载体的反向重复序列。
[0052]图4:含5个CMV基因片段融合载体的构建
[0053]A.1 =Marker 为 2K，分别利用 R1AF/R1AR 和 R2AF/R2AR 引物扩增片段 IAF 和 2AF ；
[0054]A.2:利用R1AF/R2AR引物，以IAF和2AF混合物为模板，扩增融合片段1A+2A ；
[0055]B.1:分别利用R2BF/R~RCPF/R引物扩增片段2BF、3AF和CPF ；
[0056]B.2:利用R2BF/RCPR引物，以2BF、3AF和CPF混合物为模板，扩增融合片段2B+3A+CP ；[0057]C.:CMV5为利用RlA F/RCP R引物，以1A+2A和2B+3A+CP混合物为模板，扩增融合片段CMV5 ；
[0058]D.:PstI, Pstl/Sall 酶切检测 pCAMBIA2300_CMV5 载体。
[0059]图5:本发明采用的改进后的番茄转基因步骤
[0060]图6:转基因番茄的PCR检测(部分株系分批检测)
[0061]M =Marker 2K ；+:质粒 pCAMBIA2300_lA 为模板；CK:未转基因番茄 MoneyMaker 为模IA~CMV5-1~9:表示以ActinlPF/IntornR为引物，不同靶标载体对应转基因株系为模板扩增的条带
[0062]图7:转基因 番爺部分株系的Southern杂交检测
[0063]M =Marker 15K ；+:质粒pCAMBIA2300_lA为模板(未酶切完全)；CK:未转基因番茄MoneyMaker为模板；T01A~CMV5.1~2:表不不同祀标载体对应转基因株系Southern杂交条带
[0064]图8:转基因番茄植株的RT-PCR检测
[0065]M =Marker 2K ；+:质粒 pCAMBIA2300_lA 为模板；CK:未转基因番茄 MoneyMaker 为模板；T01A~CMV5.1~2:表示分别以IAF~CPF和RlAF (T0CMV5)为上游引物，IntronR为下游引物，扩增不同靶标载体对应转基因株系的条带
[0066]图9:转基因番茄的扦插繁殖与CMV攻毒筛选抗病毒TO代株系
[0067]CK:为未转基因番茄植株MoneyMaker ;TO IA~CP.1~2和T0CMV5.1~5:表示不同转基因株系扦插苗，接种CMV病毒后鉴定病毒抗性，图中株系为筛选出的部分高抗株系
[0068]图10:转基因番茄Tl代的繁殖与CMV攻毒筛选抗病毒Tl代株系
[0069]CK:为未转基因番茄植株MoneyMaker ；T11A.1~CMV5.1:表示不同转基因株系Tl代，接种CMV病毒后鉴定病毒抗性
[0070]图11:本发明采用的嫁接技术
[0071]图12:嫁接后抗生素抗性基因NptII的RT-PCR检测
[0072]M =Marker 2K ；+:质粒 pCAMBIA2300_lA 为模板；CK:未转基因番茄 MoneyMaker 为模板；T01A~CMV5.1~2:表示以NptIIF/R为引物不同靶标载体对应转基因株系为模板扩增的PCR条带上图表明接穗中无NptII基因的表达
【具体实施方式】
[0073]实施例1.针对黄瓜花叶病毒(CMV)基因，通过比对番茄EST数据库，构建6个ihpRNA植物沉默表达载体；
[0074]黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus, CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirs)成员。CMV为单链正义RNA病毒。基因组分为RNA1、RNA2和RNA3，基因组大小分别为3389nt、3035nt和2197nt，分别包被于三颗病毒粒体之中，其中RNA3含亚基因组RNA4，全长lOOOnt。RNAl编码核酸复制酶；RNA2编码两个蛋白:RNA依赖的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)和 2b 蛋白，RdRP 与病毒的侵染有关，2b蛋白类似一种病毒运动蛋白，有实验证明2b蛋白能够减弱RNA介导的病毒基因的沉默；RNA3编码一种运动蛋白3A蛋白，其具体功能不详但与病毒细胞间的传递有关；RNA4编码病毒外壳蛋白:CP蛋白。CMV基因组的具体特征如图1。[0075]本发明针对黄瓜花叶病毒(CMV)5个基因，通过比对番茄EST数据库，选取CMV5个基因ORF区间的片段如(Seq ID N0.1、2、3、4、5所示)，通过PCR和重叠PCR构建5个含CMV特异基因片段和I个融合了 5个基因片段的ihpRNA植物沉默表达载体，具体步骤如下:
[0076]扩增5个片段分别用到的引物，下划线部分为引入的酶切位点:
[0077]IAF:5/ -ATTGTCGACTGGATGCGTCCTGTGC-3'
[0078]IAR:5/ -ATCGGATCCTTGGGCGGACTTCTTG-3'；
[0079]2AF:5/ -AATGTCGACTGTCCAACGCCAACC-3'
[0080]2AR:5/ -AGGGGATCCTTCGTTGTACCTACTC-3'
[0081 ] 2BF:5/ -ATTGTCGACTGGCTCGTATGGTGGA-3'
[0082]2BR:5/ -GAGGGATCCGCGAACCAATCTGTAT-3'；
[0083]3AF:5/ -ATAGTCGACAGCCCTGAAGCCATTA-3'
[0084]3AR:5/ -AGAGGATCCAAAGACCCTTCAGCAT-3'；
[0085]CPF:5/ -ATTGTCGACCTTTGTAGGGAGTGA-3'
[0086]CPR:5/ -ATC GGATCCTTTACGGACTGTCA-3'；
[0087]扩增融合片段用到的重叠PCR引物:
[0088]RlA F:5/ -TATGTCGACTGTGCCCGAGGGTATTG-3'
[0089]RlA R:5/ -TCAGTAGCACGGTTTAAATTTACAGATCACGCATTCAC-3'
[0090]R2A F:5/ -GTGAATGCGTGATCTGTAAATTTAAACCGTGCTACTGA-3'
[0091]R2A R:5/ -TTCTTCGCCTCCACCATACGCTTGATGAAAAGAGTCGTCGT-3'
[0092]R2B F:5/ -ACGACGACTCTTTTCATCAAGCGTATGGTGGAGGCGAAGAA-3'
[0093]R2B R:5/ -TCCACTGATGCTGAAGGGTCTGATAGAACGGTAGGAAGCG-3'
[0094]R3A F:5/ -CGCTTCCTACCGTTCTATCAGACCCTTCAGCATCAGTGGA-3'
[0095]R3A R:5/ -CGAGTTAATCCTTTGCCGAACACGGTCGTATTGCTTCCTT-3'
[0096]RCP F:5, -AAGGAAGCAATACGACCGTGTTCGGCAAAGGATTAACTCG-3,
[0097]RCP R:5/ ~ATCGGATCCATCTATTACCCTAAAGCCAC~3;
[0098]克隆载体检测引物:
[0099]M13+:5/ -AGGGTTTTCCCAGTCACG-3'
[0100]M13-:5/ -GTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3'
[0101 ] 表达载体检测引物:
[0102]ActinlPF:5/ -CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT-3'
[0103]IntronR: 5' -TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC-3'
[0104]克隆载体:pUCCRNAi，记载在(Luo,A.，Qian, Q.，Yin, H.et al.(2006)EUIlj encoding a putative cytochrome P450 monooxygenase, regulates internodeelongation by modulating gibbereIIin responses in rice.Plant CellPhysiol.47, 181 - 191.)中，本实验室亦有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于实
验研究。
[0105]植物表达载体:pCAMBIA2300-Actinl_ocs，记载在(Fang，J.，ChaijC.，Qian, Q.，Li，C.，Tang, J.，Sun，L，Huang, Z.，Guoj X.，Sun, C.and Liuj M.2008.Mutations of genes insynthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting andphoto-oxidation in rice.The Plant Journal.2，177-189),本实验室亦有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于实验研究。
[0106]本发明中利用pUCCRNAi中两组同尾酶切位点Xhol/Sall和Bglll/BamHI，将选取并经PCR扩增得到的CMV5个基因ORF区间的片段如Seq ID N0.1、2、3、4、5所示的片段的正、反向序列分别构建到pUCCRNAi的两组酶切位点中，即每个片段的正反向序列分别构建到两组酶切位点中得到具有反向重复序列的RNAi克隆载体pUCCRNA1-lA、2A、2B、3A、CP ；通过重叠PCR将Seq ID N0.1、2、3、4、5所示的5个片段内的部分片段连在一起得到SeqIDN0.6所示的片段，将Seq ID N0.6所示的片段的正、反向序列构建到pUCCRNAi的两组酶切位点中得到RNAi克隆载体pUCCRNA1-CMV5，引物为上面的重叠PCR引物。
[0107]将克隆载体pUCCRNA1-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5的反向重复区，用内切酶Sall/PstI酶切后连接到植物表达载体pCAMBIA2300-ACtinl-OCS中，载体构建方案如图2所示，得到具有ihpRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5酶切，酶切验证如图3，4所示。测序结果也显示所选的正反向序列的构建位置正确。
[0108]将构建得到的植物表 达载体转入到大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取质粒用于农杆菌转化。操作如下:
[0109]步骤1.pUCCRNAi载体片段酶切与回收
[0110]提取大肠杆菌中pUCCRNAi质粒(质粒DNA的小量提取试剂盒)。取5ul质粒，利用XhoI和BagII内切酶，采用50ul酶切体系，37°C酶切过夜，回收酶切产物中3K左右长度的质粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光检测琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。回收片段标记为 XhoI/Bagll-pUCCRNAi。
[0111]步骤2.CMV基因PCR片段酶切与回收
[0112]利用引物1AF/R~CPF/R，以含CMV全基因组的侵染性克隆载体上，通过如下PCR方法，分别获得5个CMV基因片段，分别记录为1A、2A、2B、3A和CP ;测序验证其准确性；
[0113]引物的稀释:将合成的引物直接加去离子水配制成终浓度为10umol/L。
[0114]
【权利要求】
1.一种使接穗品种获得病毒抗性的方法，其步骤如下: (1)制备抗病毒的转基因砧木； (2)使接穗嫁接到所述转基因砧木上生长发育； 其特征在于:所述抗病毒的转基因砧木为转入RNA干扰载体而获得，所述RNA干扰载体的靶标序列为目标病毒基因组内的基因片段，所述目标病毒指黄瓜花叶病毒CMV，所述接穗品种和转基因砧木都为番茄品种，所述RNA干扰载体的靶标序列如Seq ID N0.2所示。
2.一种以黄瓜花叶病毒基因为靶标的RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体的革巴标序列如Seq ID N0.2所示。
3.转化有 权利要求2所述RNA干扰载体的菌株。
4.根据权利要求3所述的菌株，其出发菌株为转基因根癌农杆菌菌株EHA105。
【文档编号】C12R1/01GK103952433SQ201410012156
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2011年10月17日 优先权日:2011年10月17日
【发明者】杨国顺, 白描, 钟晓红, 熊兴耀, 邓子牛, 石雪晖, 陈文婷, 周敏 申请人:湖南农业大学