专利名称：一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
植物在生长发育过程中会受到各种病原微生物的侵袭，虽然植物不具备主动“趋利避害”的能力，但在长期与各种病原微生物共进化过程中，植物形成了对病原微生物精确的信号感知与防御系统。植物先天免疫主要包括三方面内容基础抗性、抗病基因介导的抗性以及系统获得性抗性。其中抗病基因介导的抗性由于反应时间快，抗病反应强烈，常常伴 随着病原菌侵染点的超敏反应以及细胞程序化死亡，使其成为植物抗病的一个重要组成部分。Flor在研究亚麻锈病抗性基因遗传时提出了“基因对基因”学说，其具体表述为病原菌不同的小种带有不同的无毒基因，当植物中的抗病基因能够特异识别病原菌当中的无毒基因时，就能通过信号传导启动抗病反应。因此对植物抗病基因产物的结构分析与研究，是了解植物抗病机制的基础。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要食物。稻瘟病是水稻最主要的病害之一,全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达11% 30%，严重时减产达40% 50%，甚至颗粒无收。实践证明，利用含有抗稻瘟病基因的水稻品种是应对稻瘟病危害的有效办法之一。到目前为止，在水稻中定位的抗稻瘟病基因有近百个，已经克隆的有 21 个，它们分别是 Pib, Pi-ta、Pi9、Piz_t、Pi2、Pid2、Pi36、Pi37、Rbr2、Pik-m、Pi5、Pid3、pi21、Pit、Pbl、Pish、Pik-p、Pik、Pia、Pi54 和 Pi25，其中除了基因 Pid2 编码一个丝苏氨酸受体类似激酶以及隐性抗稻瘟病基因Pi21编码一个富脯氨酸蛋白外，其他19个抗稻痕病基因全都属于 Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat(NBS-LRR)S因家族。NBS-LRR基因由N端保守的核苷酸结合位点(NBS)和C端富亮氨酸重复(LRR)区域构成，在LRR区域，由数十个(一般15 40个)不完全的LRR结构构成。尽管目前已经克隆了 21个抗稻瘟病基因，但因为稻瘟病菌小种众多且变异速度快，所以，克隆更多的抗稻瘟病基因以应对稻瘟病的危害就显得尤为重要。NBS-LRR类基因在植物基因组中广泛存在，在已经测序的水稻和拟南芥中，NBS-LRR类基因均占了所有编码基因数目的1%以上。对目前已经克隆的抗稻瘟病基因进行分析发现，21个基因中有19个属于NBS-LRR类基因家族，我们有理由相信，水稻中抗稻瘟病基因绝大多数应该是属于NBS-LRR类基因家族。更重要的是这19个NBS-LRR基因中有12个都是等位基因，其中Pi37/Pish位于第一号染色体上；Pib/Rbr2位于第二号染色体上；Piz-t/Pi2/Pi9位于第六号染色体上，距离不远的位置是Pid3/Pi25 ；Pik/Pik-p/Pik-m位于第十一号染色体上。那么我们也有理由相信，在鉴定出的将近一百个抗稻瘟病基因中，很多都应该是互为等位的。目前，一般认为变异较大的LRR结构域决定了此类抗病基因对病原菌识别的专化性。目前，对抗稻瘟病基因的克隆还是主要依靠图位克隆，虽然籼稻9311和粳稻日本晴都有了全基因组序列，为水稻基因的图位克隆带来了巨大方便，但对于抗稻瘟病基因的克隆来说，依然还存在很多困难。比如对精细定位群体内各单株的稻瘟病抗性鉴定，不仅工作量巨大，而且田间稻瘟病发病情况还很容易受环境影响，造成性状统计错误，而不能准确定位；另外，从已经测序的9311和日本晴基因组序列来看，NBS-LRR基因大多都是成簇存在，即使能够将目标基因定位到某一区段，也很难判断成簇基因中的哪一个才是真正的抗病基因；再者，目前利用的水稻品种遗传背景狭窄，可利用的抗稻瘟病基因不多。然而在野生稻中却蕴藏丰富的抗病基因资源，由于目前对野生稻的研究还处于起步阶段，没有精细遗传图谱和物理图谱，要利用图位克隆其中抗稻瘟病基因显然更是困难重重。因此，我们可以直接利用已经克隆的NBS-LRR型基因序列信息，克隆其在野生稻或者其他对稻瘟病具有高抗效应的水稻品种中的同源基因，直接转化易感稻瘟病的水稻品种，从而筛选出具有更优良抗性的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用。 本发明所提供的蛋白质，名称为PID3-A4,来源于普通野生稻(Oryza. rufipogon)A4，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗稻瘟病相关的由(a)衍生的蛋白质。上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。其中，序列表中的序列2由924个氨基酸残基组成。为了便于PID3-A4蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6 (通常为 5 个)RRRRR
Poly-His2-10 (通常为 6 个)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
上述(a)中的PID3-A4蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的PID3-A4蛋白的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上上表所示的标签的编码序列得到。编码所述PID3-A4蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述PID3-A4蛋白的基因(名称为Pid3-A4)，所述Pid3-A4基因为如下I)-4)中任一所述的DNA分子I)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述PID3-A4蛋白的DNA分子；4)与I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码所述PID3-A4蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65° C下杂交，然后用2XSSC，0. 1%SDS 和 I X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。其中，序列I由2775个核苷酸组成，整个序列I即为所述Pid3_A4基因的编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质(所述PID3-A4蛋白)。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在 植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以稻瘟病菌接种筛选转化植株。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述Pid3_A4基因转录的启动子具体为35S启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在PZHOl载体的多克隆位点处插入所述Pid3-A4基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Xba I和Kpn I。所述PZHOl 载体在 Xiao, H.，Wang, Y.，Liu, D.，Wang, W.，Li, X.，Zhao, X.，Xu, J.，Zhai, ff. and Zhu, L. (2003)Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 byRNA interference. Plant Mol. Biol. 52, 957 - 966.中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。所述表达盒由能够启动所述Pid3_A4基因表达的启动子，所述Pid3_A4基因，以及转录终止序列组成。所述PID3-A4蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围 al)调控植物对稻瘟病的抗性；a2)选育抗稻瘟病植物品种。在本发明的一个实施例中，所述调控植物对稻瘟病的抗性具体为提高植物对稻瘟病的抗性。所述选育抗稻瘟病植物品种的方法，具体可包括将所述PID3-A4蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。本发明的另一个目的是提供一种培育抗稻瘟病转基因植物的方法。该方法包括如下步骤将编码所述PID3-A4蛋白的基因导入目的植物中，获得抗稻瘟病的转基因植物，所述转基因植物表达所述基因；所述基因(即Pid3-A4基因)是如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述PID3-A4蛋白的DNA分子；4)与I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码所述PID3-A4蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65° C下杂交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。所述Pid3_A4基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。所述稻痕病由下述稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小种中的至少一种引起JS2001-108-1、Zhongl0-8-14、97-27-2、03-10-66-l、07-31-l-2、03-10-76-3、10-25-1-1、10-32-2-1、03-1卜37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-1、07-26-22,09-87-2-1, Y34,99-26-2, CH706 和 99-20-2。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物如水稻。在本发明的一个实施例中，具体为水稻品种TP309。
扩增所述PID3-A4基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明所提供的PID3-A4蛋白及其编码基因可用于培育抗稻瘟病植物新品种，特别是对由下述稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小种中的至少一种弓I起的稻痕病表现出抗性JS2001-108-l、Zhongl0-8-14、97-27-2、03-10-66-l、07-31-l-2、03-10-76-3、10-25-卜I、10-32-2-1、03-1卜37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-l、07-26-22、09-87-2-l、Y34、99-26-2、CH706 和 99-20-2。这将有利于对水稻品种的改良，对扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
图I为抗稻瘟病基因Pid3_A4的PCR扩增产物电泳结果。其中，泳道I为Pid3_A4基因的PCR产物；泳道M为DNA分子量标准。图2为重组表达载体PZH01-Pid3_A4的质粒图谱。 图3为Ttl代转Pid3_A4基因株系分子鉴定结果。其中，HPT为针对潮霉素抗性基因的PCR检测结果；CAPS为针对Pid3-A4基因的PCR扩增-BamH I酶切检测结果。图4为Ttl代转Pid3_A4基因株系中Pid3_A4基因过表达分析及其对稻瘟病菌zhong-10-8-14的抗性表型。图5为转Pid3_A4基因株系中Pid3_A4基因的表达和对稻瘟病抗性之间相关性的分析。其中，Hpt为针对潮霉素抗性基因的PCR检测结果；CAPS为针对Pid3-A4基因的PCR扩增-BamH I酶切检测结果。图6为转Pid3_A4基因株系中Pid3_A4基因表达的特性分析结果。其中，A为接囷组；B为接水组。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、抗稻瘟病基因Pid3_A4的获得本实施例利用从水稻地方栽培种地谷中克隆的抗稻瘟病基因Pid3序列信息分离克隆普通野生稻(Oryza. rufipogon) A4中的抗稻痕病同源基因。I、水稻抗稻瘟病基因Pid3序列信息的获得抗稻瘟病基因Pdi3是从水稻地方栽培种地谷中克隆得到的，它对粳稻区稻瘟病菌小种具有较好的抗性，其中用来定位克隆的鉴别小种为粳稻区稻瘟病菌小种zhong-10-8-14。从 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上获得地谷中抗稻痕病基因Pid3全基因序列(GenBank: FJ745364. I的第3010-5784位)，Pid3基因全长2775bp，不含有内含子，编码一个 N 端 non-TIR、non-CC 的含一段保守 motif RSLALSIEDVVD (78_89aa)的NBS-LRR蛋白。NBS结构域由第158位到466位氨基酸编码，在565位到924位氨基酸间有13个不完整的LRR。2、利用地谷Pid3基因序列设计引物扩增野生稻A4中Pid3的同源基因Pid3_A4I)引物设计根据地谷中Pid3基因序列(GenBank:FJ745364. I的第3010-5784位)，设计引物扩增野生稻 A4 (Shang, J. J. et al. , 2009Identification of a New Rice BlastResistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-Rich Repeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Geneticsl82:1303-1311)中的同源基因。所设计的引物如下d3F :5’ -atggcggagggtgttgtgggctc-3，(序列 I 的前 23 位)d3R :5’ _ttattgaatcctttctgcagcc_3’(序列 I 的后 22 位的反向互补序列)为了便于后续将所扩增的Pid3同源基因连入表达载体的试验，在此上下游引物中分别加入含有保护碱基的Xba I和Kpn I酶切位点序列，得到引物如下Pid3F :5’-TTTCTAGAatggcggagggtgttgtgggctc_3’ (下划线处为 Xba I 的识别序列) Pid3R :5’ _CTGGTACCttattgaatcctttctgcagcc_3，(下划线处为 Kpn I 的识别序列)2)抗稻瘟病基因Pid3_A4的获得以野生稻A4的叶片基因组DNA为模板，用引物Pid3F和Pid3R进行PCR扩增。反应体系(25iiI) :10XPCR 缓冲液 2. I ;dNTP Mixture (2. 5mM) 2. 5 u I ；KOD 酶(5U/ii I) 0. I ;引物 Pid3F 和 Pid3R (均 IOmM)各 0. 25 y I ;模板(DNA) I u I ；MgSO4 (25mM) I. 6u I ；DMS0 I. 6u I ;ddH20 补充至 25u I0反应条件先94°C预变性4min ;然后94°C变性30S，58°C退火30S，68°C延伸3min，共30个循环；最后68°C延伸5min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明PCR扩增得到大小约为3000bp的目的条带(图I)。切下该目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到pEASY-Blunt载体(北京全式金生物技术有限公司)上，转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，将转化子摇菌并提取质粒，送样测序。测序表明该PCR产物含有序列表中序列I所示的核苷酸序列，其序列具体为TTTCTAGA+序列1+GGTACCAG (下划线部分分别为Xba I和Kpn I酶切位点的识别序列)。其中，序列I由2775个核苷酸组成，整个序列I为一个完整的开放阅读框，编码序列表中序列2所不的蛋白质。序列表中序列2由924个氣基酸残基组成。将序列I所不基因命名为Pid3-A4，将该基因编码的蛋白质命名为PID3-A4。3、对获得的同源基因Pid3_A4序列进行分析利用DNAMAN 软件对地谷中 Pid3 基因(GenBank:FJ745364. I 的第 3010-5784 位)和野生稻A4中Pid3-A4基因(序列I)序列相似性进行分析发现，地谷中Pid3基因和野生稻M中的Pid3-A4基因相似度很高，达到了 99. 5%，一共只有14个碱基差异。利用在线基因预测软件(http://linuxl. softberry. com)对序列I进行基因预测,发现序列I只含有一个0RF，没有内含子存在，这与地谷中Pid3基因结构特征一致。将野生稻A4中Pid3-A4基因编码的氨基酸序列(序列2)利用在线软件(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)分析发现，它也编码一个NBS-LRR蛋白，并且保守区域NBS的位置和地谷中Pid3的位置一样，都由第158-466位的氨基酸编码，并且二者间只存在9个氨基酸的差异，其中6个位于LRR区域，一个位于NBS区域，其他两个在N末端。实施例2、转Pid3_A4基因水稻的获得及其功能研究一、转Pid3_A4基因水稻的获得
I、重组表达载体PZH01-pid3_A4的构建将实施例I得到的PCR产物(TTTCTAGA+序列1+GGTACCAG)经讨Xba I和Kpn I酶切，得到的片段与经过同样酶切植物双元表达载体PZHOl (Xiao, H.，Wang, Y.，Liu, D.，Wang, ff. , Li, X. , Zhao, X. , Xu, J. , Zhai, ff. and Zhu, L. (2003) Functional analysis of therice AP3 homologue 0sMADS16 by RNA interference. Plant Mol. Biol. 52, 957-966.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)的载体片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，将转化子摇菌并提取质粒，送样测序。将经测序表明在PZH01载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间插入序列表中序列I所示的Pid3_A4基因的重组质粒命名为PZH01-Pid3-A4，该质粒即为重组表达载体，其质粒图谱如图2所示。2、转Pid3_A4基因水稻的获得
将步骤I构建的重组表达载体PZH01-pid3_A4通过电击转化方法(Hiei，Y.，S.Ohta, T. Komari and T. Kumashiro, 1994 Efficient transformation of rice (Oryzasativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant J. 6:271-282.)转入农杆菌LBA4404(Chen, X.，et al., (2006) A B-Iectinreceptor kinase gene conferring rice blast resistance. Plant J. 46:794 - 804.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)中得到转化子。同时设置转入PZH01空载体的对照。将转入重组表达载体PZH01-pid3-A4的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/PZH01-pid3-A4 ;将转入 PZH01 空载体的农杆菌 LBA4404 命名为 LBA4404/PZH01。通过农杆菌介导转化水稻成熟种子愈伤组织的方法(Hiei, Y.，S. Ohta, T. Komariand T. Kumashiro, 1994 Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. )mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. PlantJ. 6:271-282.)将上述制备的重组农杆菌 LBA4404/PZH01-pid3-A4 (或 LBA4404/PZH01)导入到水稻品种 TP309 (Junjun Shang. , et al. Identification of a New Rice BlastResistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-RichRepeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Genetics, 2009 年，182:1303-1311,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)中，获得了 21个Ttl代转入重组表达载体PZH01-pid3-A4的转Pid3-A4基因株系和8株转入PZH01空载体的对照株。3、分子检测(I)对 Pid3_A4 基因的 PCR 检测利用CAPS标记对上述步骤2获得的转Pid3_A4基因株系和转入PZH01空载体的对照株进行DNA水平上的分子检测，具体如下分别以上述步骤2获得的Ttl代转Pid3_A4基因株系和转入PZH01空载体的对照株的基因组DNA为模板，以Pid3JF和Pid3JR为引物进行PCR扩增。同时设置未转基因的TP309水稻作为对照。Pid3JF :5' -TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC-3'(序列 I 的第 2057-2080 位)Pid3JR :5' -ACGTCACAAATCATTCGCTC-3'(对应于序列 I 的第 2695-2714 位)上述引物不仅可以扩增外源Pid3_A4基因的一段658bp的片段(序列I的第2057-2714位)，还可以扩增TP309水稻内源Pid3_tp309基因(Pid3的同源基因)的一段658bp的片段(GenBank FJ745366. I的第2071-2728位)，但由于来自Pid3_A4基因的片段含有一个BamH I酶切位点(序列I的第2204位)，而Pid3_tp309基因由于此处一个碱基的差异没有这个酶切位点，所以可以通过用限制性内切酶BamH I对PCR产物进行酶切，从而检测TP309中是否成功转入了 Pid3-A4基因。没有转入Pid3-A4基因的TP309经PCR扩增-BamH I酶切后得到的一个目的条带，大小为658bp ;而成功转入了 Pid3_A4基因的TP309经PCR扩增-BamH I酶切后得到两个目的条带，大小分别为5IObp和148bp。
对上述步骤2获得的6个Ttl代转Pid3_A4基因株系(Iinel、line2、line3、line4、line7和line9)和未转基因的TP309水稻进行上述PCR扩增，然后用BamH I酶切，结果如图3所示。从图中可以看出，6个Ttl代转Pid3_A4基因株系(linel、line2、line3、line4、line7和line9)经PCR扩增-BamH I酶切后得到两个目的条带，而未转基因的TP309水稻经PCR扩增-BamH I酶切后得到的一个目的条带，且条带大小与预期结果相符。这一结果表明6个Ttl代转Pid3-A4基因株系均为Pid3-A4基因阳性植株。另外，对转入PZHOl空载体的对照株的鉴定结果与未转基因的TP309水稻相一致。 (2)对潮霉素抗性基因的PCR检测分别以上述步骤2获得的6个Ttl代转Pid3_A4基因株系和转入PZHOl空载体的对照株的基因组DNA为模板，以HYGF和HYGR为引物进行PCR扩增。同时设置未转基因的TP309水稻作为对照。没有转入潮霉素抗性基因的TP309经PCR扩增后无目的条带；而成功转入了潮霉素抗性基因的TP309经PCR扩增后得到大小约为500bp)的目的条带。HYGF :5' -GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-3'HYGR 5' -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3'对上述步骤2获得的6个Ttl代转Pid3_A4基因株系(Iinel、line2、line3、line4、line7和line9)和未转基因的TP309水稻进行上述PCR扩增，结果如图3所示。从图中可以看出，6 个 Ttl 代转 Pid3-A4 基因株系(Iinel、line2、line3、line4、line7 和 line9)经 PCR扩增后得到大小约为500bp的目的条带；而未转基因的TP309水稻经PCR扩增后后无目的条带。这一结果表明6个Ttl代转Pid3-A4基因株系均为潮霉素抗性基因阳性植株。另外，转入PZHOl空载体的对照株的鉴定结果也为阳性。4、Pid3-A4基因过表达分析为进一步验证转基因情况，本发明又对上述步骤2获得的6个Ttl代转Pid3_A4基因株系(linel、line2、line3、line4、line7和line9)和转入PZHOl空载体的对照株进行了 Pid3-A4的过表达分析,具体如下以上述步骤2获得的6个Ttl代转Pid3_A4基因株系和转入PZHOl空载体的对照株为实验材料，提取其叶片总RNA，并利用DNAse I处理除去残留DNA，利用oligdT将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，用引物Pid3JF和Pid3JR扩增大小均为658bp的转入的Pid3-A4基因以及TP309水稻内源的Pid3_tp309基因(Pid3的同源基因)。同时以Actin为检测内参，所用引物为ActinF和ActinR。同时设置未转基因的TP309水稻作为对照。在以Actin为内参，进行半定量检测的情况下，如果待检测株系扩增得到的大小为658bp的目的条带的亮度明显强于作为对照的未转基因的TP309水稻，则判定该待检测株系为表达Pid3-A4基因的转基因株系。ActinF :5' -AGCAACTGGGATGATATGGA-3'
ActinR :5' -CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3'结果如图4所示,在其中的4个转基因株系(linel, line2, line3和line4)中检测到了 Pid3-A4基因的表达(目的条带亮度强于作为对照的未转基因的TP309水稻)，而另外2个转基因株系(line7和line9)与转入PZHOl空载体的对照株检测结果一致，均没有能够检测到Pid3-A4基因的表达(目的条带亮度与作为对照的未转基因的TP309水稻一致)。分析其原因，这可能是由于Pid3-A4基因在转基因株系line7和line9中的插入位置造成转入的Pid3-A4基因不能表达。二、转Pid3_A4基因水稻对稻瘟病的抗性检测I、对稻瘟病抗性的初步检测对上述步骤一 2中获得的6个Ttl代转Pid3-A4基因株系和转入PZHOl空载体的对照株进行抗稻痕病菌鉴定，所用稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小种为 zhong-10-8-14 (Shang,J. J. , et al.,2009 Identification of a New Rice BlastResistance Gene,Pid3，by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-Rich Repeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Genetics 182:1303-1311，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。具体如下在大田中，将上述步骤一 2中获得的6个Ttl代转Pid3_A4基因株系(linel、line2、line3、line4、line7和line9)和转入PZH01空载体的对照株植株进行移栽，均在移栽后一个月左右(未孕穗前)利用注射器分别进行注射接菌，具体为用无菌水将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)小种zhong-10-8-14配置成5X IO4孢子/毫升的孢子悬浮液,用普通医用注射器从水稻茎杆基部将Iml孢子悬浮液注入直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出。一周后调查发病情况(评判标准见表I)。同时设置未经转基因的TP309水稻作为对照。实验重复三次。表I水稻植株发病情况评判标准
fil级别发病情况
抗(R)0 无任何病斑
抗(R)I 直径小于0. 5mm的褐点病斑
中抗(mR)2 直径约为0. 5-Imm的褐点病斑
中感(mS)3 直径l-3mm的椭圆形病斑,边缘褐色，中央灰白色
感(S)4 典型的纺锤形病斑,直径3mm或更长,病斑稍有融合或无融合
感(S)5 典型的纺锤形病斑，由于病斑融合，叶片上半部枯死结果发现，6个转基因株系中只有检测到了 Pid3_A4表达的4个株系(linel、line2、line3和line4)表现为对稻痕病菌zhong-10-8-14的抗性(图4),而其他两个未能检测到Pid3-A4表达的株系(line7和line9)与未经转基因的TP309水稻和转入PZH01空载体的对照株相同，均表现为感病。为了进一步确认转入的Pid3_A4基因和抗病的相关性，对Ttl代中有抗病表现的I个株系(linel)的T1代分尚植株(16株)进行分子检测和抗稻痕病(稻痕病菌zhong-10-8-14)性状分析，其中，抗稻瘟病性状分析步骤同上所述，分子检测步骤见步骤一3中的(I)和(2)。同时设置未转基因的TP309水稻作为抗稻瘟病阴性对照，设置野生稻A4作为抗稻瘟病阳性对照。实验重复三次。结果如图5所示，转Pid3-A4基因株系Iinel的T1代分离植株中各植株的抗稻瘟病性状与Pid3-A4基因的表达与否是一一对应的。这一结果说明本实例从普通野生稻A4中分离的Pid3-A4基因是一个有功能的抗稻瘟病基因。2、Pid3-A4基因表达特性分析利用RT-PCR对Pid3_A4基因的表达模式进行分析，具体如下在大田中，用注射器将抗稻瘟病菌zhong-10-8-14的野生稻A4进行注射接菌，具体为用无菌水将稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小种zhong-10-8-14配置成5X IO4孢子/毫升的孢子悬浮液，用普通医用注射器从水稻茎杆基部将Iml孢子悬浮液注入直至悬浮 液从水稻茎杆顶部溢出。同时设置接水对照。在接菌或接水后不同的时间点(0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h)采集叶鞘和叶片并提取其总RNA，利用DNAse I处理除去残留DNAjlJ用oligdT将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，用引物Pid3JF和Pid3JR进行PCR扩增，并以Actin为检测内参,所用引物为ActinF和ActinR。结果如图6所示，接菌组和接水对照组中，Pid3_A4基因在各个时间点上的表达量基本一致。这一结果表明Pid3-A4基因在野生稻A4中表现为组成型表达，并且不受稻瘟病菌小种zhong-10-8-14所诱导。3、Pid3_A4基因对稻瘟病菌抗谱的测定尽管Pid3-A4基因与Pid3基因在序列上差异很小，但一般认为NBS-LRR类基因的LRR结构域决定了此类基因对稻瘟病菌小种的特异识别，而Pid3-A4基因和Pid3基因在LRR区域有6个氨基酸的差异，因此本发明对具有相同转基因受体TP309，并都在CAMV35S启动子控制下的Pid3-A4转基因植株T2代Iinel株系和Pid3转基因植株(Shang，J. J.，etal.，2009，Identification of a New Rice Blast Resistance Gene, Pid3, by GenomewideComparison of Paired Nucleotide-Binding Site-Leucine-Rich Repeat Genes andTheir Pseudogene Alleles Between the Two Sequenced Rice Genomes. Genetics182:1303-1311，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)进行了稻瘟病菌抗谱测定，所用稻瘟病菌小种共30个，其中12个为原来测定Pid3抗谱的12个稻瘟病菌小种(表 2 中编号 19-30) (Shang, J. J. , et al. , 2009Identification of a New Rice BlastResistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-Rich Repeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Genetics 182:1303-1311,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，另外18个是从四川省稻瘟病菌多发区域收集的稻瘟病菌小种(表2中编号1-18)(参考文献张雪梅.四川省水稻主栽品种抗瘟性评价和内恢99-14抗瘟性遗传分析[D].四川农业大学，2007年.白玉连.四川稻瘟病菌对杂交稻毒性的研究[D].四川农业大学，2008年.由四川省农科院植保所彭云良研究员在四川地区收集提供，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。分别将上述30个稻瘟病菌小种(表2中所示)接种到Pid3-A4转基因植株T2代Iinel株系和Pid3转基因植株进行稻瘟病抗谱测定，具体接种方法如下分别用无菌水将不同小种配置5X IO4孢子/毫升的孢子悬浮液，用普通医用注射器从水稻茎杆基部将Iml孢子悬浮液注入直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出，每个菌接三株，每株接三个分蘖。一周后调查发病情况(评判标准见表I)。同时设置未经转基因的TP309水稻和转入PZHOl空载体的水稻作为对照。实验重复三次。结果如表2所示，未经转基因的TP309水稻和转入PZHOl空载体的水稻对检测的所有稻瘟病菌小种均无抗性；Pid3-A4转基因植株所抗稻瘟病菌小种比Pid3转基因植株更多，主要体现为对四川收集的稻瘟病菌小种(表2中编号1-18)的抗性更强，具体为Pid3-A4转基因植株对稻瘟病菌小种10-25-1-1、03-11-37-1、10-120-21-2和10-62-2-1表现出抗性，而Pid3转基因植株未表现出抗性。因此，Pid3-A4基因对于在四川的抗稻瘟病育种中可能会具有更好的利用价值。表2Pid3_A4转基因植株对稻瘟病菌的抗谱
______福号■稻邊齒爾小利丨■TP309—琢空涵秘Pi,_____
^I^03-10-66-1SSRI
207-31-1-2SSRR
303-10-76-3SSRR
404-8-2-1SSSS
510-25-1-1SSRS
610-32-2-1SSIiiRmR
I10-62-3-1SSmSS
8IO-II7-17-1 SSSS
903-11-37-1SSRS
1007-55-1-1SSRR
II1047-9-2SSER
1210-120-21-2 SSRS
1307-21 冬 ISSRR
1410-62-2-1SSRS
1507-24-1-1SSmSS
1610-31-24SSSS
1707-26-2-2SSRR
1809-87-2-1SSRR
1991-65-1SSSS
20Sichuati26SSSS
21Y34SSRR
2299-26-2SSmRmR
23CH706SSRS
24ZIiong-10-8-14 SSER
25ZB15SSSS
2697-27-2SSRR
27CH45SSSS
28JS2001-108-1 SSRR
2999-20-2SSER
3099-26-1_SSSS
权利要求
1.蛋白质，是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗稻瘟病相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子为编码权利要求I所述蛋白质的基因，所述基因为如下I)-4)中任一所述的DNA分子 1)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求I所述蛋白质的DNA分子； 4)与I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码权利要求I所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。
7.权利要求I所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用 al)调控植物对稻瘟病的抗性； a2)选育抗稻瘟病植物品种。
8.一种培育抗稻瘟病转基因植物的方法，包括如下步骤将编码权利要求I所述蛋白质的基因导入目的植物，获得抗稻瘟病的转基因植物。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于所述稻痕病由下述稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小种中的至少一种引起JS2001-108_1、Zhongl0-8-14、97-27-2、03-10-66-l、07-31-1-2、03-10-76-3、10-25-卜I、10-32-2-1、03-1卜37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-1、07-26-22、09-87-2-1、Y34、99-26-2、CH706 和 99-20-2。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗稻瘟病相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的PID3-A4蛋白及其编码基因可用于培育抗稻瘟病植物新品种，特别是对由下述稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)小种中的至少一种引起的稻瘟病表现出抗性JS2001-108-1、Zhong10-8-14、97-27-2、03-10-66-1、07-31-1-2、03-10-76-3、10-25-1-1、10-32-2-1、03-11-37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-1、07-26-22、09-87-2-1、Y34、99-26-2、CH706和99-20-2。这将有利于对水稻品种的改良，对扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N1/21GK102702337SQ20121015892
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者吕启明, 徐吉臣, 徐筱, 朱立煌, 李仕贵, 李晓兵, 江光怀 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所