获得性抗性npr基因及其用途的制作方法

专利名称：获得性抗性npr基因及其用途的制作方法
背景技术：
本发明涉及到基因工程、植物生物学、植物病原体防御基因及其蛋白和植保领域。
植物病理学的最新进展已经提供了了解植物保护自身免遭病原体侵袭的细胞及分子遗传机制的基础。具体地说，已知植物至少采取两种不同类型的防御机制(ⅰ)超敏反应(“HR”)和(ⅱ)获得性抗性(“AR”)，包括系统获得性抗性(“SAR”)和局部获得性抗性(“LAR”)。这些防御机制讨论如下。
超敏反应植物以多种方式对病原微生物产生反应(Lamb,Cell 76:419-422,1994；Lamb等，Cell 56:215-224,1989)。发生在感染部位并经很好研究的一种防御反应叫作超敏反应(“HR”)，该反应涉及感染植物细胞或组织或该二者的快速局限性坏死。人们认为感染细胞的快速死亡使侵入病原体得不到足够营养供给，从而抑制病原体生长。进行HR的细胞表现出核DNA断裂(例如DNA梯化(DNA laddering)),DNA断裂是首先在动物系统中描述的编程性细胞死亡，表明HR涉及主动编程性细胞死亡(Mittler等，Plant Physiol.108:489-493,1995；Greenberg等，Cell 77:551-563,1994；Ryerson和Heath,PlantCell 8:393-402,1996；Wang等，Plant Cell 8:375-391,1996)。HR也伴随有膜相关的氧化爆发，从而导致NADPH依赖性产生O2和H2O2。这些活性氧类物质对侵入病原体可以有直接毒性，或者可以参与损伤周围的植物细胞壁的交联作用，以便对感染形成屏障(Bradly等，Cell 70:21-30,1992；Levine等，Cell 79:583-593,1994)。
在二十世纪五十年代，H.H.Flor提出了著名的遗传模型解释所观察到的结果，即特定病原体的某些品种(菌株)在宿主物种的特定栽培品种引起强超敏反应，而相同病原体的其它品种(菌株)则发生增殖并引起疾病(Flor,Annu.Rev.Phytopathol.9:275-296,1971)。引起HR的病原体被认为对所述宿主是无毒性的，该宿主被认为是抗性的，而该植物与病原体的相互作用被认为是不相客的。相反，在特定宿主引起疾病的菌株被认为是有毒性的，该宿主被认为是易感的，而该植物与病原体的相互作用被认为是相容的。在许多情况下，不相容性的分子基础似乎归因于病原体“无毒”(avr)基因与宿主“抗性”(R)基因之间的基因对基因的对应(Flor,Annu.Rev.Phytopathol.9:275-296,1971)。携带特定抗性基因的植物对携带相应avr基因的病原体是抗性的。关于avr与R基因的基因对基因对应关系的分子水平的简单解释是，avr基因产生信号，抗性基因编码针对该信号的同族受体。然后信号传导通路将该avr产生的信号传递到一组靶基因，所述靶基因启动HR和其它宿主防御反应(Gabriel和Rolfe,Annu.Rev.Phytopathol.28:365-391,1990；Keen,Plant Mol.Biol.19:109-122,1992；Lamb等，Cell 56:215-224,1989)。
已经从细菌和真菌植物病原体克隆了多种avr基因(Keen,PlantMol.Biol.19:109-122,1992)，并且至少在两种情况下基因对基因的相互作用通过实验得到证实，表明avr产生的纯化信号分子会引发HR(Culver和Dawson,Mol.Plant-Microbe Interact.4:458-463,1991；Joosten等，Nature 367:384-386,1994；Knorr和Dawson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:170-174,1988；van denAckerveken等，Plant J.7:359-366,1992)。在最近四年中也已克隆了几种符合典型基因对基因关系的植物抗性基因。这些基因包括番茄PTO基因(抗菌株丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringae pvtomato)，该菌株表达无毒基因avrPto(Martin等，Sience 262:1432-1436,1993))、拟南芥属RPS2和RPM1基因(抗丁香假单胞菌(P.syingae)，该类菌株分别表达无毒基因avrRpt2或avrRpm1(Bent等，Science 265:1089-1099,1994；Grant等，Science 269:843-846,1995；Mindrinos等，Cell 78:1089-1099,1994))、烟草N基因(抗烟草花叶病毒(Whitham等，Cell 78:1101-1105,1994))、番茄Cf9和Cf2基因(抗真菌病原体C.fulvum(Dixon等，Cell 84:451-459,1996；Jones等，Science 266:789-794,1994))，亚麻L6基因(抗真菌病原体亚麻栅锈菌(Melampsora lini)(Lawrence等，Plant Cell7:1195-1206,1995))以及水稻Xa21基因(抗水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)(Song等，Science 270:1804-1806,1995))。获得性抗性-系统及局部获得抗性HR不仅阻止感染病原体的局部生长，还认为它引发该植物非感染部分的其它防御反应，使该植物对多种通常有毒的病原体产生抗性(Enyedi等，Cell 70:879-886,1992；Malamy和Klessig,Plant J.2:643-654,1992))。后一种现象称为系统获得性抗性(SAR)，并且认为这是许多基因协同激活的结果，所述基因通常被称作病理相关(“PR”)基因。许多这类PR因的生物学功能还不清楚；然而，大量生理、生化和分子证据提示，特定PR因在赋予对病原体的抗性中起作直接作用。例如，某些PR基因编码直接抑制病原体体外生长的壳多糖酶和β-1,3-葡聚糖酶(Mauch等，Plant Physiol.88:936-942,1988；Ponstein等，Plant Physiol.104:109-118,1994；Schlumbaum等，Nature 324:365-367,1986；Sela-Buurlage等，Plant Physiol.101:857-863,1993；Terras等，K.Biol.Chem.267:15301-15309,1992；Woloshuk等，Plant Cell 3:619-628,1991)。此外，已表明在PR基因的转基因植物中的组成型表达，在少数情况下降低疾病易感性(Alexander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7327-7331,1993；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:1888-1892；1994；Terras等，Plant Cell 7:573-588,1995；Zhu等，Bio/Technology 12:807-812,1994)。
SAR最初由Ross定义(Virology 14:340-358,1961),Ross证明在初次接种烟草花叶病毒无毒毒株后，烟草对许多病毒感染具有抗性。随后证实，SAR也可以由其它病毒、细菌、真菌诱导产生，并且由任何特定病原体诱导的抗性对广谱病毒性、细菌性及真菌性疾病均有效(Cameron等，Plant J.5:715-725,1994；Cruikshank和Mandryk,J.Aust.Inst.Agric.Sci.26:369-372,1960；Dempsey等，Phytopathology 83:1021-1029,1993；Hecht和Bateman,Phytopathology 54:523-530,1964；Kuc,BioScience39:854-860,1982；Lovrekovich等，Phytopathology 58:1034-1035,1968；Mauch-Mani和Slusarenko,Mol.Plant-MicrobeInteract.7:378-383,1994；Uknes等，Mol.Plant-MicrobeInteract.6:692-698,1993)。
与SAR共有许多特性的另一种获得性植物防御反应是所谓的局部获得性抗性或“LAR”。LAR发生在成功增殖的病原体附近，以便阻止该病原体进一步扩散以及阻止发生继发感染。认为同一组PR蛋白通过LAR和SAR两者参与赋予抗性，并且如下所述，相同的信号分子似乎也是两种反应发生所需要的。
已经表明，当诸如水杨酸(SA)、2,6-二氯异烟酸(INA)及苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代甲酸S-甲酯(BTH)的某些化学物质外源性用于植物时，诱导SAR或LAR或同时诱导该二者(White,Virology 99:410-412,1979；Metraux等，Science 250:1004-1006,1991；Grlach等，Plant Cell 8:629-643,1996)。此外，几方面的证据表明，内源性产生的SA参与将HR和SAR起始偶联的信号传导途径。在烟草和黄瓜已经观察到，在伴随有SAR的无毒病原体感染之后SA浓度升高(Goodman和Plurad,Physiol.Plant.Pathol.1:11-16,1971；Malamy等，Science 250:1002-1004,1990；Metraux等，Science250:1004-1006,1990；Rasmussen等，Plant Physiol.97:1342-1347,1991)。SA的积聚也与随后的包括编码PR蛋白的那些基因的基因诱导有关(Van Loon和Van Kammen,Virology 40:199-211,1970；Ward等，Plant Cell 3:1085-1095,1991；Yalpani等，PlantCell 3:809-818,1991)。在烟草和拟南芥属中，外源性应用的SA可以诱导PR mRNA积聚，而这是SAR的特征之一(Uknes等，Plant Cell 4:645-656,1992；Ward等，Plant Cell 3:1085-1094,1991；White,Virology 99:410-412,1979)。
这些结果已经得出如下假说，即病原体感染的结果之一是体内积聚SA，这诱导一组蛋白质表达，这些蛋白质发挥作用限制该宿主发生进一步的感染(Ward等，Plant Cell 3:1085-1094,1991)。以下观测结果直接支持该假说，即表达编码水杨酸羟化酶的细菌基因的转基因烟草或拟南芥属植株不能积聚SA，结果是该植株不能表现出SAR或者LAR(Gaffney等，Science 261:754-756,1993)。因此，认为SA是体内建立SAR和LAR所需要的，而且如上所述，PR基因产物似乎直接参与赋予病原体抗性。
发明概述一般来说，本发明描述了包括编码获得性抗性(AR)多肽的序列的分离核酸分子的特征，其中所述获得性抗性多肽至少40％(最好是50％、70％、80％或90％)与图5(SEQ ID NO:3)或图7B(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列相同。优选的是，这种核酸分子编码介导表达病理相关多肽的获得性抗性多肽。在另一优选实施方案中，该获得性抗性多肽包括锚蛋白重复序列基元。
本发明的核酸分子来源于任何植物种类，包括但不限于被子植物(例如双子叶和单子叶植物)和裸子植物。可以获得所述核酸的典型植物包括但不限于甘蔗、小麦、水稻、玉米、甜菜、马铃薯、大麦、木薯属植物、甘薯、大豆、高粱、木薯、香蕉、葡萄、燕麦、番茄、小米、椰子、柑橘属植物、黑麦、甘蓝、苹果、西瓜、canola、棉花、胡萝卜、大蒜、洋葱、胡椒、草莓、薯蓣属植物、花生、洋葱、豆科植物、豌豆、芒果和向日葵。优选的核酸分子取自十字花科植物，例如拟南芥(Arabidopsis thalina)。十字花科获得性抗性分子的例子标示在图4(NPR基因组DNA；SEQ ID NO:1)和图5(NPR cDNA；SEQ ID NO:2)。其它优选核酸分子取自茄科植物，例如Nicotianaglutinosa。这种茄科植物获得性抗性分子的例子之一标示在图7A(SEQ ID NO:13)。
另一方面，本发明描述编码获得性抗性多肽的分离核酸分子(例如DNA分子)的特征，所述获得性抗性多肽与以下一种核酸分子特异性杂交，所述核酸分子包括图4(NPR基因组DNA；SEQ OD NO:1)、图5(NPR cDNA；SEQ ID NO:2)或图7A(SEQ ID NO:13)的核酸序列。优选的是，该特异性杂交的核酸分子编码介导表达病理相关多肽的获得性抗性多肽。在又一优选实施方案中，该特异性杂交的核酸分子编码包括锚蛋白重复序列基元的获得性抗性多肽。在再一优选实施方案中，该特异性杂交的核酸分子互补获得性抗性突变体(例如拟南芥属npr突变体)。本发明也描述化了一种RNA转录物的特征，该转录物含有互补任何上述分离核酸分子的序列。
在相关方面，本发明还描述了细胞或载体(例如植物表达载体)的特征，它们中的每一种都包含有本发明的分离核酸分子。在优选实施方案中，所述细胞为细菌(例如大肠杆菌或根癌农杆菌)或者是植物细胞(例如得自任何以上所列的农作物的细胞)。这种植物细胞对植物病原体(例如疫霉属(phytophthora)、霜霉属(Peronospora)或假单胞菌属(Pseudomonas)引起的疾病的抗性水平提高。在又一推荐实施方案中，本发明的分离核酸分子操作性连接到表达控制区，该控制区介导表达由所述核酸分子编码的多肽。例如，该表达控制区能够介导组成型、诱导型(例如病原体或创伤诱导的)或细胞特异性或组织特异性的基因表达。本发明还描述了含有本发明载体的细胞(例如诸如大肠杆菌或根癌农杆菌的细菌，或植物细胞)。
又一方面，本发明描述了一种转基因植物，该转基因植物包含本发明的任何上述核酸分子，该核酸分子整合到所述植物基因组，其中所述核酸分子在该转基因植物中表达。此外，本发明描述了得自这类转基因植物的种子和细胞。例如采用任何上述农作物植株，根据常规方法可以产生这类转基因植物。
再一方面，本发明描述了大致纯的获得性抗性多肽，所述多肽包括至少40％(最好是50％、70％、80％或90％)相同于图5(SEQ ID NO:3)或图7B(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。最好是，该获得性抗性多肽介导表达病理相关多肽。在其它优选实施方案中，该获得性抗性多肽包括锚蛋白重复序列基元或G蛋白偶联受体基元。这类获得性抗性多肽取自任何植物种，例如上述农作物。在优选实施方案中，本发明的所述多肽取自十字花科种植物，例如拟南芥；或取自茄科种植物，例如Nicotiana glutinosa。
在相关方面，本发明也描述了产生获得性抗性多肽的方法。所述方法包括(a)提供用本发明核酸分子转化的细胞，该核酸分子在此细胞中定位表达；(b)在表达所述核酸分子的条件下培养该转化细胞；以及(c)回收该获得性抗性多肽。本发明还描述了由本发明分离核酸分子的这种表达所产生的重组获得性抗性多肽，并且描述了特异性识别并结合于获得性抗性多肽或其某部分的大致纯抗体。
另一方面，本发明描述化了在转基因植物中使对植物病原体引起的疾病的抗性水平提高的方法。所述方法包括(a)产生包含本发明核酸分子的转基因植物细胞，所述核酸分子整合到该转基因植物细胞的基因组中并在该植物细胞中定位表达；以及(b)由所述植物细胞生长转基因植物，其中所述核酸分子在转基因植物中表达，并由此提供对由植物病原体引起的疾病具有较高抗性水平的转基因植物。
另一方面，本发明描述了分离获得性抗性基因或其片段的方法。第一种方法包括(a)在杂交条件下，将本发明核酸分子或其一部分与得自植物细胞的DNA制剂接触，所述杂交条件提供对DNA序列的检测，所述DNA序列的40％或更长的序列相同于图4(SEQ OD NO:1)、图5(SEQ ID NO:2)或图7A(SEQ ID NO:13)的核酸序列；和(b)分离杂交DNA并用作获得性抗性基因或其片段。第二种方法包括(a)提供植物细胞DNA样品；(b)提供一对寡核苷酸，所述寡核苷酸与本发明核酸分子的一个区具有序列同一性；(c)在适合聚合酶链式反应介导的DNA扩增的条件下，将该对寡核苷酸与所述植物细胞DNA接触；以及(d)分离所扩增的获得性抗性基因或其片段。
在第二种方法的优选实施方案中，所述扩增步骤采用从植物细胞制备的cDNA样品进行。此外，在第二种方法中使用的该对寡核苷酸基于编码获得性抗性多肽的序列，其中所述获得性抗性多肽至少40％(最好是50％、60％、70％、80％或90％)相同于图5(SEQ ID NO:3)或图7B(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
“获得性抗性”基因或“AR”基因，指的是编码能够在植物细胞或植物组织中触发植物获得性抗性反应(例如系统获得性抗性反应(SAR)或局部获得性抗性反应(LAR))的多肽的基因。所述反应可以发生在转录水平，或者它可以是酶性的或结构性的。采用任何本文公开的序列并结合本领域已知的常规方法，可以从任何植物种、尤其是农业上重要农作物鉴定以及分离AR基因。
“多肽”是指任何氨基酸链，不考虑其长度或翻译后的修饰(例如糖基化或磷酸化)。
“病理相关”多肽或“PR”多肽是指表达的同时建立SAR或LAR的多肽。典型的PR蛋白包括但不限于壳多糖酶、PR-1a、PR1、PR5、GST(谷光甘肽-S-转移酶)、以及β-1,3-萄聚糖酶、渗透蛋白、硫堇、多种富含甘氨酸的蛋白质(GRP)、苯丙氨酸解氨酶(PLA)以及脂肪氧化酶(LOX)。
“锚蛋白重复序列”基元是指在能够介导蛋白质与蛋白质相互作用的种类繁多的蛋白质中发现的共有基元。锚蛋白重复序列基元描述于Michaely及Bennett(Trends in Cell Biology 2:127-129,1992)和Bork(Proteins:Structure,Function,and Genetics17:363-374,1993)。
“大致相同”是指多肽或核酸显示至少40％、优选50％、更优选80％以及最优选90％或者甚至95％同源于参比氨基酸序列(例如标示在图5(SEQ ID NO:3)或图7B(SEQ ID NO:14)中的氨基酸序列)或核酸序列(例如分别标示在图4、图5、图7A中的核酸序列SEQ ID NO:1、2和13)。对于多肽，比较序列的长度一般至少是16个氨基酸，优选至少为20个氨基酸，更优选至少为25个氨基酸，而最优选为35个氨基酸。对于核酸，比较序列的长度一般是至少50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，而最优选110个核苷酸。
通常采用序列分析软件测定序列同一性(例如，the GeneticsComputer Group(University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,WI 53705,BLAST)的序列分析软件包或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这种软件通过与各种不同置换、缺失和/或其它修饰的同源性的对齐程度，匹配相同或类似的序列。保守置换通常包括在以下组别内的置换甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“大致纯的多肽”是指已经从天然伴随组分中分离出来的AR多肽(例如诸如NPR1的NPR多肽)。该多肽至少是60％(重量)时，所述多肽为大致纯，不含与其天然相连的蛋白质以及天然存在的有机分子。该制剂优选至少含75％，更优选为至少含90％，而最优选为至少含99％(重量)的AR多肽。可以获得大致纯AR多肽，例如通过从天然资源(例如植物细胞)提取；表达编码AR多肽的重组核酸；或者化学合成该蛋白质。可以采用任何合适的方法测定纯度，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
“得自”是指从中分离或含有天然存在序列的序列(例如cDNA、基因组DNA、合成的或其组合物)。
“分离DNA”是指不含下述基因的DNA，这种基因在获取本发明DNA的有机体的天然存在基因组中邻接所述基因。因此该术语包括，例如掺入到载体的重组DNA；掺入到自主复制型质粒或病毒中的重组DNA；或掺入到原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA；作为独立分子(例如cDNA、或PCR或限制性内切酶消化产生的基因组片段或cDNA片段)存在的重组DNA。也包括是编码另一多肽序列的杂种基因一部分的重组DNA。
“特异性杂交”是指核酸序列至少在如本文所述的低严格条件下，最好是在也如本文所述的高严格条件下能够与DNA序列杂交。
“转化细胞”是指通过重组DNA技术已经导入编码(如本文所采用)AR多肽的DNA分子的细胞(或其祖代)。
“定位表达(positioned for expression)”是指所述DNA分子位于指导该序列转录和翻译的DNA序列的附近(即促进产生例如AR多肽、重组蛋白或RNA分子)。
“报道基因”是指其表达可以检测的基因；这类基因包括但不限于β-葡萄糖醛酸糖苷酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、除草剂抗性基因和抗生素抗性基因。
“表达控制区”是指任何足以指导转录的最小序列。本发明包括足以使启动子依赖性基因表达的启动子元件，该启动子元件可控制细胞、组织、器官特异性基因表达；或者由外源信号或试剂(例如光、病原体、创伤、应激或激素诱导型元件或诸如SA或INA的化学诱导剂)可诱导的元件；这类元件可以位于天然基因的5’或3’区，或者可以工程操作到转基因构建物中。
“可操作连接的”是指当合适的分子(例如转录激活蛋白)连接到调节序列时，基因和所述调节序列以允许基因表达的方式连接。
“植物细胞”是指以半渗透膜为界并含有质体的任何自我繁殖细胞。假如这种细胞需要进一步繁殖，则需要细胞壁。本文所采用的植物细胞包括但不限于藻类、蓝细菌、种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶子、根、茎、枝、配子体、孢子体、花粉以及小孢子。
“十字花科植物”是指分类于十字花科的任何植物。所述十字花科包括许多农作物，所述农作物包括但不限于油菜(例如Brassicacampestris和甘蓝型油菜(Brassica napus))、嫩茎花椰菜、甘蓝、抱子甘蓝、小萝卜、羽衣甘蓝、中国羽衣甘蓝、球茎甘蓝、花椰菜、芜菁、芜菁甘蓝、芥菜类、辣根和拟南芥属。
“转基因”是指人工插入细胞中并成为该细胞发育成的有机体的基因组组成部分的任何DNA片段。这样的转基因可以包括部分或完全异源(即外源性的)于所述转基因生物体的基因；或者可以是同源于该生物体内源性基因的基因。
“转基因的”是指包含人工插入细胞中并成为该细胞发育成的有机体的基因组组成部分的DNA的任何细胞。作为本文所应用的，所述转基因有机体一般是转基因植物，而所述DNA(转基因)人工插入到细胞核或质体基因组中。根据本发明的转基因植物可以含有一种或多种获得性抗性基因。
“病原体”是指其对活植物组织的感染在植物组织中引起疾病反应的有机体。这类病原体包括但不限于细菌、支原体、真菌、昆虫、线虫、病毒和类病毒。由这些病原体引起的植物疾病描述于Agrios,Plant Pathology，第3版的第11-16章(Academic Press,Inc.，纽约，1988)。
细菌病原体的例子包括但不限于欧文氏菌属(Erwinia)(例如胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora))、假单胞菌属(例如丁香假单胞菌)和黄单胞菌属(Xanthomonas)(例如野油菜黄单胞菌(X.campepestris)和水稻黄单胞菌)。
引起真菌病的病原体的例子包括但不限于链格孢属(Alternaria)(例如，A.brassicola和腐皮链格孢(A.solani))、壳二孢属(Ascochyta)(例如，豌豆壳二孢(A.pisi))、葡萄孢属(Botrytis)(例如，灰萄萄孢(B.cinerea))、尾孢属(Cercospora)(例如，菊池尾孢(C.kikuchii)和玉蜀黍尾孢(C.zaea-maydis)、刺盘孢属(Colletotrichum)菌种(例如，豆刺盘孢(C.lindemuthianum))、色二孢属(Diplodia)(例如，玉蜀黍色二孢(D.maydis))、白粉菌属(Erysiphe)(例如，禾谷白粉菌禾谷小种(E.graminis f.sp.graminis)和禾白粉菌大麦小种(E.graminis f.sp.hordei))，镰孢属(Fusarium)(例如，雪腐镰孢(F.nivale)和尖镰孢(F.oxysporum)、禾本科镰孢(F.graminearum)、腐皮镰孢(F.solani)串珠镰孢(F.monilforme)和粉红镰孢(F.roseum))、顶囊壳属(Gaeumanomyces)(例如，禾谷顶囊壳小麦小种(G.graminis f.sp.tritici))、长蠕孢属(helminthosporium)(例如，大斑病长蠕孢(H.turcicum)、炭色长蠕孢(H.carbonum)和玉蜀黍长蠕孢(H.maydis))、壳球孢属(Macrophomina)(例如，菜豆壳球孢(M.phaseolina)和Maganaporthe grisea)、丛赤壳属(Nectria)(例如N.heamatocacca)、霜霉属(Peronospora)(例如，东北霜霉(P.manshurica)、烟草霜霉(P.tabacina))、茎点霉属(Phoma)(例如，甜菜茎点霉(P.betae))、瘤梗孢属(Phymatotrichum)(例如，多主瘤梗孢(P.omnivorum))、疫霉属(例如，樟疫霉(P.cinnamomi)、恶疫霉(P.cactorum)、菜豆疫霉(P.phaseoli)、寄生疫霉(P.parasitica)、柑桔褐腐疫霉(P.citrophthora)、大雄疫霉酱油小种(P.megasperma f.sp.sojae)和致病疫霉(P.infestans))、单轴霉属(Plasmopara)(例如，葡萄生单轴霉(P.viticola))、叉丝单囊壳属(Podosphaera)(例如，白叉丝单囊壳(P.leucotricha))、柄锈菌属(Puccinia)(例如，高粱柄锈菌(P.sorghi)、条形柄锈菌(P.striiformis)、禾谷柄锈菌小麦小种(P.graminis f.sp.tritici)、天门冬属柄锈菌(P.asparagi)、隐匿柄锈菌(P.recondita)和落花生柄锈菌(P.arachids)、Puthium(例如，P.aphanidermatum)、核腔菌属(Pyrenophora)(例如，偃麦草核腔菌(P.tritici-repentens))、Pyricularia(例如，P.oryzea)、腐霉属(Pythium)(例如，终极腐霉(P.ultimum))、丝核菌属(Rhizoctonia)(例如，腐皮丝核菌(R.solani)和禾谷类丝核菌(R.cerealis))、Scerotium(例如，S.rolfsii)、核盘菌属(Sclerotinia)(例如，核盘菌(S.sclerotiorum))、壳针孢属(Septoria)(例如，S.lycopersici、大豆壳针孢(S.glycines)、颍枯壳针孢(S.nodorum)和小麦壳针孢(S.tritici)、根串珠霉属(Thielaviopsis)(例如根串珠菌(T.basicola)、钩丝壳属(Uncinula)(例如，葡萄钩丝壳(U.necator))、黑星菌属(Venturia)(例如，苹果黑星菌(V.inaequalia))、轮枝孢属(Verticillium)(例如，大丽花轮枝孢(V.dahliae)和黄萎轮枝孢(V.albo-atrum))。
致病线虫的例子包括但不限于根结线虫(例如，根结线虫属种(Meloidogyne sp.)，诸如假根根结线虫(M.incognita)、沙生根结线虫(M.arenaria)、M.chitwoodi、M.hapla、爪哇根结线虫(M.javanica)、M.graminocola、M.microtyla、禾谷根结线虫(M.graminis)和M.naasi)；包囊线虫(例如，异皮线虫属种(Heteroderasp.)，诸如史氏轭囊线虫(H.schachtii)、大豆异皮线虫(H.glycines)、H.sacchari，水稻异皮线虫(H.oryzae)、H.avenae、H.cajani、H.elachista、H.goettingiana、禾谷异皮线虫(H.graminis)、H.mediterranea、H.mothi、高粱异皮线虫(H.sorghi)和玉米异皮线虫(H.zeae)；或例如，Globodera sp.，诸如G.rostochiensis和G.pallida)、侵袭根部的线虫(例如，Rotylenchulus reniformis、Tylenchuylus semipenetrans、Pratylenchus brachyurus、Radopholus citrophilus、毕肖穿孔线虫(Radopholus similis)、美利坚剑线虫(Xiphinema americanum)、Xiphinema rivesi、Paratrichodorus minor、Heterorhabditisheliothidis和Bursaphelenchus xylophilus)和地面上的线虫(hematode)(例如，Anguina funesta、Anguina tritici、Ditylenchus dipsaci、Ditylenchus myceliphagus和Aphenlenchoides besseyi)。
病毒病原体的例子包括但不限于烟草花叶病毒、烟草坏死病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、番茄斑萎病毒和番茄环斑病毒“抗性水平提高”是指在本发明转基因植物中对致病病原体的抗性水平高于对照植物(例如非转基因植物)的抗性水平。在优选实施方案中，本发明转基因植物的抗性水平至少高于对照植物抗性水平20％(最好是30％或40％)。在其它优选实施方案中，对致病病原体的抗性水平高于对照植物50％、60％，而更优选甚至高75％或90％；高于对照植物抗性水平高达100％是最优选的。采用常规的方法检测抗性水平。例如，通过比较转基因植物的生理特性和特征(例如株高和植株重量；或比较疾病症状，例如延迟损伤发生、损伤大小减少、叶萎蔫及卷曲、水浸斑以及细胞变色)可以确定对病原体的抗性水平。
“可检测标记的”是指标记分子及鉴定分子存在的任何直接或间接方法，所述分子例如为寡核苷酸探针或引物、基因或其片段、或cDNA分子或其片段。可检测标记一个分子的方法是本领域众所周知的，包括但不限于放射性标记(例如用同位素，诸如32P或35S)和非放射性标记(例如化学发光物标记，诸如荧光素标记)。
“纯化抗体”是指至少含有抗体60％(重量)的抗体制剂，它不含与其天然相连的蛋白质和天然存在有机分子。该制剂优选含有抗体至少75％(重量)，更优选90％，而最优选至少99％，所述抗体是例如获得性抗性多肽特异性抗体。例如通过采用重组产生的获得性抗性多肽和标准技术的亲和层析，可以获得纯化AR抗体。
“特异性结合”是指识别并结合AR蛋白的抗体，但是该抗体大致不识另并结合样品中的其它分子，所述样品例如为天然含有诸如NPR的AR蛋白的生物样品。
如以上所讨论，已经鉴定了几种基本的获得性抗性基因，所述抗性基因负责提供植物抵御病原体以保护自身的能力。相应地，本发明对抗其病原体以保护植物提供了许多重要的进展和优点。例如通过提供易于掺入并在所有植物种中表达的本文所述的AR基因，本发明简化了用于抗植物病原体以内源性保护植物的有效而经济的方法。这种抗病原体的保护使得对传统化学措施(例如使用杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀昆虫剂或杀病毒剂)的需要减少或最小化，所述化学措施通常由农民实施使用，以控制植物病原体的曼延并提供抗致病病原体的保护。此外，因为本文所述的表达一种或多种获得性抗性基因的植物较少受病原体及其疾病的损害，所以本发明还使生产效率提高以及农作物及观赏植物的品质改良和产量提高。因此，本发明的贡献在于生产高品质以及高产量的农产品例如病原体引起的斑点、生理缺点及污斑减少的水果、观赏植物、蔬菜、谷物及农作物；有限保存期增加及管理成本降低的农产品；以及高品质和高产量的农用(例如谷物及农作物)、工业用(例如油料种子类)、以及商用(例如纤维作物)农作物。此外，因为本发明减少了抵抗植物病原体的化学保护的需要，所以本发明有益于所述农作物生长的环境。遗传改良的种子和采用表达本文所述基因的植物生产的其它植物产品，也使先前不适宜农业生产区域的种植变成可能。本发明还提供了介导表达病理相关蛋白(例如赋予抗植物病原体的壳多糖酶和GST)的方法。例如组成型产生AR基因产物的转基因植物能够激活PR基因表达，所述PR基因表达再赋予抗植物病原体的抗性。由AR基因产物介导的综合表达PR基因，消除了作为促进植物防御机理方法的各个PR基因表达的需要。
本发明对提供AR基因的核酸序列及氨基酸序列也是有用的，所述核酸及氨基酸序列有助于从任何植物种分离及鉴定AR基因。
本发明的其它特性及优点从其以下优选实施方案的说明以及权利要求很容易看出。
详细说明首先描述附图。附1是显示拟南芥染色体I及NPR1的物理图谱示意图。
图2A是RNA印迹分析的照片，显示PR-1基因在野生型植物(Col-0,1-3道)、npr1-2突变植物(4-6道)、用非互补粘粒转化的npr1-2转化体(m305-2-7,7-9道)以及用互补粘粒转化的npr1-2转化体(21A4-P5-1,10-12道和21A4-6-1,13-15道)中的表达。RNA样品从生长在MS培养基(1、4、7、10和13道)、含0.1mM INA的MS培养基(2、5、8、11和14道)以及含0.1mm SA的MS培养基(3、6、9、12和15道)的15天龄幼苗制备。
图2B是一系列照片，显示Psm ES4326在野生型(左侧图)、npr1-1(中间图)及用互补粘粒转化的npr1-1转化体(21A4-4-3-1，右侧图)中诱导的疾病症状(顶部图)及BGL2-GUS表达(底部图)。
图2C是一组图，显示Psm ES4326在野生型、npr1-2及用互补粘粒(21A4-P5-1)转化的npr1-2转化体中的生长。误差线是对数转化数据的95％可信限，正如Sokal和Rohlf所述(Biometry，第2版，W.H.Freeman and Company，纽约，1981)。
图2D是一组直方图，显示在野生型、npr1-2和用互补粘粒(21A4-P5-1)转化的npr1-2转化体中寄生霜霉NOCO感染的疾病等级。疾病等级分级的定义如下0级，植物上无分生孢子梗；1级，每片感染叶的分生孢子梗不超过5个；2级，少数感染叶上的分生孢子梗有3-20个；3级，大部分感染叶上的分生孢子梗有6-20个；4级，全部感染叶上的分生孢子梗有5个或5个以上；5级，全部感染叶上的分生孢子梗有20或20个以上。
图3是显示含有所述NPR1基因的7.5kb区的限制图谱的示意图。
图4是显示含有所述基因的获得性抗性核酸序列的7.5kb区的基因组序列的示意图，所述基因是得自拟南芥、叫做NPR1(SEQ ID NO:1)的基因。
图5是显示获得性抗性蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO:2)和推定氨基酸序列(SRQ ID NO:3)的示意图，所述获得性抗性蛋白是得自拟南芥、叫做NPR1的蛋白。编号为262-289、323-371及453-469的氨基酸分别同源于小鼠锚蛋白、锚蛋白重复序列基元和G蛋白偶联受体基元。
图6A是显示NPR1氨基酸序列与小鼠锚蛋白3(ANKB)的序列比较的示意图。标明了采用BLAST检索产生的产生最高计数对的两个区(最小sum概率=0.0004)。相同及相似的氨基酸(+)用粗圆体字母突出表示。
图6B是显示NPR1中的锚蛋白重复序列与衍生自Michaely及Bennett(Trends in Cell Biology 2:127-129,1992)和Bork(Proteins:Structure,Function,and Genetics 17:363-374,1993)的锚蛋白重复共有序列的序列比较的示意图。因为所述两种衍生共有序列之间有少数的非重叠氨基酸，所以将两种序列都标示出来。在Bork衍生的共有序列中的保守特征标示如下t，转角类或极性；o,S/T；h，疏水的；大写字母，保守氨基酸。与所述共有序列相同的氨基酸用粗圆体字母突出显示。
图7A是显示从Nicotiana glutinosa分离的NPR1同系物的cDNA序歹(SEQ ID NO:13)的示意图。
图7B是显示图7A所示的Nicotiana glutinosa的NPR1同系物的推定氨基酸序列(SEQ ID NO:14)的示意图。
图8A图示NPR1讨转基因拟南芥属抗细菌病原体Psm ES4326的抗性的剂量效应。对于Psm ES4326感染(初始接种物OD600=0.001)，在每一时间点取8个样品。误差线是对数转化数据的95％可信限。菌落形成单位叫做cfu。
图8B是显示NPR1对转基因拟南芥属抗真菌致病菌寄生霜霉NOCO2的抗性的剂量效应的直方图。寄生霜霉的孢子悬浮液(3×104孢子/mL)用于这些感染研究，并在感染后7天计数每一植株上的分生孢子梗数。采用Wilcoxon双样本检验分析上述数据。在95％可信限水平，所有样品对之间均显示生长的显著性差异，除Col NR1-M和ColNPR1-H以及Col和Col NPR1-L外。
图9A是显示诱导型BGL2-GUS恢复35S-NPR1-GFT转基因植物中表达的照片。幼苗或在MS或在MS-INA(0.1mM)培养基上生长14天，并染色用于GUS活性测定。
图9B是显示35S-NPR1-GFP互补拟南芥属npr1突变体的SA敏感性的照片。幼苗在MS-SA(0.5mM)培养基上生长7天。NPR1-GFP转基因在SA上恢复npr1的正常生长。然而，mGFP转基因不能恢复npr1的正常生长。请注意，所用的NPR1-GFP系是T2代。所观察到的3∶1分离比表明所述转基因植物含有单基因座NPR1-GFP插入。
图9C显示恢复所述T2NPR1-GFP转化体寄生霜霉抗性的直方图。用孢子悬浮液(3×104孢子/mL)感染前，INA处理(0.65mM)72小时。在感染后7天，就植物上的分生孢子梗数记录疾病症状。疾病等级分级的定义如下0级，植物上无分生孢子梗；1级，每片感染叶的分生孢子梗不超过5个；2级，少数感染叶上的分生孢子梗有3-20个；3级，大部分感染叶上的分生孢子梗有6-20个；4级，全部感染叶上的分生孢子梗有5个或5个以上；5级，全部感染叶上的分生孢子梗有20或20个以上。在0、4、5类幼苗也检测到NPR1-GFP转基因的存在，并将NPR1-GFP转化体的数目标示在括号内。大多数的寄生霜霉抗性植物(0类)含有NPR1-GFP转基因；然而，观察到所有敏感植物(4和5类)分离为缺乏所述转基因的非转化体。


图10是显示应答SAR化学激活剂的NPR1-GFP定位的照片。含有或NPR1-GFP(顶部和底部图)或mGFP转基因(中间图)的转化体在MS或MS-INA培养基上生长7天。在叶肉细胞和保卫细胞中用聚焦显微镜显示GFP荧光。在红光波道显示DIC，而在绿光波道显示GFP。
图11A-G是一系列显示在应答Psm ES4326感染中NPR1-GFP的定位照片。用或Psm ES4326(图11B)或10m MgCl2(图11E)浸润NPR1-GFP转化体叶的左侧，3天后染色用于BGL2-GUS表达检测。在GUS染色前，分析所述叶的浸润侧(图11A和图11D)及非浸润侧(图11C)的GFP的定位。用Psm ES4326(图11F)或10m MgCl2(图11G)浸润mGFP转化体叶，并分析GFP的定位。概述采用拟南芥作为模型系统进行遗传研究，是为了鉴定控制信号通道的关键元件，所述信号通道在植物中诱导产生抗病原体感染的获得性抗性(AR)，例如系统获得性抗性(SAR)反应。通过用0.1mm水杨酸(SA)或0.1mm 2,6-二氯异烟酸(INA)处理，或在诸如丁香假单胞菌菜豆致病变种NP3121/avrRpt2(P.s.phaseolicoal 3121/avrRpt2)的无毒病原体感染后，可以在野生型拟南芥属植物中诱导SAR反应。对有毒病原体(例如丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonassyringae pv maculicola)ES4326(P.s.maculicola ES4326)的抗性增强以及病理相关基因(例如包括PR1、BGL2及PR5的PR基因)表达的增加，证实了SAR。为了便于检测PR因表达和鉴定SAR信号通道中异常的突变体，构建BGL2-GUS报道基因并转化到拟南芥生态型Columbia中。通过用0.3％甲磺酸乙酯处理种子11小时，诱变含有BGL2-GUS转基因的亲本系。筛选在存在SAR诱导剂SA和INA的情况下缺乏BGL2-GUS表达的诱变群的M2子代(Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994)。
采用这些技术分离npr1-1(PR因的非表达体(nonexpresser ofPR genes))突变体，而且发现该突变体几乎完全缺乏BGL2-GUS报道基因表达以及缺乏应答SA、INA以及无毒病原体处理时的内源性PR1、BGL2及PR5基因的表达(Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994)。npr1-1突变体的进一步特征鉴定，表明NPR1基因的突变完全阻断SAR的诱导。在用SA、INA或无毒病原体预处理的npr1-1植株中，有毒病原体(例如丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326)的生长不受抑制，正如在携带野生型NPR1基因的亲本系中发现的一样。该发现证实NPR1基因在导致建立SAR的信号通道中起着重要的作用。
分离出npr1的另外两种突变体，npr1-2和npr1-3，其分离基础是它们较野生型植株对丁香假单胞菌斑生致病变种菌株ES4326更易感(Glazebrook等，Genetics 143:973-982,1996)。遗传互补试验表明npr1-1、npr1-2及npr1-3是等位的。
NPR1基因不仅控制系统抗性的起始，而且发现该基因影响局部获得性抗性(“LAR”)，即植物限制有毒病原体感染扩散的能力。有毒病原体丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326在npr1突变体植株中较在野生型植株中生长的程度更高，并且进一步扩散到侵入初始部位以外。当测试不同菌株的寄生霜霉时，在npr1突变体中的SAR和LAR减弱的效应也是明显的。在感染寄生霜霉菌株后观察到疾病症状(即霜霉病)，上述拟南芥属野生型亲本系对该菌株是抗性的，表明npr1突变体中“天然”抗性被破坏。npr1突变的效应似乎是防御反应特异性的。在三种等位npr1突变体(npr1-1,npr1-2,npr1-3)中未观察到显著的形态表型。然而，当生长在含高浓度SA(0.5mM)的培养基时，所有三种npr1突变体的生长均受阻于子叶期，且幼苗褪色黄花。观察到野生型植株在存在0.5mM SA的情况下正常生长。
npr1突变体的表型清楚证实了拟南芥的NPR1基因在控制抗广谱病原体的防御反应中的生物学意义。
采用基于图谱的定位克隆策略，克隆NPR1基因。根据其互补npr1突变体的能力，首先将在所述拟南芥属基因组的NPR1位置确定到7.5kb区，该区包含于粘粒克隆21A4-4-3-1、21A4-6-1-1、21A4-P5-1、21A4-P4-1及21A4-2-1中。通过RNA印迹分析，鉴定SA诱导的2.0kbRNA转录物，该转录物在对应于NPR1的7.5kb区内编码。分离这种获得性抗性基因有助于从具有农业或经济重要性的植物克隆AR基因。例如使AR基因在农作物中工程性异位表达，这对于提供形成对病原体感染的抗性增强的植物的新策略是有用的。
现接下来描述克隆拟南芥属AR基因NPR1的克隆。也描述从Nicotiana glutinosa克隆NPR1同系物。提供这些实施例的目的是为了说明本发明，而不应该解释为限制本发明。遗传分析拟南芥属的SAR和分离npr1突变体采用拟南芥，已经鉴定了SA和INA诱导的SAR上游信号通道的组成成分。我们特别探寻了在附加SA或INA存在的情况下不表达PR基因的拟南芥属突变体。因为没有与这类突变相关的已知可见表型，所以建立了在β-1,3-葡聚糖酶(BGL2)启动子(Dong等，Plant Cell 3:61-72,1991)的控制下表达β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)的转基因拟南芥属植株。BGL2基因是一种受SA调节的PR基因(Uknes等，Plant Cell4:645-656,1992)。简单地说，用甲磺酸乙酯(EMS)诱变得自转基因系(BGL2-GUS)的种子，并在SA或INA处理后筛选所产生的异常表达GUS的突变体。这些筛选结果表明，采用在含有SA或INA的平板上生长2周的植株的单片叶，可以在96孔微量滴定板的单孔中检测到高水平的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)活性。筛选拟南芥属突变体，所述突变体或者在无SA或INA处理的情况下组成性表达BGL2-GUS报道基因，或者用SA或INA处理后不能表达该报道基因。这些筛选使得鉴定了一系列称为cpr和npr的突变体(分别是PR基因的组成型表达体(constitutiveexpresser of PR genes)和PR基因的非表达体(nonexpresser of PRgenes))，这些突变体确定了既参与特异性调节BGL2又参与一般调节SAR的基因(Bowling等，Plant Cell 6:1845-1857，1994；Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994)。构建BGL2-GUS转基因拟南芥属Xba1-SphⅠ片段(2025个碱基对(bp))含在拟南芥属BGL2基因起始密码子上游的1746bp的非编码序列，将所述片段在ATG位点融合到大肠杆菌uidA基因(称为GUS基因)的编码区，并将其转移到载体pB1101中，然后再用来转化拟南芥属生态型Columbia(Valvekens等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5536-5540,1988)。基于这些植株的子代抗卡那霉素以及存在用Southern杂交检测到的转基因，鉴定了BGL2-GUS纯合型植株。诱变BGL2-GUS转基因系通过将～36,000粒种子暴露于0.3％甲磺酸乙酯11小时，在BGL2-GUS/BGL2-GUS转基因系中进行诱变。播种种子，并允许该植株自花授粉以产生M2种子，M2种子收集于12个各自独立的库中。鉴定npr1突变体所述M2种子在MS培养基上萌发，该MS培养基附加了0.8％琼脂、0.5g/mL Mes(2-(N-吗啉基)乙磺酸)pH5.7、2％蔗糖、50μg/mL卡那霉素以及100μg/mL氨苄青霉素。或者加入0.5mM水杨酸(SA)或者加入0.1mm INA以诱导系统获得性抗性(SAR)。培育15天后给待检测的每一幼苗编号，然后从每一幼苗取一片叶，并将其放入96孔微量滴定板中的相应样品孔中，该样品孔含有100μlβ-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)底物液(50mM Na2HPO4 pH7.0、10mM Na2EDTA、0.1％Titon-100、0.1％sarkosyl、0.7μl/mLβ-巯基乙醇和0.7mg/mL 4-甲基伞形基β-D-葡糖苷酸)。收集所有样品后，将该微量滴定板置于真空2分钟，以便浸润所述样品，然后在37℃温育过夜。用长波长UV光检测样品中的GUS活性荧光产物(4-甲基伞形酮)。在MS平板上鉴定不显示GUS活性的那些幼苗，并将其移植到土壤以结籽。在这些推定突变体的子代中重复上述过程，以便保证所述突变体表型是可遗传的并鉴定纯合突变体。所测试的13,468株M2植株中的181株，在存在或SA或INA的情况下未表现GUS活性。在M3代中，139个测试株系中的77个株系保持GUS活性的突变表型，76个株系既不应答SA又不应答INA,1个株系不应答SA但是应答INA。
预测不应答SA或INA处理的突变体携带有三类突变(1)调节基因突变，该突变不仅影响所述转基因的表达，而且影响内源性PR基因的表达；(2)在所述转基因的启动子中突变，该突变影响BGL2-GUS的应答，但不影响内源性PR基因应答SA和INA；以及(3)在所述GUS基因的编码区中突变，该突变消除了GUS酶活性，但未消除GUS mRNA的转录。为了区分这些类别，分析M3代的内源性PR基因的表达。调节基因突变应很容易地在M3代由其它SAR相关PR基因的异常表达水平区别开来。
对上述77个突变株系进行RNA凝胶印迹分析，以鉴定具有PR基因修饰表达的株系。表达拟南芥属线粒体β-ATP酶基因用作加样对照。在该77个突变株系中，发现6个株系的内源性PR基因表达在一定程度上降低(第1类)；3个株系显示仅有BGL2-GUS表达异常(第2类)；以及发现14个株系有GUS活性降低，但是BGL2-GUS转录正常(第3类)。在存在SA或INA的情况下，与野生型相比，1株第1类突变体(npr1-1)表现出GUS、BGL2和PR-1基因的表达显著降低。因此，选择npr1-1做进一步的研究。
测试该npr1突变体的PR-5诱导，PR-5是另外一种已经在拟南芥属克隆的PR基因(Uknes等，Plant Cell 4:645-656,1992)，并且观察到类似的表达降低。在SA或INA处理后定量检测发现，相对于亲本BGL2-GUS株系(代表野生型)，npr1的PR基因表达降低。在npr1中，GUS和BGL2的表达均低于野生型10倍，而PR-5表达低于野生型5倍。观察发现最显著的降低是PR-1基因表达低于野生型20倍。采用npr1-1的定量GUS检测为了准确测量GUS活性水平，对在存在或SA或INA、或缺乏该二者的情况下生长的npr1-1植株和野生型BGL2-GUS植株进行GUS定量检测。在缺乏诱导剂的情况下，npr1-1突变体的GUS活性背景水平低于野生型5倍。在存在0.5mM SA的情况下生长的野生型植株显示GUS活性较未诱导植株升高52倍，而在SA诱导的npr1-1植株中，GUS活性升高仅7倍。此外，0.1mM INA诱导的野生型植株是非诱导植株的48倍，而npr1-1是5倍。因此，当SA或INA处理的npr1-1植株的GUS活性略微诱导时，该活性最多不过是仅仅略微高于未处理野生型的背景水平。npr1-1基因座的遗传分析npr1-1/npr1-1与野生型亲本(在BGL2-GUS背景下的NPR1/NPR1)回交产生的F1子代(NPR1/npr1-1，测试16株)在SA或INA处理后，具有在野生型观察到的相同类型GUS染色(用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸[XGluc]作底物)。即使在28℃温育2天，在SA或INA处理的npr1-1/npr1-1纯合植株中也未检测到GUS染色。所述F1植株自花授粉产生F2子代，该子代分离出GUS活性强染色或完全无染色的植株，在所检测的283株F2植株中的比率为219∶64，证明该突变表型是隐性的，并且是由单个核突变引起的(X2=0.86；P＞0.1)。在野生型和npr1-1中SA、INA和无毒病原体诱导的抗丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染的保护为了检测缺乏SA或INA诱导的PR基因表达是否影响抗有毒病原体感染的SAR保护，用或者1mM SA或0.65mM INA处理15天龄的野生型和npr1-1植株，2天后将其暴露于丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326细菌悬液。在SA或INA处理的野生型植株观察到显著保护，少于10％的所述植株显示略微黄化。大约90％未用SA或INA预处理的未处理野生型对照植株发生萎黄变损害。然而，在npr1-1突变植株中未观察到这种SA或INA诱导的保护。萎黄变损害清楚见于90％以上未处理植株，并且至少见于80％SA或INA处理的植株。npr1-1植株的症状也较野生型植株更严重。仅用1mM SA或0.65mM INA或表面活性剂(0.01％Silwet-77，用于细菌感染)处理，对野生型植株和npr1-1植株的效应最小。
在丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染之前，在用水、SA或INA处理2天的野生型和npr1-1植株中均检测到丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326细菌的生长。在细菌浸润后的第0、0.5、1.0、2.0及3.0天收集叶子。对于未处理的野生型植株，在该时间段丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326增殖了10,000倍。然而，对于SA或INA处理的野生型植株，丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326仅增长大约10倍，低于未处理对照1000倍。在3天时间点，平均数之间差异的Student t检验清楚表明，与喷水植株相比，在SA或INA处理的野生型植株中所述病原体的生长受抑制(P＜0.001)。在npr1-1植株中未观察到由SAR保护引起的丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326生长的这种显著差异；对于3天后的所有条件，Student’s t检验表明生长差异无显著性(P＞0.05)；npr1-1植株中的丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326生长类似于模拟处理和SA或INA处理的植株。比较未处理npr1-1与未处理野生型植株，似乎丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326在所述突变体中的生长水平较野生型提前1天达到饱和。此外，在SA或INA诱导的野生型和npr1-1之间的丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326生长差异是500到1000倍。
为了测试对无毒病原体的应答，如Dong等(Plant Cell 3:61-72,1991)和Whalen等(Plant Cell 3:49-59,1991)所述，用携带无毒基因avrRpt2的丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326浸润npr1-1植株。在这些npr1-1植株观察到典型的HR，其特征为快速出现坏死性损伤、检测到感染细胞细胞壁区域的自体荧光和丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326/avrRpt2的生长抑制。然后测试该无毒基因在npr1-1植株中诱导SAR的能力。为了区别诱导性细菌菌株和所述攻击性菌株，含avrRpt2基因的菜豆病原体丁香假单胞菌菜豆致病变种菌株NPS3121(P.s.phaseolicola NPS3121；(Lindgren等，J.Bacteriol.168:512-522,1986))用来在npr1-1和野生型植株中诱导SAR。丁香假单胞菌菜豆致病变种NPS3121本身在拟南芥属生态型Columbia不会引起疾病症状或可见的HR，而丁香假单胞菌菜豆致病变种NPS3121/avrRpt2引发强HR(Yu等，Mol.Plant-Microbe Interact.6:434-443,1993)。在接种后3天，用有毒病原体丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326攻击相同植株上的未感染叶子，在所述植株中检测到丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326的生长。与模拟处理样品相比，在用丁香假单胞菌菜豆致病变种NPS3121/avrRpt2预接种的野生型植株中观察到细菌生长显著减少(300倍)；然而，在npr1-1植株中未检测到丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326生长的差异。丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染在野生型和npr1-1中诱导的疾病症状和BGL2-GUS表达丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326能够在SA、INA和无毒病原体处理的npr1-1植株以及未处理植株中建立感染。还比较了未处理突变体植株和未处理野生型形成的损害。为此，将丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326悬液浸润入4周龄野生型和npr1-1的叶子。控制注射以便仅仅使该叶子的一半浸润该细菌。通过该半侧叶浸渍外观可以监测该过程。浸润后48小时，在野生型的叶子上观察到萎黄变损害。通常这些损伤限制在以中叶脉为界的叶子的浸润侧。在npr1-1叶子上观察到不同的损害，这里损害较弥散并常常蔓延到所述叶子的非感染侧。从野生型和npr1-1植株取样的12片叶子显示，所述细菌在11张npr1-1叶子的非接种侧显著生长，相比之下野生型植株叶子无细菌生长。
对于用丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染的叶子，通过X-Gluc染色检测到BGL2-GUS表达型。在野生型叶子中，于所述损害的外周区检测到高水平GUS的染色。相反，在npr1-1叶子上未检测到显著GUS活性，这里损害较野生型范围更大。关于npr1-1的结论上述数据表明，npr1-1携带有影响应答SA和INA的反式作用突变。由于观察到丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326而不是外用SA或INA诱导的PR1表达在npr1-1突变体也减少，排除了npr1-1是影响外用SA或INA吸收的突变体的可能性。SA或INA不能保护npr1-1突变体免遭丁香假单胞菌斑生致病变种菌株ES4326感染(相反在野生型植株中观察到上述保护)，表明npr1-1突变阻断了SA或INA诱导抗性。即使在npr1-1突变体由携带无毒基因avrRpt2的细菌诱发的HR类似于先前描述于野生型植株的HR(Dong等，Plant Cell 3:61-72,1991；Whalen等，Plant Cell 3:49-59,1991)，但是在npr1-1植株中缺乏HR诱导的抵抗有毒病原体丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染的SAR保护。这表明npr1-1是阻止SAR启动的突变。npr1-1突变的这些表型表明，野生型NPR1基因的功能是定性和定量地调节应答SA和INA的PR基因的表达。
npr1-1/npr1-1×NPR1/NPR1的回交子代的遗传分析表明，单隐性核突变决定了npr1-1突变体的“PR基因非表达体”表型。这也表明NPR1基因作为SAR应答基因诱导的正调节物而发挥作用。尽管所述基因可能是被SAR诱导失活的负调节物，但消除这种调节的突变可能是显性的。此外，单突变(即npr1-1)影响该突变体对SA、INA及病原体诱导的应答的事实表明，SA、INA及病原体激活了引起PR基因表达的共同通路。鉴定拟南芥属npr1-2和npr1-3突变体为了鉴定负面影响SAR诱导的新拟南芥属突变体，采用替代的突变筛选策略。
我们已观察到，有毒病原体丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326在拟南芥属叶上生长的终密度直接与丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326浸润的剂量有关。在两种其它类型的拟南芥属突变体中所观察到的表型也支持该结论。特别是所鉴定的一系列拟南芥属突变体累积降低水平的、叫作camalexin的植物抗毒素，camalexin是一种已经大量发现于拟南芥属的植物抗毒素(Glazebrook和Ausubel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8955-8959,1994；Tsuji等，Plant Physiol.98:1304-1309,1992)。重要的是，当以低于在野生型植株中产生疾病症状所需要的阈值剂量的剂量接种时，丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326在某些pad(植物抗毒素缺陷型(phytoalexin deficient))突变体中形成疾病损害并生长到较高滴度。类似的是，npr1-1突变体与pad突变体一样表现出类似的易感性提高的表现型(Cao等，PlantCell 6:1583-1529,1994)。
基于发现pad和npr突变体较野生型植株对低剂量丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染更敏感，进行筛选以分离其它eds(较高疾病易感性(enhanced disease susceptibility))突变体(Glazebrook等，Genetics 143:973-982,1996)。以一定剂量丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染M2代拟南芥属诱变植株的2片叶，所用的剂量使野生型植株在感染后3天显示表现为小萎黄斑点的非常弱的症状，而pad和npr1突变体显示大面积的萎黄变。在所筛选的12,500株植株中共计鉴定15株的eds突变体，这些突变体与野生型相比，可重复性地允许丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326至少高于半对数的生长。因为一些pad突变体以及npr1-1突变体与eds突变体一样，对丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326具有同样的易感性提高的表现型(Glazebrook等，Genetics 143:973-982,1996)，所以测试上述15株eds突变体，以确定它们在对丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326感染的应答中是否合成野生型水平的camalexin(pad表型)，以及水杨酸是否可以诱导PR1基因表达(npr1-1表型)。这些分析的结果表明两种eds突变体表现出npr1样表型。遗传互补分析表明这两种突变与npr1-1等位。这两种突变体再命名为npr1-2和npr1-3。拟南芥属NPR1基因的基于作图的定位克隆为了给NPR1基因作图，在npr1-1突变体(存在于携带BGL2-GUS报道基因的Columbia生态型(Col-O)中)与野生型(存在于携带BGL2-GUS报道基因的Landsberg erecta生态型(La-er)中)之间进行遗传杂交。当生长在含0.1mm INA的平板上时，通过其缺乏BGL2-GUS表达鉴定了得自该杂交的F3家系，所述家系在NPR1基因座上为所述突变纯合型。按照标准技术采用底物5-溴-4-氯-3-吲哚基萄糖苷酸，通过GUS活性的胶版复制检测法(chromographic assay)检测GUS报道基因的表达(Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994和Jefferson,PlantMol.Biol.Reporter 5:387-405,1987)。收集F3npr1-1子代库(30-40株2周龄幼苗)的叶组织并冷冻在液氮中。按Dellaporta等(Plant Mol.Biol.Reporter 1:19-21,1983)所述，从该冷冻组织制备基因组DNA制剂，并用来确定不同限制性片段长度多态性(RFLP)和共显性扩增多态序列(CAPS)(Konieczny和Ausubel,Plant J.4:403-410,1993)标记的基因型。根据常规方法，将NPR1基因座与RFLP及CAPS标记之间的重组频率用来确定NPR1基因的位置。
如图1所示，NPR1基因作图到拟南芥属1号染色体，并发现NPR1基因位于CAPS标记GAP-B(NPR1基因着丝粒侧～22.70cM)和RFLP标记m315(NPR1基因端粒侧～7.58cM)之间。
为了进行NPR1基因的精细作图，从下述克隆产生了新CAPS和RFLP标记，所述克隆在AtDB数据库(http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)中显示的遗传图谱位于GAP-B和m315之间。用限制酶EcoRⅠ切割粘粒g4026(CD2-28,ArabidopsisBiological Resourse Center,The Ohio State University,Columbus,OH)，并在用HindⅢ消化所述基因组DNA后，将4kb的片段用来鉴定Col-O和La-er间的多态性。利用该RFLP标记，在23个GAP-B杂合的F3家系中检测到6个杂合子。在m315杂合的7个F3家系中未发现杂合子。因此，g4026位于NPR1基因着丝粒侧的～5.92cM处。粘粒g11447(得自马萨诸塞总医院的Howard Goodman博士的收藏中心(Nam等，Plant Cell 1:699-705,1989))用来制备CAPS标记。0.8kb的EcoRⅠ片段的末端序列用来设计PCR引物(引物1:5’GTGACAGACTTGCTCCIACTG 3’(SEQ ID NO:15)；引物2:5’CAGTGTGTATCAAAGCACCA 3’(SEQ ID NO:16))，当用EcoRⅤ限制酶消化时，所述引物扩增显示多态性的片段。在所测试的436株npr1-1 F3子代中，用新制备的CAPS标记发现了17个杂合子。因为这些杂合子均是GAP-B基因座的纯合Col-O型，所以g11447标记位于NPR1基因的端粒侧～1.95cM处。
有许多RFLP标记作图在g11447和g4026之间。所测试的第一个标记是m305(称为CD1-11,Arabidopsis Biological ResourceCenter,the Ohio State University,Columbus,OH(Chang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6856-6860,1988))。用SalⅠ/XbaⅠ进一步亚克隆从m305λ克隆分离的5kb EcoRⅠ片段，并将1.6kb片段的末端序列用来设计PCR引物(引物1:5’TTCTCCAGACCACATGATTAT 3’(SEQ ID NO:17)；引物2:5’TGAAGCTAATATGCACAGGAG 3’(SEQ ID NO:18))。用HaeⅢ消化用这些引物扩增产生的PCR片段，以检测多态性。在用m305 CAPS标记所检测的305株npr1-1子代中，未发现杂合子，表明m305的位置紧挨着NPR1。
染色体I的部分物理图谱(http://cbil.humgen.upenn.edu/～atgc/ATGCUP.html)显示包含m305的YAC重叠群。在该重叠群中的YAC以及YAC克隆yUP19H6、yUP21A4和yUP11H9的左侧末端片段得自宾夕法尼亚大学的Joseph Ecker博士。发现yUP19H6L末端探针检测RsaⅠ多态性，并在NPR1基因着丝粒侧的GAP-B重组体中鉴定了5个重组体(如图1中的垂直箭头所示)。发现yUP11H9L末端探针检测HindⅢ多态性，在NPR1基因端粒侧的17个g11447重组体中发现了一个杂合子(如图1中的垂直箭头所示)。由于yUP11H9L与yUP19H6 YAC克隆杂交，因此这些结果表明NPR1基因位于yUP19H6上。除了m305之外，发现yUP21A4L(检测EcoRⅠ多态性)和g8020(检测HindⅢ多态性的1.3kb EcoRⅠ片段)与NPR1基因紧密连锁，没有鉴别出重组体。m305、yUP21A4L和g8020均杂交到yUP19H6 YAC克隆，进一步支持yUP19H6含有NPR1基因的结论。构建得自YAC克隆yUP19H6的粘粒文库从含YAC克隆yUP19H6的酵母菌株制备基因组DNA制剂。用限制酶TaqⅠ部分消化该DNA，在10-40％蔗糖梯度上进行大小选择，并将其克隆到双载体pCLDO4541(得自Jonathan Jones博士(Bent等，Science265:1856-1860,1994))的ClaⅠ位点。pCLDO4541载体是用于制备粘粒文库的标准转化载体。该质粒携带T-DNA多位点接头区以及四环素、卡那霉素抗性标记。
用市售包装提取物将所述粘粒克隆包装到λ噬菌体颗粒(Gigapack XL,Stratagene,Lalolla,CA)中，并根据供应商的说明书将其导入大肠杆菌菌株DH5α。发现所产生的文库含有约40,000个独立克隆。含有NPR1基因的粘粒重叠群的产生将产生自含yUP19H6的酵母菌株的粘粒文库铺平板(1,500cfu/平板)在LB培养基琼脂(含5μg/mL的四环素，以选择pCLDO4541的存在)上，并在37℃培养过夜。将菌落影印到膜上(GeneScreen,DuPont,New England Nuclear)，并根据制造商所述的操作流程进行杂交。该文库用分别从m305、yUP21A4L和g8020制备的5kb EcoRⅠ、6.5kb EcoRⅠ/XhoⅠ和1.3kb EcoRⅠ片段探测。鉴定与这些探针杂交的菌落并按照常规方法纯化。用Sambrook等(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork,1989)所述的碱裂解法，从这些阳性克隆制备粘粒DNA制剂，以及用上述探针通过HindⅢ限制消化和Southern杂交分析所述插入片段。发现所述粘粒形成跨越80kb拟南芥属DNA的单个粘粒重叠群。表明5个yUP19HL重组体中的3个，对所述重叠群着丝粒侧的粘粒克隆m305-3-1(5kb HindⅢ片段)所检测到的RFLP标记是杂合性的，而粘粒克隆g8020-6-3(1.25kb HindⅢ片段)在所述重叠群的端粒侧也检测到由g8020标记检测到的单杂合子。这表明所述粘粒重叠群含有NPR1基因(图1)。在互补实验中，从该重叠群选择了14种粘粒以转化npr1突变体植株，所述粘粒与相邻克隆最少有10kb的重叠(图1)。npr1突变的互补采用辅助菌株MM294A(pRK2013)(Finan等，J.Bacteriol.167:66-72,1986)，通过接合将包含于大肠杆菌菌株DH5α的粘粒克隆转移到根癌农杆菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,Mol.Gen.Genet.204:383-396,1986)中。用50μg/mL卡那霉素和50μg/mL庆大霉素选择所产生的根癌农杆菌接合体。采用Bethtold等(C.R.Acad.Sci.Paris,Life Sciences 316:1194-1199,1993)所述的真空渗入法，将携带这14种粘粒克隆的根癌农杆菌菌株转化到npr1-1(Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994)和npr1-2(Glazebrook等，Genetics 143:973-982,1996)中。通过Southern分析，检测在用于转化的根癌农杆菌培养物中粘粒克隆的完整性。
npr1-2转化体在含2％蔗糖、50μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的MS培养基琼脂(Murashige和Skoog,Physiol Plant.15:473-497,1962)上生长(22℃、光照14小时)和进行选择。将发育有真叶和健康根的卡那霉素抗性转化体转移到土壤。每天光照14小时于22℃在土壤中生长2周后，从每种粘粒克隆的3株转化体收集叶子，并且于22℃每天光照14小时的情况下浸于0.5mM INA溶液中24小时。然后收集叶组织并冰冻于液氮中。从这些叶组织中提取总RNA，并按Cao等所述方法(Plant Cell 6:1583-1592,1994)制备RNA印迹。用PR1特异性探针探测该印迹(用PR1特异性引物(有义引物5’GTAGGTGCTCTTGTTCTTCCC3’(SEQ ID NO:19)；反义引物5’CACATAATTCCCACGAGGATC3’(SEQ ID NO:20)通过扩增拟南芥属基因组DNA所获得的PCR产物)。
在对照实验中，野生型亲本系表明INA诱导PR1基因，而npr1-2突变体表现出没有诱导PR-1基因表达。含粘粒(每种粘粒转化3个转化体)21A4-6-1-1、21A4-P5-1、21A4-4-3-1及21A4-2-1的npr1-2转化体表现出INA强诱导PR1，而含其它克隆(例如M305-2-3、M305-3-9以及21A4-3-1)的npr1-2转化体显示没有诱导。在取样的各个粘粒克隆的3株独立的转化体中，观察到RNA带强度的变化。这些变化可能是“位置效应”的结果，所述位置效应即在染色体中的插入位置对所述转基因表达的影响。粘粒克隆21A4-4-3-1、21A4-6-1-1、21A4-P5-1及21A4-2-1恢复了npr1-2突变体应答INA诱导的能力，因此互补了npr1-2突变。INA诱导PR1的例子标示在图2A。
通过RNA印迹分析也测试了SA诱导携带各个粘粒的转化体的PR1表达，SA诱导的例子标示于图2A中。上述野生型亲本系呈现出SA的高水平PR1基因诱导，而npr1-2突变体仅表现出微弱的诱导(图2A)。含粘粒21A4-6-1-1、21A4-P5-1、21A4-4-3-1及21A4-2-1的npr1-2突变体的转化体显示SA诱导PR1，而含其它克隆的转化体显示几乎没有诱导。
如图1所示，这4种克隆共有7.5kb的共同区。当进行上述实验时，不能获得粘粒21A4-P4-1的转化体。然而根据其相对位置，预测该克隆也能互补npr1-2突变。
也将相同的14种粘粒克隆转化到npr1-1突变体中。因为npr1-1突变体携带BGL2-GUS报道基因和卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)，所以用卡那霉素也不能选择该粘粒克隆的转化体。然而，通过使从用根癌农杆菌浸润过的npr1-1植株收集到的种子生长于高浓度的SA(0.5mM)上，直接选择互补npr1-1突变的转化体。将产生绿叶的这些植株移植到另一含0.1mm INA的平板上，并在移植后1周检测GUS活性。
为了检测GUS活性，如前面所述(Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994；Jefferson,Plant Mol.Biol.Reporter 5:3878-405,1987)，给幼苗编号，并从各个植株取一单叶置于含100μl GUS底物(4-甲基伞形基β-D-葡糖苷酸)溶液的微量滴定板孔内。于37℃温育过夜后，在长波长UV光下检测GUS活性的荧光产物。测试作为对照的12株野生型亲本系(BGL2-GUS)幼苗，并且所有幼苗均显示生长于SA和INA后出现强荧光。在该实验中也包括12株npr1-1突变体幼苗，无一株显示荧光增强。从该实验发现，9株携带粘粒21A4-4P-1、5株携带21A4-P5-1以及6株携带21A4-2-1的幼苗具有高水平的荧光，即高水平GUS活性，而无一株来自其它粘粒克隆的幼苗通过该选择而鉴定。正如用等位npr1-2突变体的转化实验(这里，在用RNA印迹分析鉴定能够互补npr1-2突变的转化体之前，通过卡那霉素抗病性首先选择所有转化体)一样，用粘粒克隆21A4-P4-1、21A4-P5-1和21A4-2-1直接鉴定npr1-1突变植株中的推定互补转化体，进一步支持得自采用npr1-2突变体的互补实验的结论，即粘粒21A4-4-3-1、21A4-6-1-1、21A-P5-1、21A4-P4-1和21A4-2-1共有的7.5kb区互补npr1突变，并且该7.5kb区含有NPR1基因。
除了降低PR基因表达外，具有npr1突变的植株甚至在SAR诱导后也表现出对有毒病原体的易感性。上述粘粒也互补这些突变体的表型。例如，如图2B所示，感染细菌病原体Psm ES4326三天后，引起肉眼可见的疾病症状。野生型植株和被互补的npr1-1转化体的疾病症状完全局限在病原体侵润部位(叶子的左侧)，而发现npr1-1植株的损害越过侵润部位蔓延。此外，当感染细菌的剂量减少10倍时，仅仅在npr1-1突体变(右侧叶)中观察到严重的疾病症状。该实验表明，21A4-4-3-1互补npr1-1表现出的对Psm ES4326的较高易感性。
在检查疾病症状后，也分析同一叶子中BGL2-GUS基因的表达(图2B)。在野生植株限制良好的损伤边缘区检测到强GUS表达(蓝色染色)，但是在npr1-1植株的弥漫性损伤中缺乏该强GUS表达。被互补的转化体恢复了报道基因的表达。
除了以上这些肉眼可见的观测结果外，如图2C所示，在野生型、npr1-2以及具有互补粘粒(21A4-P5-1)的npr1-2转化体中定量检测Psm ES4326细菌的生长。在Psm ES4326感染(OD=0.001)之前，用0.65mM INA处理植株72小时。按照标准方法(Bowling等，同上，1994；Cao等，同上，1994；Glazebrook等，同上，1996)，用PsmES4326感染拟南芥属。在感染前及感染后1、2、3天取样。在分析的每一时间点取6-8个样品，并测定每张叶圆盘的Psm ES4326菌落形成单位。在感染前，用INA处理3天的野生型植株观察到Psm ES4326生长完全受抑制，而在进行同样处理的npr1-2突变体中观察到Psm ES4326生长大约降低10倍。在INA处理后的被互补的转化体中，Psm ES4326生长也被阻止。与水处理的野生型(图2C)以及携带非互补粘粒的水处理转化体比较，甚至在水处理转化体中也观察到较低的细菌生长(高达1000倍)。其抗性增强可能是由于这些被互补的转化体中的NPR1mRNA水平升高引起的。
也进行了抗真菌病原体寄生霜霉NOCO的试验，以便证实npr1-1突变的互补。按照标准方法(Bowling等，同上，1994；Cao等，同上，1994；Glazebrook等，同上，1996)，用寄生霜霉NOCO感染拟南芥属。用孢子悬液(3×104孢子/mL)感染前，进行INA处理(0.65mM)72小时。感染后7天，就在每一植株观察到的分生孢子梗方面记录疾病症状。每种表型和每种处理共计检测20-25株植株。用Mann-WhitneyU-检定(Sokal和Rohlf，同上)分析数据。如图2D所示，这些实验结果表明，具有互补粘粒的转化体恢复了INA诱导的对寄生霜霉NOCO的抗性。分析含有NPR1基因的7.5kb区用限制酶进一步分析通过粘粒互补实验鉴定的7.5kb区。由该分析所产生的限制性酶切图谱标示在图3。用HindⅢ、XbaⅠ和ClaⅠ/XhoⅠ消化粘粒21A4-P5-1制备3组亚克隆，所述粘粒含有位于上述插入片段中心的7.5kb区并连接到载体pBluescriptⅡSK+(Stratagene,LaJolla,CA)中。该7.5kb的目的区由5个HindⅢ亚克隆代表，所述亚克隆分别具有大约1.96kb、1.91kb、1.74kb、1.25kb及0.50kb大小的插入片段。也制备具有较大插入片段的亚克隆(XbaⅠ:～8.5kb,～8.5kb,～1.45kb；ClaⅠ/XhoⅠ:～10.0kb和～5.1kb)，以便定向和连接这些HindⅢ片段。
用产生自HindⅢ片段的探针，检测含野生型亲本系(BGL2-GUS)和上述3种npr1突变体的HindⅢ消化的基因组DNA样品的Southern印迹，所述HindⅢ片段从粘粒克隆21A4-P5-1制备。在野生型和所有3种npr1等位突变体之间未观察到限制图型的显著差异。因此，这些突变体携带NPR1基因大的缺失是不可能的。
覆盖上述7.5kb区的DNA片段用来检测含有poly(A)mRNA的印迹上的转录物，所述poly(A)mRNA是在用水或0.65mM INA和2mM SA处理植株后72小时，从野生型亲本系及3种npr1等位突变体的4周龄植株制备的。按照Dynal公司提供的操作流程，用Dynabead从75种微生物的总RNA中制备poly(A)mRNA样品。通过该分析，用从上述0.5kb以及相邻的1.96kb HindⅢ片段制备的探针，在上述7.5kb区中仅检测到一种～2.0kb的mRNA。该mRNA代表NPR1基因的假定转录物。此外，用Phosphorlmager和ImageQuant(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)检测，与水处理的对照相比，INA/SA诱导的样品中该转录物的强度升高大约2倍。因此，INA/SA处理诱导了被认为代表NPR1基因的mRNA的转录物的表达。发现在该poly(A)RNA印迹上的野生型和3种npr1突变等位基因之间，表达型无显著差异。NPR1基因的序列分析用所述5种HindⅢ片段的pBluescriptⅡSK+克隆作为模板，进行初始序列分析。用Qiagen质粒小量试剂盒(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)制备该模板DNA样品，0.6μg的该模板用于每个序列反应，并通过ABI自动序列分析仪进行分析。
M13-20和M13反向引物用来起始所述HindⅢ片段的测序反应。然后用各种限制酶来在这些HindⅢ亚克隆中产生缺失，以便分析该片段末端更远端的序列。此外，设计引物以进行引物步行。确定这些HindⅢ片段的相对位置，并用粘粒21A4-P5-1的XbaⅠ亚克隆作为模板，通过序列分析填充这些片段之间的间隙。采用标准DNA分析软件(DNAStrider 1.1,MacVector 4.0.1和GeneFinder)分析序列数据，以便鉴定限制酶位点、进行序列对比以及搜索可读框。应用该软件仅发现一个推定基因。序列数据也与TIGR拟南芥数据库(http://www.tigr.org/tdb/at/at.htlm)相比。该研究结果鉴定了一个表达序列标记(EST)克隆，所述克隆显示与上述1.96kb片段的一部分同源。1.96kb片段的该部分也鉴定为用GeneFinder软件识别的基因的部分。编码NPR1基因产物的7.5kb基因组区的核苷酸序列标示在图4。分离NPR1 cDNA克隆采用上述1.96kb HindⅢ片段作探针，筛选Katagiri博士构建的cDNA文库(详述于Mindrinos等，Cell 78:1089-1099,1994)。细菌细胞(大肠杆菌DH10B；GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)含有从1月龄野生型拟南芥属植株的气生(aerial)部分制备、含于载体pKEx4tr中的cDNA，将该细胞铺平板(60,000cfu/平板)在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，平板于37℃温育1.5小时。将菌落影印到菌落/噬菌斑筛选膜(NEN Research Product；Boston,MA)上，然后将该膜置于LB平板上，有菌落的一面朝上。两种平板于30℃培养12小时。将所述膜高压灭菌1分钟以裂解细胞，并使DNA固定在膜上。于42℃在含10％葡聚糖硫酸酯、50％甲酰胺、6×SSC、5×Denhardt’s以及1％SDS的溶液中进行杂交；所述膜于65℃在2×SSC和1％SDS中洗涤2次。采用相同条件，通过第二、三次筛选纯化阳性菌落。随后鉴定了一个阳性克隆并命名为pKExNPR1。
用限制酶EcoRⅠ和SacⅠ从载体切下该cDNA插入片段。用从上述1.96kb(可读框的3’末端)和0.5kb(可读框的5’末端)HindⅢ片段制备的探针进行Southern分析，以确认所述cDNA克隆的同源性。由上述2.1kb cDNA编码的、叫做NPR1的拟南芥获得性抗性蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:2)及推定氨基酸序列(SEQ ID NO:3)标示在图5。序列分析揭示，该cDNA含有对应于在上述EST克隆鉴定的以及用Gene Finder软件推定的序列的序列。
用BLAST序列分析程序分析上述cDNA序列。该分析提示NPR1蛋白与锚蛋白具有显著的同源性，包括鉴定为锚蛋白重复共有序列的区域。具体地说，如图6A所示，NPR1序列含有显著同源于哺乳动物锚蛋白3基因的2个区。NPR1(氨基酸323-371和262-289)与ANK3(氨基酸740-788和313-340)之间的序列同一性分别为42％和35％，而序列相似性分别为59％和57％。已经在各种蛋白质中鉴定了该锚蛋白重复共有序列，所述蛋白质包括转录因子、细胞分化分子、结构蛋白以及具有酶活性和毒性活性的蛋白质。已经表明该基元通过介导蛋白相互作用而发挥功能。
采用Michaely和Bennett(Trends in Cell Biology 2:127-129,1992)以及Bork(Proteins:Structure,Function,andGenetics 17:363-374,1993)所定义的共有序列，在NPR1中鉴定了另外2个锚蛋白重复序列；这些重复序列标示在图6B中。
此外，采用MacVector程序，在NPR1蛋白中已经发现了G蛋白偶联受体的17个氨基酸的基元(MKGTCEFIVTSLEPDRL，图5,SEQ IDNO:21)(Science 244:569-572,1989)。NPR1所决定的抗性是剂量依赖性的在转基因植物中如下评价NPR-1赋予抗病性的能力。由组成型CaMV 35S启动子驱动的NPR1 cDNA序列按照标准方法转化到拟南芥属生态型Columbia中。在所产生的35S-NPR1转基因杂合的T3系中，检测NPR1调节的PR-1基因表达、NPR1 mRNA以及NPR1蛋白，以便鉴定呈现高(ColNPR1H)、中(ColNPR1M)、低(ColNPR1L)水平NPR1表达的那些株系。表1表明评价PR-1、NPR1 mRNA以及NPR1蛋白浓度相对水平的结果。
表135S-NPR1转基因系的特征鉴定PR-1NPR1 NPR1基因型(INA)a(mRNA)b(蛋白质)cCol 1.00 1.00 1.00Col-Ll0.41 6.92 0.04Col-l20.54 6.90 ＜0.04Col-M11.73 9.20 1.40Col-M21.80 9.50 1.40Col-H12.60 17.80 1.60Col-H22.74 27.90 3.00a通过RNA印迹分析，检测35S-NPR1转基因系中的PR1相对水平，所述转基因系生长在含0.01mm INA的平板上。b通过poly(A)+RNA印迹，检测NPR1 mRNA相对水平。c用NPR1多克隆抗体，通过ELISA检测相对NPR1蛋白浓度。
通过这些实验鉴定了NPR1蛋白水平(而不是mRNA水平)显著低于野生型亲本的2个转化体株系。然而这不是所不希望的，因为植株中转基因的过量表达通常导致该转基因以及相应的内源基因的共抑制(Baulcombe,The Plant Cell,8:1833,1993)。
接下来按照标准方法用细菌病原体丁香假单胞菌斑生致病变种ES4326和真菌病原体寄生霜霉NOCO2感染上述高、中、低表达的35S-NPR1转基因系。这些实验结果分别标示在图8A和8B。在缺乏SAR诱导的情况下，高度及中度表达的35S-NPR1转基因系显示对细菌和真菌病原体的抗性均显著升高，而低表达的转基因系与野生型相比表现为对所述病原体的耐受性降低。总而言之，这些结果表明，NPR1是SAR的正调节物，且NPR1所决定的抗性是剂量依赖性的；NPR1蛋白的超量表达增强抗性，而表达不足导致对感染的耐受性降低。SA诱导时NPR1转位到核为了阐明该蛋白的诱导机制和分子功能，通过采用标准报道基因融合构建物分析，确定NPR1的亚细胞定位。将绿色荧光蛋白(GFP)基因融合到由组成型CaMV 35S启动子驱动的NPR1 cDNA的羧基末端，并按照标准方法，将35S-NPR1-GFP构建物用来转化npr1突变体，即npr1-1和npr1-2。在所产生的转基因系中，发现NPR1-GFP转基因互补所有npr1突变体表型；所述突变体的表型为缺乏SA或INA诱导的PR基因表达、对外源SA的耐受性降低以及缺乏SA或INA诱导的抗病原体抗性(图9A-9C)。只表达GFP的转基因系(命名为35S-mGFP)不表现出互补活性(图9B)。此外，发现NPR1-GFP转基因存在恢复诱导型BGL-GUS表达以及抗寄生霜霉的抗性，分别如图9A和9C所示。所以，这些实验表明，NPR1-GFP具有生物学活性，以及NPR1-GFP的亚细胞位置可以反映内源NPR1蛋白的亚细胞位置。
为了检测NPR1蛋白的亚细胞位置，在存在或缺乏诱导SAR的化学物SA或INA的情况下，将35S-NPR1-GFP和35S-mGFP转基因系生长于MS培养基中。随后用聚焦显微镜检查11天龄的幼苗，以探测NPR1-GFP和mGFP的位置。如图10所示，生长于MS的35S-NPR1-GFP幼苗在整个叶肉细胞显示低水平GFP，而在保卫细胞核中显示强GFP荧光。SA或INA诱导时，只在叶肉细胞和保卫细胞的核中检测到NPR1-GFP。在35S-mGFP转化体中，在细胞质以及细胞核中检测到绿色荧光，而SA和INA处理对该蛋白的定位无影响。这些结果表明，NPR1定位在叶肉细胞的胞质，诱导时该NPR1蛋白转移到核中，导致PR1基因表达和抗病性。在保卫细胞中，即使没有SAR诱导，NPR1蛋白也定位在核，这是一个有趣的观察结果，因为为了防止微生物病原体通过气孔进入植株，在这些细胞组成性激活防御机制可能是必需的。因为mGFP只表现出非诱导的核转移，所以NPR1-GFP融合物的核转移必须由NPR1中的信号引导。与此一致的是，在NPR1中发现了以下2种潜在的核定位序列(NLS’s):
252 RRKELGLEVPKVKK 265(SEQ ID NO:22)；和541 KKQRYMEIQETLKK 554(SEQ ID NO:23)有重要意义的是，在有毒病原体Psm ES4326感染的组织中也观察到核转位(图11A)。也观察到该诱导型与在感染后的植株所观察到的PR基因表达型(图11B)一致。npr突变的特征鉴定为了再特征鉴定NPR1基因，通过DNA序列分析鉴定出npr1-1、npr1-2、npr1-3及npr1-4中的突变。突变体npr1-4是一种新npr1的等位基因，该等位基因是在上述Col-O(BGL2-GUS)背景下基于其对PsmES4326的易感性提高而鉴定的。发现各个突变等位基因含单碱基对的变化。npr1-1、npr1-2、npr1-3及npr1-4等位基因分别使第三锚蛋白重复共有序列中的高度保守性组氨酸(残基334)变为酪氨酸、将半胱氨酸(残基150)变为酪氨酸、导入无义密码子(残基400)(该密码子应导致缺乏该蛋白C末端194个氨基酸的截短的蛋白)和破坏第三个内含子接点的受体位点。所有这些点突变均是GC转换为AT，与用于产生这些突变的诱变剂甲磺酸乙酯的作用模式一致。利用拟南芥进行植物防御反应的遗传分析尽管生化研究在阐明植物防御反应的总体特征中起了重要作用，但是防御反应的复杂性限制了生化分析在确定具体防御反应或酶赋予抗病原体抗性的重要性中的应用。分离植物防御反应突变体不仅有助于阐明在抗具体病原体中已知病原体诱导的反应的作用，而且有助于鉴定与已知生化或分子遗传反应尚无关连的植物防御机制。如本文所述，随着涉及模式植物拟南芥作为宿主的很好特征鉴定的宿主病原体系统的发展，对获得性抗性反应进行全面遗传分析是可能的。
在农作物中观察到的植物防御反应的所有主要特征在拟南芥属与病原体的相互作用中也已经观察到。例如，对于拟南芥属的细菌和真菌病原体，已经鉴定了几种抗性基因-avr基因的相互作用(Bisgrove等，Plant cell 6:927-933,1994；Holub等，Mol.Plant-Microbe Interact.7:223-239,1994；Kunkel等，PlantCell5:865-875,1993；Yu等，Mol.Plant-Microbe Interact.6:434-443,1993)。此外，所有SAR的重要特征已经在拟南芥属观察到(Uknes等，Plant Cell 4:645-656,1992；Uknes等，Mol.Plant-Microbe Interact.6:692-698,1993)。重要的是，拟南芥属的遗传分析能力最近已经用来帮助鉴定对病原体侵袭的拟南芥属防御反应的各种组分(Bent等，Science 265:1856-1860,1994；Bowling等，Plant Cell 6:1845-1857,1994；Cao等，Plant Cell 6:1583-1592,1994；Century等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6597-6601,1995；Delaney等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:6602-6606,1995；Dietrich等，Cell 77:565-577,1994；Glazebrook和Ausubel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8955-8959,1994；Glazebrook等，Genetics 143:973-982,1996；Grant等，Science 269:843-846,1995；Greenberg和Ausubel,Plant J.4:327-341,1993；Greenberg等，Plant J.4:327-341,1994；Mindrinos等，Cell 78:1089-1099,1994)。因此，本文所述结果提供了鉴定下述基因的基础，所述基因是涉及整个植物界的获得性抗性的基因，并不限于拟南芥属。分离茄科植物的AR基因采用图5所示拟南芥属NPR1 cDNA序列(SEQ ID NO:2)，用标准技术很容易地完成发现于茄科植物(例如马铃薯、茄子、番茄、烟草、矮牵牛及胡椒)的AR同系物的分离。
例如，就NPR1同系物的存在，筛选Nicotiana glutinosa cDNA文库。在λZAPⅡ载体中，从用烟草花叶病毒(TMV)感染的Nicotianaglutinosa植株分离的Poly(A+)RNA构建该文库(Whitham等，Cell 78:1101-1115,1994)。采用XL-1 Blue宿主细胞，将噬菌体铺平板于NZY培养基上。通过将该噬菌体DNA转移到带正电的尼龙膜(GeneScreen；DuPont-New England Nuclear)上，并采用利用全长拟南芥属NPR1cDNA作模板制备的随机引发的32P标记探针探测，筛选大约106个噬菌斑。于37℃在40％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt、1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯中进行杂交。该滤膜于室温下在2×SSC中洗涤15分钟，并于37℃在2×SSC、1％SDS中洗涤30分钟。
鉴定以及纯化了2个杂交克隆。采用XL-1 Blue宿主细胞和R408辅助噬菌体，切下pBluescript质粒。限制酶分析表明，2个阳性克隆含有大约3600bp和2100bp的插入片段。限制性消化和序列分析表明，所述3600bp插入片段是2个独立的2100bp和1500bp cDNA，而且上述2种独立分离的2100bp cDNA是相同的。用35S-dATP和Sequenase序列分析试剂盒(U.S.Biochemicals,Cleveland,OH)序列分析上述2100bpcDNA的双链。编码Nicotiana glutinosa NPR1同系物的核苷酸序列和氨基酸序列分别标示在图7A(SEQ ID NO:13)和图7B(SEQ ID NO:14)。分离其它获得性抗性基因任何植物细胞均可用作AR基因分子克隆的核酸来源。分离AR基因包括分离这些DNA序列，所述DNA序列编码显示AR相关结构、性质或活性(例如，锚蛋白重复序列基元以及诱导基因表达限制病原体感染的PR蛋白的能力)的蛋白质。基于本文所述的AR基因和多肽，用本领域熟知的标准策略及技术分离另外的植物AR编码序列是可能的。
在一个具体实施例中，可以使用本文所述AR序列以及核酸杂交筛选的常规筛选方法。这类杂交技术和筛选方法是本领域技术人员熟知的，并描述于例如Benton和Davis,Science 196:180,1977；Grunstein和Hogness,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961,1975；Ausubel等(同上)；Berger和Kimmel(同上)；以及Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press，纽约。在一个具体实施例中，完整的或部分NPR1 cDNA(本文所述的)可以用作探针，筛选重组植物DNA文库中含有与AR基因相同序列的基因。根据下述方法，通过噬菌斑或菌落杂交检测杂交序列。
另一方面，利用AR多肽的全部或部分氨基酸序列，可以容易地设计AR特异性寡核苷酸探针，包括AR简并寡核苷酸探针(即，特定氨基酸序列的所有可能编码序列的混合物)。这些寡核苷酸可以基于DNA的任一条链或者AR序列的任何适合部分的序列(分别为图4、5、7A、7B中的SEQ ID NO:1、2、3、13和14)。例如，在Ausubel等，1996,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,纽约，以及Berger和Kimmel,Guide to Molecular CloningTechniques,1987,Academic Press，纽约中，提供设计和制备这类探针的一般方法。这些寡核苷酸对于AR基因分离是有用的，或者用作能够杂交到AR互补序列的探针，或者用作各种扩增技术(例如聚合酶链式反应(PCR)克隆策略)的引物。假如需要，不同寡核苷酸探针的组合物可以用于筛选重组DNA文库。采用本领域已知的方法，可以可检测性标记所述寡核苷酸，并用来探测得自重组DNA文库的滤膜影印物。根据本领域熟知的方法例如Ausubel等(同上)所述方法，制备重组DNA文库，或者可以从市售来源获得所述重组DNA文库。
在该方法的一个具体实施例中，采用高严格条件检测或分离同一性大于80％的有关AR序列。高严格条件可以包括在大约42℃和大约50％甲酰胺、0.1mg/mL剪切鲑精DNA、1％SDS、2×SSC、10％萄聚糖硫酸酯的情况下进行杂交，于大约65℃、大约2×SSC以及1％SDS进行第一次洗涤，然后于大约65℃和大约0.1×SSC中进行第二次洗涤。或者，高严格条件可以包括在大约42℃和大约50％甲酰胺、0.1mg/mL剪切鲑精DNA、0.5％SDS、5×SSPE、1×Denhardt’s情况下进行杂交，之后在室温下于2×SSC、0.1％SDS洗涤2次，于55-60℃以及0.2×SSC、0.1％SDS洗涤2次。
在另一方法中，检测大约40％或更多序列相同于本文所述AR基因的AR基因的低严格杂交条件包括，例如于大约42℃和0.1mg/mL剪切鲑精DNA、1％SDS、2×SSC以及10％萄聚糖硫酸酯的情况下(缺乏甲酰胺)进行杂交，于37℃、6×SSC、大约1％SDS洗涤1次。或者，于大约42℃和40％甲酰胺、0.1mg/mL剪切鲑精DNA、0.5％SDS、5×SSPE、1×Denhardt’s情况下进行低严格性杂交，之后在室温下于2×SSC、0.1％SDS洗涤2次，于室温、0.5×SSC、0.1％SDS洗涤2次。这些严格条件是典型的；本领域技术人员可以确定其它合适条件。
假如需要，采用常规方法，从任何植物(例如本文所述农作物)分离的总RNA或Poly(A+)RNA的RNA凝胶印迹分析，可以用来确定存在或缺乏AR转录物。作为一个实施例，按照标准方法制备马铃薯RNA的Northern印迹，并于37℃用杂交液中的1.96kb NPR1 HindⅢ片段进行探测，所述杂交液含50％甲酰胺、5×SSC、2.5×Denhardt’s液以及300μg/mL鲑精DNA。杂交过夜后，该印迹于37℃在含1×SSC、0.2％SDS的溶液中洗涤2次，每次10分钟。该印迹的放射自显影图证实在马铃薯RNA样品中存在NPR1杂交反应RNA，表明该茄科农作物编码获得性抗性基因。这些结果还表明，AR基因不限于十字花科植物拟南芥属。采用标准cDNA克隆技术分离该杂交转录物。
如以上所讨论，AR寡核苷酸也可以用作例如使用PCR的扩增克隆策略中的引物。PCR方法是本领域熟知的，并在例如PCR Technology,Erlich编辑，Stockton Press，伦敦，1989；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Innis等编辑，AcademicPress,Inc.，纽约，1990；和Ausubel等(同上)中描述。可任选地设计引物，以允许使所扩增的产物克隆到合适的载体，例如采用包括所扩增片段(如本文所述)5’或3’末端合适的限制性位点。假如需要，可以采用PCR“RACE”技术或cDNA末端的快速扩增(参见例如Innis等(同上))分离AR序列。通过该方法，基于AR序列的寡核苷酸引物在3’和5’方向定向，并用来产生重叠PCR片段。组合这些重叠的3’和5’端RACE产物，以便产生完整的全长cDNA。该方法在Innis等(同上)；以及Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998,1988中进行了描述。对于扩增AR基因序列有用的典型寡核苷酸引物包括但不限于A．AA(A/G)GA(A/G)GA(T/C)CA(T/C)ACNAA(SEQ ID NO:24)；B．TA(T/C)TG(T/C)AA(T/C)GTNAA(A/G)AC(SEQ ID NO:25)；C．GCCATNGTNGC(T/C)TG(T/C)TT(SEQ ID NO:26)；D．AA(A/G)GTNAA(A/G)AA(A/G)CA(C/T)GT(SEQ ID NO:27)；E．(A/G)AA(C/T)TC(A/G)CANGTNCC(C/T)TTCAT (SEQ IDNO:28)；对于以上各个序列，N为A、T、G或C。
另一方面，按照本文所述标准方法，通过npr突变体(例如本文所述的npr1突变体)的功能互补可以筛选任何植物cDNA文库或cDNA表达文库。
通过各种常规方法，包括但不限于功能互补检测、基因及其表达产物的序列比较，可以证实序列与AR多肽家族的相关性。此外，根据本文所述的任何技术，例如基因编码产物的功能或免疫学特性，可以评价该基因产物的活性。
一旦鉴定了AR序列，则根据标准方法克隆该序列，并用于如下构建所述植物表达载体。AR多肽的表达通过用合适表达载体中的所有或部分AR cDNA(例如上述cDNA)，或者用为增加体内AR多肽(见前)表达而工程构建的质粒构建物，转化合适的宿主细胞，可以表达及产生AR多肽。
分子生物学领域的技术人员知道，各种各样表达系统中的任何一种都可以用来提供该重组蛋白。所使用的确切宿主细胞对本发明不是关键。所述AR蛋白可以产生于原核宿主，例如大肠杆菌；或真核宿主，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、哺乳动物细胞(例如COS1或NIH 3T3细胞)或许多植物细胞或完整植物植株中的任何一种，包括但不限于藻类、乔木类、观赏植物类、温带水果类、热带水果类、蔬菜类、豆科植物类、十字花科植物类、单子叶植物、双子叶植物；或具有商业或农业重要意义的任何植物。合适植物宿主的具体例子包括但不限于针叶树、矮牵牛、番茄、胡椒、马铃薯、烟草、拟南芥属、莴苣、向日葵、油菜、亚麻、棉花、甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、苜蓿属(Medicago)、莲、豇豆属(Vigna)、黄瓜、胡萝卜、茄子、花椰菜、辣根、牵牛花、白杨、胡桃、苹果、葡萄、天门冬属植物、木薯、水稻、玉米、小米、洋葱、大麦、鸭茅、燕麦、黑麦和小麦。
这类细胞可从各种来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(Rockland,MD)；或得自许多种子公司中的任何一家，例如W.AtleeBurpee Seed Co.(Warminster,PA),Park Seed Co.(Greenwood,SC).Johnny Seed Co.(Albion,ME)，或Northrup KingSeeds(Harstville,SC)。有用宿主细胞的描述和来源也载于VasilI.K.,Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第I、Ⅱ、Ⅲ卷，Laborotary Procederes and Their ApplicationsAcademic Press，纽约，1984；Dixon,R.A.,Plant Cell Culture-A Practical Approach,IRL Press,Oxford University,1985；Green等，Plant Tissue and Cell Culture,Academic Press，纽约，1987；以及Gasser和Fraley,Science 244:1293,1989。
对于原核生物的表达，编码AR多肽的DNA携载于可操作连接到控制信号的载体上，所述控制信号能够影响在原核宿主细胞中的表达。假如需要，该编码序列可以在5’端含有编码任何这种已知信号序列的序列，所述已知信号序列能够使表达蛋白分泌到所述宿主细胞的壁膜间隙，因此有助于回收该蛋白以及随后的蛋白纯化。最常使用的原核生物是各种大肠杆菌菌株；然而，也可以使用其它微生物菌株。采用含有得自与所述微生物宿主相容生物种的复制起点、选择标记以及控制序列的质粒载体。这类载体的例子载于Pouwels等(同上)或Ausubel等(同上)。通常采用的原核控制序列(也叫做“调节元件”)本文限定为包括用于转录启动、可选地附加有操纵子、与核糖体结合位点序列一起的启动子。通常用来指导蛋白表达的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖(lac)(Chang等，Nature 198:1056,1977)、色氨酸(Trp)(Goeddel等，Nucl,Acids Res.8:4057,1980)和tac启动子系统，以及λ-衍生的P1启动子和N基因核糖体结合位点(Simatake等，Nature 292:128,1981)。
一种生产AR多肽的特定细菌表达系统是大肠杆菌pET表达系统(Novagen,Inc.,Madison,WI)。按照该表达系统，编码AR多肽的DNA以设计允许表达的取向插入到pET载体。因为该AR基因是在T7调节信号的控制下，所以通过诱导宿主细胞中的T7 RNA聚合酶的表达，从而诱导AR表达。采用应答IPTG诱导而表达T7 RNA聚合酶的宿主菌株通常可以达到上述目的。在产生AR多肽后，按照本领域已知的标准方法(例如本文所述方法)分离重组AR多肽。
生产AR多肽的另一种表达系统是pGEX表达系统(Pharmacia)。该系统采用GST基因融合系统，该融合系统是设计来高水平地将基因或基因片段表达为能够快速纯化和回收功能性基因产物的融合蛋白。该目的蛋白融合到得自Schistosoma japonicum的谷光苷肽S-转移酶蛋白的羧基末端，并且采用谷胱甘肽琼脂糖4B，通过亲和层析很容易从细菌裂解液中纯化。在温和条件下用谷胱甘肽洗脱可以回收融合蛋白。在谷胱甘肽S-转移酶域的上游存在位点特异性蛋白酶的识别位点，有助于从融合蛋白切下谷胱甘肽S-转移酶域。例如，用凝血酶可以切除pGEX-2T质粒中表达的蛋白；用Xa因子可以切下pGEX-3X中表达的蛋白。
对于真核生物的表达，转化或转染的方法和表达AR多肽的载体的选择取决于所选择的宿主系统。转化和转染方法例如在Ausubel等(同上)；Weissbach和Weissbach,Methods for Plant MolecularBiology,Academic Press,1989；Gelyin等，Plant MolecularBiology Mannual,Kluwer Academic Publishers,1990；Kindle,K.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1228,1990；Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biology 42:205,1991；和BioRad(Hercules,CA)Technical Bulletin #1687(生物发射粒子传递系统(Biolistic Particle Delvery Systems))中有描述。可以从例如Cloning Vectors:A Laboratory Mannul(P.H.Pouwels等，1985,Supp.1987)；Gasser和Fraley(同上)；ClontechMolecular Biology Catalog(Catalog 1992/93 Tools for theMolecular Biologist,Palo Alto,CA)；以及以上引用的文献提供的载体中选择表达载体。Fraley等(美国专利第5,352,605号)描述了其它表达构建物。构建植物转基因最优选的是，通过稳定转染的植物细胞系、瞬时转染的植物细胞系或转基因植物生产AR多肽。公众可获得适合稳定转染或染色体外转染植物细胞或建立转基因植物的多种载体；这类载体在Pouwels等(同上)，Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)所述文献中有描述。构建这类细胞系的方法描述于例如Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)。
通常，植物表达载体包含(1)在5’和3’末端调节序列的转录控制下的克隆植物基因，和(2)显性选择标记。假如需要，这类植物表达载体也可以含有启动子调节序列(例如赋予诱导或组成型、病原体或损伤诱导的、环境性或发育调节性、或细胞或组织特异性表达的启动子调节序列)、转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
一旦按上述方法获得所需的核酸序列，则可以以本领域已知的种种方式对其进行操作。例如，在该序列包括非编码侧翼区的情况下，可以对所述侧翼区进行诱变。
假如需要，本发明AR DNA序列可以多种方式与其它DNA序列组合。本发明的AR DNA序列可以与通常与AR蛋白有关的所有或部分的基因序列一起使用。在其各个组成成分中，编码AR蛋白的DNA序列结合于含有转录起始控制区的DNA构建物，所述转录起始控制区能够促进宿主细胞中的转录和翻译。
一般来说，上述构建物将包含在植物发挥功能的调节区，所述植物提供本文所讨论的AR蛋白的修饰后产生。编码AR蛋白或其功能片段的可读框在其5’末端连接到转录起始调节区，所述起始调节区例如天然发现于AR结构基因的5’上游区的序列。可获得提供组成型或诱导型调节的无数其它转录起始区。
对于需要发育、细胞、组织、激素或环境表达的应用，从其它基因(例如来自在分生组织发育、种子发育、胚胎发育或叶子发育期间受调节的基因)获得合适的5’上游非编码区。
同样在本发明的DNA构建物中也可提供调节转录终止区。编码AR蛋白的DNA序列或衍生自不同基因源的任何适宜的转录终止区均可以提供转录终止区。该转录终止区最好含有至少1-3kb的序列，该序列位于产生上述终止区的结构基因的3’末端。含有作为供表达(或者以有义取向或以无义取向)的目的DNA序列的AR的植物表达构建物，可以用于各种各样的植物生命过程，尤其是涉及产生贮藏物(storagereserves)的植物生命过程(例如涉及碳和氮代谢的生命过程)。这类遗传工程植物可应用于下文所讨论的各种工业和农业用途。重要的是，本发明可用于双子叶和单子叶植物，且很容易应用于任何新的或改进的转化或再生方法。
上述表达构建物至少包括一个操作性连接到至少一个AR基因的启动子。根据本发明有用的植物启动子实例是花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子。这些启动子在大多数植物组织中赋予高水平表达，而且这些启动子的活性不依赖于病毒编码的蛋白。CaMV是35S和19S启动子的来源。采用这些启动子的植物表达构建物的例子见于Fraley等，美国专利第5,352,605号。CaMV 35S启动子在转基因植物的大多数组织中为强启动子(参见例如，Odell等，Nature 313:810,1985)。该CaMV启动子在单子叶植物也是高活性启动子(参见例如，Dekeyser等，Plant Cell 2:591,1990；Terada和Shimamoto,Mol.Gen.Genet.220:389,1990)。此外，通过CaMV35S启动子加倍，可以进一步提高所述启动子的活性(为2-10倍之间)(参见例如，Kay等，Science 236:1299,1987；Ow等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.84:4870,1987；以及Fang等，Plant Cell 1:141,1989,McPherson和Kay，美国专利第5,378,142号)。
其它有用的植物启动子包括但不限于胭脂氨酸合酶(NOS)启动子(An等，Plant Physiol.88:547,1988以及Roders和Fraley，美国专利第5,034,322号)、章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等，Plant Cell1:977,1989)、玄参花叶病毒(FMV)启动子(Rodgers，美国专利第5,378,619号)和水稻肌动蛋白启动子(Wu和McElroy,WO91/09948)。
典型单子叶植物启动子包括但不限于鸭跖草黄斑驳病毒启动子、甘蔗badna病毒启动子、水稻tungro杆菌状病毒启动子、玉米条斑病毒元件以及小麦短小病毒启动子。
对于某些应用，可能希望在合适组织、以适当水平或在适当发育时期产生AR基因产物。为此，有各种各样的基因启动子，每种启动子具有体现在其调节序列中的不同特征，表明这些启动子在应答诸如环境、激素和/或发育信号的诱导信号中受到调节。这些启动子包括但不限于以下基因启动子，它们负责热调节的基因表达(参见例如，Callis等，Plant Physiol.88:965,1988；Takahashi和Komeda,Mol.Gen.Genet.219:365,1989；和Takahashi等，Plant J.2:751,1992)、光调节的基因表达(例如Kuhlemeier等(Plabt Cell 1:471,1989)所描述的豌豆rbcS-3A；Schffner和Sheen(Plant Cell3:997,1991)所描述的玉米rbcS启动子；Simpson等(EMBO J.4:2723,1985)所描述的发现于豌豆的叶绿素a/b结合蛋白基因；Arabssu启动子；或水稻rbs启动子)、激素调节的基因表达(例如，得自Marcotte等(Plant Cell 1:969,1989)所述的小麦Em基因的脱落酸(ABA)效应序列；由Straub等(Plant Cell 6:617,1994)和Shen等(Plant Cell 7:295,1995)描述的大麦和拟南芥属的ABA诱导的HVA1和HVA22及rd29A启动子；以及损伤诱导的基因表达(例如Siebertz等(Plant Cell 1:961,1989)所述的wunI))、器官特异性基因表达(例如，由Roshal等(EMBO J.6:1155,1987)所描述的块茎特异性贮藏蛋白基因的表达；由Schernthaner等(EMBO J.7:1249,1988)描述得自玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因；或由Bustos等(Plant Cell 1:839,1989)描述的法国菜豆β-菜豆蛋白基因)、或病原体诱导型启动子(例如PR-1、prp-1或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子以及线虫诱导型启动子，即分另为烟草和芹菜的TobRB7-5A和Hmg-1)。
植物表达载体也可以可选择性地包含RNA加工信号，例如内含子，已经表明内含子对于有效的RNA合成和积累是重要的(Callis等，Genes and Dev.1:1183,1987)。RNA剪接序列的位置可以显著影响植物中的转基因表达水平。鉴于这种事实，内含子可以位于转基因中的AR多肽编码序列的上游或下游，以便调节基因表达水平。
除了上述的5’端调节控制序列外，所述表达载体也可以包含一般存在于植物基因3’端区域的调节控制区(Thornburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:744,1987；An等，Plant Cell 1:115,1989)。例如，3’终止子区可以包含于表达载体中，以增加mRNA的稳定性。从马铃薯的PⅠ-Ⅱ终止子区可以衍生出一种这样的终止子区。此外，其它常用的终止子产生自章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶信号。
上述植物表达载体也通常含有显性选择标记基因，该显性标记基因用来鉴定已经转化的细胞。植物系统有用的选择基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码抗潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或壮观霉素的抗生素抗性的基因。获得的光合作用基因也可以用作光合作用缺陷型品系的选择标记。最后，编码除草剂抗性的基因可以用作选择标记；有用的除草剂抗性基因包括编码酶膦丝菌素乙酰基转移酶并赋予抗广谱除草剂Basta(Hoechst AG,Frankfurt，德国)抗性的bar基因。
确定植物细胞对特定选择剂的易感性和确定该选择剂有效杀死大多数(假如不是杀死全部)转化细胞的浓度，有助于选择性标记的有效选用。关于烟草转化的一些抗生素有效浓度包括例如75-100μg/mL(卡那霉素)、20-50μg/mL(潮霉素)或5-10μg/mL(博来霉素)。例如由Vasil等(同上)描述了选择除草剂抗性转化体的有效策略。
此外，假如需要，植物表达构建物可以含有修饰的或全合成的结构性AR编码序列，所述序列已经变化以增强该基因在植物中的表达。构建这种修饰的或合成基因的方法在Fischoff和Perlak，美国专利第5,500,365号中有描述。
基因表达水平不仅取决于启动子的组合、RNA加工信号和终止子元件，而且取决于如何使用这些元件来提高选择标记基因表达的水平，这对于分子生物学领域、尤其是植物分子生物学领域的技术人员来说应是容易浅显的。植物转化在构建植物表达载体后，几种标准方法可用于将该载体引入到植物宿主中，由此产生转基因植物。这些方法包括(1)农杆菌介导的转化(根癌农杆菌或毛根农杆菌)(参见例如，Lichtenstein和Fuller，载于Generic Engineering，第6卷，PWJ Rigby编辑，伦敦，Academic Press,1987；以及Lichtenstein,C.P.和Draper,J.，载于DNA克隆，第Ⅱ卷，D.M.Glover编辑，Oxford,IRI Press,1985))，(2)粒子传递系统(参见例如，Gordon-Kamm等，Plant Cell2:603(1990)；或BioRad Technical Bulletin 1687，同上)，(3)微注射方案(参见例如，Green等，同上)，(4)聚乙二醇(PEG)法(参见例如Draper等，Plant Cell,Physiol.23:451,1982；或例如Zhang和Wu,Theor.Appl.Genet.76:835,1988),(5)脂质体介导的DNA摄取(参见例如，Freeman等，Plant Cell Physiol.25:1353,1984)，(6)电穿孔方案(参见例如，Gelvin等，同上；Dekeyser等，同上；Fromm等，Nature 319:791,1986；Sheen,Plant Cell 2:1027,1990；或Jang和Sheen,Plant Cell 6:1665,1994)，以及(7)涡旋混合法(参见例如Kindle，同上)。对于本发明，转化方法不是关键的。提供有效转化的任何方法都可以采用。当可利用较新方法转化农作物或其它宿主细胞时，可以直接使用这些方法。用于实施本发明的适合植物包括但不限于甘蔗、小麦、水稻、玉米、甜菜、马铃薯、大麦、木薯、甘薯、大豆、高粱、木薯、香蕉、萄萄、燕麦、番茄、小米、椰子、柑橘、黑麦、甘蓝、苹果、西瓜、canola、棉花、胡萝卜、大蒜、洋葱、胡椒、草莓、薯蓣、花生、菜豆、豌豆、芒果、柑桔植物、胡桃以及向日葵。
下面是一个概述一种具体技术即农杆菌介导的植物转化的实施例。用该技术，操作基因以转移到植物细胞基因组中的一般方法分两个阶段进行。首先，在大肠杆菌进行克隆和DNA修饰步骤，并通过接合或电穿孔将含有目的基因构建物的质粒转移到农杆菌。第二阶段，产生的农杆菌菌株用来转化植物细胞。因此，对于普遍性植物表达载体，所述质粒含有允许其在农杆菌中复制的复制起点和以及含有在大肠杆菌有功能的高拷贝数的复制起点。在转移到随后引入植物的农杆菌之前，这使得易产生和测试大肠杆菌中的转基因。抗性基因可以携带于载体中，一种用于细菌选择，例如链霉素抗性基因；而另外一种在植物中发挥作用，例如编码卡那霉素抗性或除草剂抗性的基因。用于加入一种或多种转基因的限制性内切核酸酶位点和定向T-DNA边界序列也存在于所述载体，所述边界序列当通过农杆菌的转移功能识别时，可以将转移到界定所述植物的DNA区。
在另一实施例中，通过射入其上沉淀克隆DNA的钨微粒到细胞可以转化植物细胞。用于射击的Biolistic仪(Bio-Rad)、火药燃料(gunpowder charge)(22口径Power Piston Tool Charge)或空动气浪驱动塑料大颗粒通过枪筒。将其表面沉积有DNA的等份钨颗粒悬液置于上述塑料大颗粒前面。塑料大颗粒在丙烯酸阻挡板处燃烧，该阻挡板上有一个上述大塑料颗粒不能通过的小孔。结果，所述塑料大颗粒猛烈撞击击碎在阻挡板，而钨微粒通过该板上的小孔继续向其靶移动。对于本发明，所述靶可以是任何植物细胞、组织、种子或胚胎。导入细胞的微粒上的DNA整合到或者细胞核或者叶绿体。
一般而言，现在在植物细胞中进行转基因转移和表达对于本领域技术人员来说是常规操作，并且已经成为进行植物基因表达研究和产生具有农业或商业效益的改良植物变种的主要工具。转基因植物的再生例如根据标准植物组织培养技术，用植物表达载体转化的植物细胞可以从单细胞、愈伤组织或叶片进行再生。本领域熟知的是，得自几乎任何植物的各种细胞、组织和器官均可以成功再生成一株完整植物；这类技术描述于例如Vasil，同上；Green等，同上；Weissbach和Weissbach，同上；和Gelvin等，同上。
在一个具体实施例中，在35S CaMV启动子和胭脂氨酸合酶终止子的控制下、并携带选择标记(例如卡那霉素抗性)的克隆DNA多肽构建物转化到农杆菌中。如Horsch等(Science 227:1229,1985)所述，用含载体的农杆菌转化叶圆盘(例如烟草或马铃薯叶圆盘)。几周(例如3-5周)后在，含卡那霉素(例如100μg/mL)的植物组织培养基上选择推定的转化体。然后将卡那霉素抗性苗放置于不含发根激素的植物组织培养基上。之后选择用于温室生长的卡那霉素抗性植株。假如需要，则将得自自花授粉转基因植物的种子播种在无土培养基中并生长于温室。通过将表面消菌的种子播种在无激素但含有卡那霉素的培养基上，从而选择卡那霉素抗性子代。用标准技术进行转基因的整合分析(参见例如Ausubel等，同上；Gelvin等，同上)。
然后用标准免疫印迹和DNA检测技术，就转基因DNA的传递筛选表达选择标记的转基因植物。与用相同转基因建立的其它转基因植株相比，每个阳性转基因植株和其转基因子代都是唯一独特的。所述转基因DNA整合到植物基因组DNA在大多数情况下是随机的，而整合的位点可能显著影响转基因表达的水平和组织以及发育类型。结果常常是为了鉴定和选择具有最合适表达分布型的植株，而就每种转基因筛选许多转基因系。
评估各个转基因系的转基因表达水平。首先测定RNA水平的表达，以鉴定和计数表达阳性的植株。应用RNA分析的标准技术，而RNA标准技术包括采用设计来只扩增转基因RNA模板的寡核苷酸引物的PCR扩增检测法和采用转基因特异性探针的溶液杂交检测法(参见例如，Ausubel等，同上)。然后采用AR特异性抗体，通过蛋白质免疫印迹分析分析RNA阳性植株的蛋白表达(参见例如，Ausubel等，同上)。此外，分别采用转基因特异性核苷酸探针和抗体，根据标准操作流程进行原位杂交和免疫细胞化学检测，以确定转基因组织中的表达位点。
AR基因的异位表达对于产生抗致病原的抗性水平增高的转基因植株是有用的。
此外，假如需要，当上述重组AR蛋白在任何细胞或转基因植物(例如，如上所述)表达时，可以采用例如亲和层析分离该蛋白。在一个实施例中，可以将抗AR多肽抗体(例如按Ausubel等(同上)所述方法或用任何标准技术产生的)连接到层析柱并用来分离该多肽。在亲和层析之前可以采用标准方法进行AR产生细胞的裂解和分级分离(参见例如，Ausubel等，同上)。一旦分离后，假如需要，可以例如通过高效液相层析进一步纯化该重组蛋白(参见例如，Fisher,LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology,Work和Burdon编辑，Elsevier,1980)。
本发明多肽特别是短AR蛋白片段，可以通过化学合成产生(例如采用描述于Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984,ThePierce Chemical Co.,Rockford,IL中的方法)。这些多肽表达和纯化的一般技术也可以用来产生和分离有用的AR片段和类似物。工程植物对病原体防御应答的AR基因的异位表达正如以上所讨论的，设计用于表达AR基因产物的质粒构建物，例如对于激活赋予转基因植物抗病原体特性的植物防御途径是有用的。为了在相同植物、密切相关的物种、或远缘相关的植物种中表达，可以工程改造从宿主植物(例如拟南芥属或烟草属(Nicotiana)分离的AR基因。例如十字花科的拟南芥属NPR1基因可以工程改造用于组成型低水平表达，然后转化到拟南芥属宿主植物中。另一方面，拟南芥属NPR1基因可以工程改造用于在其他十字花科植物中表达，例如芸苔属(Brissicas)(例如硬花球花椰菜、甘蓝和花椰菜)。类似地，Nicotiana glutinosa的NPR1同系物可用于在相关茄科植物中表达，例如番茄、马铃薯和胡椒。为了获得病原体抗性，以有效水平表达AR蛋白是重要的。按照常规方法和检测，确定由AR基因异位表达赋予植物病原体保护水平的评估。
在一个工作实施例中，拟南芥属的NPR1基因(图5；SEQ ID NO:2)或Nicotiana glutinosa的NPR1同系物(图7A；SEQ ID NO:13)在Russet Burbank马铃薯中的组成型异位表达，用来控制致病疫霉感染。在一个特定实施例中，构建植物表达载体，所述载体含有在增强的CaMV 35S启动子控制下表达的NPR1 cDNA序列，正如McPherson和Kay(美国专利第5,359,142号)所述。然后根据描述于Fischhoff等(美国专利第5,500,365号)的方法，该表达载体用来转化RussetBurbank。为了评估抗真菌感染的抗性，使转化的Russet Burbank和合适的对照生长到大约8周龄，用致病疫霉菌丝体悬液接种叶子(例如从植物尖计第二或第三片叶子)。将致病疫霉菌丝体插入物(plug)接种于叶中脉的两侧。随后植株于27℃在有恒定荧光灯的生长室中培育。
然后根据常规实验方法，评价转化的Russtet Burbank和对照植株的叶子对致病疫霉感染的抗性。为进行该评价，接种后连续7天每24小时记录每片叶子的损伤数目和感染叶面积的百分率。从这些数据确定对致病疫霉的抗性水平。表达NPR1基因的转化马铃薯植株相对于对照植株对致病疫霉的抗性水平升高，本发明认为所述转化的马铃薯植株是有用的。
另一方面，为了评价整个植株水平的抗性，将转化植株和对照植株移植到含有致病疫霉接种物的盆栽土壤。之后评价植株在几天到数周的时间内真菌感染症状(例如叶萎蔫或腐烂)。再者，表达NPR1基因的转化马铃薯植株相对于对照植株对真菌病原体致病疫霉的抗性水平提高，本发明认为所述转化的马铃薯植株是有用的。
在另一个工作实施例中，在番茄的Nicotiana glutinosa的NPR1同系物的表达用来控制例如丁香假单胞菌的细菌感染。具体地讲，构建含有得自Nicotiana glutinosa的NPR1同系物的cDNA序列(图7A；SEQ ID NO:13)的植物表达载体，所述cDNA序列在增强的CaMV 35S启动子控制下表达，如McPherson和Kay(同上)所述。再后根据Fischhoff等(同上)所述的方法，将该表达载体用来转化番茄植株。为了评价对细菌感染的抗性，培育转化的番茄植株和合适的对照，再根据标准方法例如本文所述方法，用丁香假单胞菌悬液接种其叶子。随后，植株培育在生长室中，再后按照标准方法分析所接种叶子的抗病性体征。例如接种后，记录和评价每片叶的萎黄变损伤的数目和感染叶面积的百分率。从这些数据的统计分析确定对丁香假单胞菌的抗性水平。表达Nicotiana glutinosa基因NPR1同系物的转化番茄植株，相对于对照植株对丁香假单胞菌的抗性水平提高，本发明认为所述转化的番茄植株是有用的。
在又一工作实施例中，水稻NPR1同系物的表达用来控制真菌病，例如控制Magnaporthe grisea的组织感染，即稻瘟病的原因。在一个具体方法中，构建含有水稻NPR1同系物的cDNA序列的植物表达载体，所述cDNA序列在Wu等(WO91/09948)所述水稻肌动蛋白启动子的控制下组成性表达。然后按照常规方法例如采用描述于Hiei等(PlantJournal 6:271-282,1994)的方法，将该表达载体用来转化水稻植株。为了评价对真菌感染的抗性，培育转化水稻植株和合适的对照，然后按照标准方法用M.Grisea菌丝体悬液接种其叶子。随后植株培育在生长室中，再后按照标准方法分析所接种叶子的抗病性。例如，接种后记录和评价每片叶子的损伤数和感染叶面积的百分率。从这些数据的统计分析确定对M.grisea的抗性水平。表达水稻NPR1同系物的转化水稻植株相对于对照植株对M.grisea的抗性水平提高，本发明认为所述转化水稻植株是有用的。AR互相作用多肽分离AR序列也有助于鉴定与该AR蛋白相互作用的多肽。用任何标准的双杂种系统分离这类多肽编码序列(参见例如，Fields等，Nature 340:245-246,1989；Yang等，Science 257:680-682,1992；Zervos等，Cell 72:223-232,1993)。例如，完整或部分的AR序列可以融合到DNA结合域(诸如GAL4或LexA DNA结合域)。在确立该融合蛋白本身并不激活拥有合适DNA结合位点的报道基因(例如lacZ或LEU2报道基因)的表达之后，该融合蛋白用作相互作用的靶。再后融合到激活域(例如酸性激活域)的候选相互作用蛋白与AR融合物在宿主细胞共表达，通过接触AR序列并刺激报道基因表达的能力鉴定相互作用蛋白。用该筛选方法鉴定的AR作用蛋白，对于在获得性抗性信号传导途径中涉及的蛋白提供了良好的候选物。抗体本文所述的AR多肽(或免疫原性片段或类似物)可以用来产生本发明有用的抗体；用重组或多肽合成技术也可以产生这类多肽(参见例如，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984,PiereceChemical Co.,Rockford,IL；Ausubel等，同上)。所述多肽可以偶联到载体蛋白，诸如描述于Ausubel等，同上中的KLH。KLH多肽与弗氏佐剂混合并注射入豚鼠、大鼠或优选的兔子。通过多肽抗原亲和层析可以纯化抗体。
用上述AR多肽和标准杂交瘤技术可以制备单克隆抗体(参见例如，Kohler等，Nature 256:495,1975；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,NY,1981；Ausubel等，同上)。
多克隆或单克隆抗体一旦产生后，用蛋白质印迹或免疫沉淀分析(采用描述于Ausubel等，同上的方法)测试多克隆或单克隆抗体的特异性AR识别。特异性识别AR多肽的抗体在本发明被认为是有用的；这类抗体可以用于例如免疫检测法，以监测植物产生的AR多肽水平。应用本文所述的发明对于各种各样的农业和商业用途是有用的，所述用途包括但不限于提高抗植物病原体的获得性抗性、提高农作物产量、改善农作物和观赏植物的品量以及降低农业生产成本。具体地说，AR基因在植物细胞的异位表达提供了对植物病原体的获得性抗性，并可以用来保护植物免受使植物生产力和生命力降低的病原体侵染。
本发明通过促进宿主抗性的天然机制，也提供了广谱病原体的抗性。例如，AR转基因可以在植物细胞中以足够高的水平表达，其水平足以在缺乏来自病原体的信号的情况下，组成性启动获得性抗性植物防御反应。通过按本文所述或按照任何常规方法检测防御反应基因的表达水平，可以确定与这种植物防御反应有关的表达水平。假如需要，通过可控制的启动子(例如组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子)，或通过由外源信号或试剂诱导的启动子(诸如病原体或损伤诱导的控制元件)，表达所述AR转基因，因此限制获得性抗性防御反应的暂时性表达或组织表达或两者。所述AR基因也可以在根、叶、果实或在植物对病原体渗入和感染易感的部位表达。
本发明也可用于通过增强植物的SAR防御机制而控制植物疾病。具体地说，本发明可用于战胜已知受植物SAR防御机制抑制的疾病。这些疾病包括但不限于TMV和TNV引起的病毒性疾病、假单胞菌属和黄单胞菌属引起的细菌性疾病、以及白粉菌属、霜霉属、疫霉属、刺盘孢属和Magnaporthe grisea引起的真菌疾病。在特别典型的方法中，AR基因在转基因植物中的组成型或诱导型表达可用于控制白粉菌属引起的小麦白粉病、黄单胞菌属引起的胡椒细菌性叶斑病、丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)引起的番茄细菌性萎蔫和细菌斑、以及野油菜黄单胞菌引起的柑桔和胡桃细菌枯萎病。
其它实施方案本发明还包括任何天然产生的植物AR多肽的类似物。类似物可以由于氨基酸序列的差异、翻译后修饰或该二者而不同于天然产生的AR蛋白。本发明的类似物一般至少表现出40％，更优选50％，最优选69％，甚至70％、80％、90％相同于完整或部分的天然产生的植物AR氨基酸序列。序列比较的长度至少是15个氨基酸残基，优选至少是25个氨基酸残基，更优选多于35个氨基酸残基。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化作用；这类修饰作用可以发生于多肽合成或加工期间或用分离修饰酶处理后。类似物也可以因为一级序列改变而不同于天然产生的AR多肽。这些变化包括天然存在和诱导产生的遗传变异体(例如，如Sambrook,Fritsch和Maniatis(Molecuar Cloning:A Laboratory Manual(第二版)，CSH Press,1989)或Ausubel等(同上)所述，通过辐射或暴露于甲磺酸乙酯导致的随机诱变、或位点特异性诱变产生的)。也包括环化肽、分子和含非L-氨基酸(例如D-氨基酸或非天然存在或合成的氨基酸(例如β或γ氨基酸))残基的类似物。
除了全长多肽外，本发明也包括AR多肽片段。本文所使用的术语“片段”是指至少20个连续氨基酸，优选至少30个连续氨基酸，更优选至少50个连续氨基酸，最优选至少60-80个或更多的连续氨基酸。用本领域技术人员已知的方法可以产生AR多肽片段，或者产生自正常蛋白的加工(例如，去除新生多肽的生物学活性不需要的氨基酸，或通过替代的mRNA剪接或替代的蛋白加工事件去除氨基酸)。在优选实施方案中，AR多肽片段包括锚蛋白重复基元，如本文所述。在其它优选实施方案中，AR片段能够与AR信号传导级联的第二个多肽成分相互作用。
此外，本发明包括有助于特异性检测AR核酸的核苷酸序列。因此，本文所述AR序列或其部分可以用作探针，以在常规条件下、采用标准杂交技术与得自其它植物(例如双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和藻类)的核苷酸序列杂交。杂交到AR编码序列或其互补序列的序列和编码AR多肽的序列在本发明认为是有用的。本文所使用的用于核酸序列的术语“片段”是指至少5个连续核苷酸，优选至少10个连续核苷酸，更优选至少20-30个连续核苷酸，最优选至少40-80个或更多的连续核苷酸。AR核酸序列片段可以用本领域技术人员已知的方法产生。保藏粘粒21A4-2-1、21A4-4-3-1、21A4-P5-1已经于1996年7月8日保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC No.97649、97650和97651。质粒pKExNPR1于1996年7月31日保藏，保藏号为ATCC No.97671。申请人承认他们的责任是，在专利有效期结束前，如果这些质粒失去活力，则更换这些质粒，并承认他们的责任是通知美国典型培养物保藏中心该专利的颁发，此时公众可获得该保藏物。在此时间之前，根据条款37 CFR§1.14和35 USC§112，专利局局长(Commissioner of Patents)可以获得该保藏物。当提交该主题申请的相应物或子代的所在国的外国专利法要求时，可获得这些保藏物。应该理解，可使用保藏物并不代表许可实施该主题发明。
在本说明书中述及的所有出版物和专利申请均通过引用结合到本文中，其程度与各个独立的出版物或专利申请具体地且独立地通过引用结合的程度相同。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人The General Hospital Corporation et al.(ⅱ)发明名称获得性抗性及其用途(ⅲ)序列数28(ⅳ)通信地址(A)收信人Clark & Elbing LLP(B)街道176 Federal Street(C)城市Boston(D)州MA(E)国家美国(F)邮政编码02110(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)当前申请数据(A)申请号PCT/US97/----(B)申请日1997年8月8日(C)分类(ⅶ)先前申请数据(A)申请号60/023,851(B)申请日1996年8月9日(A)申请号60/035,166(B)申请日1997年1月10日(A)申请号60/046,769(B)申请日1997年5月16日(ⅷ)代理律师/代理人资料(A)姓名Elbing,Karen L(B)注册号35,238(C)参考/档案号00786/339WO4(ⅸ)电信资料(A)电话617-428-0200(B)传真617-428-7045(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7548个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AAGCTTGTGA TGCAAGTCAT GGGATATTGC TTTGTGTTAA GTATACAAAA CCATCACGTG 60GATACATAGT CTTCAAACCA ACCACTAAAC AGTATCAGGT CATACCAAAG CCAGAAGTGA 120AGGGTTGGGA TATGTCATTG GGTTTAGCGG TAATCGGATT GAACCCTTTC CGGTATAAAA 180TACAAAGGCT TTCGCAGTCT CGGCGTATGT GTATGTCTCG GGGTATCTAC CATTTGAATC 240ACAGAACTTT TATGTGCGAA GTTTTCGATT CTGATTCGTT TACCTGGAAG AGATTAGAAA 300TTTGCGTCTA CGAAAAACAG ACAGATTAAT TTTTTCCAAC CCGATACAAG 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Gly Leu Glu Val Pro Lys Val250 255 260AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT GAT ATT 929Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile265 270 275GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA GAT GAT 977Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp280 285 290 295GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG ACC GCA 1025Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala300 305 310ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG AAT CCG 1073Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro315 320 325AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG CCA CAA 1121Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln330 335 340TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA GCA ACT 1169Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr345 350 355TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC ACT ATG GCG 1217Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala360 365 370 375GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT CTC AAA GGC 1265Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser Leu Lys Gly380 385 390CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA GAA CAA ATT 1313Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile395 400 405CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT GAA TTG AAG 1361Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys410 415 420ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT CAA CGT CTT 1409Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu425 430 435TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA ATG AAG GGA 1457Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly440 445 450 455ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT CTC ACT GGT 1505Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly460 465 470ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC AGA ATC CTA 1553Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu475 480 485GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC GTG GAA CTC 1601Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu490 495 500GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC CAG ATT ATG 1649Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gln Ile Met505 510 515AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC GAC ACT GCT 1697Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala520 525 530 535GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA CAA GAG ACA 1745Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr540 545 550CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA GGA AAT TCG TCC 1793Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly Asn Ser Ser555 560 565CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT GGA AAG AGG 1841Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg570 575 580TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGAGACTCTT GCCTCTTAGT GTA1894Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg 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Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys145 150 155 160Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile165 170 175Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp180 185 190Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu195 200 205Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys210 215 220Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser225 230 235 240Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu245 250 255Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys260 265 270Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu275 280 285Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala290 295 300Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala305 310 315 320Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala325 330 335Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly340 345 350Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile355 360 365Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln370 375 380Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln385 390 395 400Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala405 410 415Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg420 425 430Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met435 440 445Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu450 455 460Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys465 470 475 480Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala485 490 495Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser500 505 510Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala515 520 525Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg530 535 540Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn545 550 555 560Leu Glu Leu Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser 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(2)SEQ ID NO:5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度49个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Asn Ala Lys Thr Lys Asn Gly Tyr Thr Ala Leu His Gln Ala Ala Gln1 5 10 15Gln Gly His Thr His Ile Ile Asn Val Leu Leu Gln Asn Asn Ala Ser20 25 30Pro Asn Glu Leu Thr Val Asn Gly Asn Thr Ala Leu Ala Ile Ala Arg35 40 45Arg(2)SEQ ID NO:6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度28个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp20 25
(2)SEQ ID NO:7的资料(ⅰ)序列特征(A)长度28个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Lys Thr Lys Asn Gly Leu Ser Pro Leu His Met Ala Thr Gln Gly Asp1 5 10 15His Leu Asn Cys Val Gln Leu Leu Leu Ser Arg Asn20 25(2)SEQ ID NO:8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu1 5 10 15Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala20 25 30Cys(2)SEQ ID NO:9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys1 5 10 15Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg20 25 30Asn(2)SEQ ID NO:10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln1 5 10 15Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr20 25 30Leu(2)SEQ ID NO:11的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val1 5 10 15Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg20 25 30Leu(2)SEQ ID NO:12的资料(ⅰ)序列特征(A)长度55个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Gly Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Gly His Val Glu Val Val Lys1 5 10 15Leu Leu Leu Asp Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr Lys Ala Ile Ser Gln20 25 30Asn Asn Leu Asp Ile Ala Glu Val Lys Asn Pro Asp Asp Val Lys Thr35 40 45Met Arg Gln Ser Ile Asn Glu50 55
(2)SEQ ID NO:13的资料(ⅰ)序列特征(A)长度2172个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GTGACTTTCT AACTATGGCT GAAATTGCAG AACGAAAAAG ACTTTCCATT TTTCACTTGA60ATGAAACCCA AAATGGAAAT CTATCTCTCT TCTTCTTCTC TTTTACTACC TCCATTTCCA 120TGGCTTTCCC TCCTCTACCT TCCCTAGCTC TTTTCAATTT CTAGAATATT CTTTTCTTAG 180TCTGTAATTA TCTATAGCTC AATTTCTAAG ACAGAACTTA TGTAAGGCGG CTTTCTGTAA 240TGGATAATAG TAGGACTGCG TTTTCTGATT CGAATGACAT CAGCGGAAGC AGTAGTATAT 300GCTGCATCGG CGGCGGCATG ACTGAATTTT TCTCGCCGGA GACTTCGCCG GCGGAGATCA 360CTTCACTGAA ACGCCTATCG GAAACACTGG AATCTATCTT CGATGCGTCT TTGCCGGAGT 420TTGACTACTT CGCCGACGCT AAGCTTGTGG TTTCCGGCCC GTGTAAGGAA ATTCCGGTGC 480ACCGGTGCAT TTTGTCGGCG AGGAGTCCGT TCTTTAAGAA TTTGTTCTGC GGTAAAAAGG 540AGAAGAATAG TAGTAAGGTG GAATTGAAGG AGGTGATGAA AGAGCATGAG GTGAGCTATG 600ATGCTGTAAT GAGTGTATTG GCTTATTTGT ATAGTGGTAA AGTTAGGCCT TCACCTAAAG 660ATGTGTGTGT TTGTGTGGAC AATGACTGCT CTCATGTGGC TTGTAGGCCA GCTGTGGCAT 720TCCTGGTTGA GGTTTTGTAC ACATCATTTA CCTTTCAGAT CTCTGAATTG GTTGACAAGT 780TTCAGAGACA CCTACTGGAT ATTCTTGACA AAACTGCAGC AGACGATGTA ATGATGGTTT 840TATCTGTTGC AAACATTTGT GGTAAAGCAT GCGAGAGATT GCTTTCAAGC TGCATTGAGA 900TTATTGTCAA GTCTAATGTT GATATCATAA CCCTTGATAA AGCCTTGCCT CATGACATTG 960TAAAACAAAT TACTGATTCA CGAGCGGAAC TTGGTCTACA AGGGCCTGAA AGCAACGGTT 1020TTCCTGATAA ACATGTTAAG AGGATACATA GGGCATTGGA TTCTGATGAT GTTGAATTAC 1080TACAAATGTT GCTAAGAGAG GGGCATACTA CCCTAGATGA TGCATATGCT CTCCATTATG 1140CTGTAGCGTA TTGCGATGCA AAGACTACAG CAGAACTTCT AGATCTTGCA CTTGCTGATA 1200TTAATCATCA AAATTCAAGG GGATACACGG TGCTGCATGT TGCAGCCATG AGGAAAGAGC 1260CTAAAATTGT AGTGTCCCTT TTAACCAAAG GAGCTAGACC TTCTGATCTG ACATCCGATG 1320GAAGAAAAGC ACTTCAAATC GCCAAGAGGC TCACTAGGCT TGTGGATTTC AGTAAGTCTC 1380CGGAGGAAGG AAAATCTGCT TCGAATGATC GGTTATGCAT TGAGATTCTG GAGCAAGCAG 1440AAAGAAGAGA CCCTCTGCTA GGAGAAGCTT CTGTATCTCT TGCTATGGCA GGCGATGATT 1500TGCGTATGAA GCTGTTATAC CTTGAAAATA GAGTTGGCCT GGCTAAACTC CTTTTTCCAA 1560TGGAAGCTAA AGTTGCAATG GACATTGCTC AAGTTGATGG CACTTCTGAG TTCCCACTGG 1620CTAGCATCGG CAAAAAGATG GCTAATGCAC 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Ala Lys Leu Val Val Ser Gly Pro Cys Lys Glu Ile Pro Val65 70 75 80His Arg Cys Ile Leu Ser Ala Arg Ser Pro Phe Phe Lys Asn Leu Phe85 90 95Cys Gly Lys Lys Glu Lys Asn Ser Ser Lys Val Glu Leu Lys Glu Val100 105 110Met Lys Glu His Glu Val Ser Tyr Asp Ala Val Met Ser Val Leu Ala115 120 125Tyr Leu Tyr Ser Gly Lys Val Arg Pro Ser Pro Lys Asp Val Cys Val130 135 140Cys Val Asp Asn Asp Cys Ser His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Ala145 150 155 160Phe Leu Val Glu Val Leu Tyr Thr Ser Phe Thr Phe Gln Ile Ser Glu165 170 175Leu Val Asp Lys Phe Gln Arg His Leu Leu Asp Ile Leu Asp Lys Thr180 185 190Ala Ala Asp Asp Val Met Met Val Leu Ser Val Ala Asn Ile Cys Gly195 200 205Lys Ala Cys Glu Arg Leu Leu Ser Ser Cys Ile Glu Ile Ile Val Lys210 215 220Ser Asn Val Asp Ile Ile Thr Leu Asp Lys Ala Leu Pro His Asp Ile225 230 235 240Val Lys Gln Ile Thr Asp Ser Arg Ala Glu Leu Gly Leu Gln Gly Pro245 250 255Glu Ser Asn Gly Phe Pro Asp Lys His Val Lys Arg Ile His Arg Ala260 265 270Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Leu Gln Met Leu Leu Arg Glu Gly275 280 285His Thr Thr Leu Asp Asp Ala Tyr Ala Leu His Tyr Ala Val Ala Tyr290 295 300Cys Asp Ala Lys Thr Thr Ala Glu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Ala Asp305 310 315 320Ile Asn His Gln Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala325 330 335Met Arg Lys Glu Pro Lys Ile Val Val Ser Leu Leu Thr Lys Gly Ala340 345 350Arg Pro Ser Asp Leu Thr Ser Asp Gly Arg Lys Ala Leu Gln Ile Ala355 360 365Lys Arg Leu Thr Arg Leu Val Asp Phe Ser Lys Ser Pro Glu Glu Gly370 375 380Lys Ser Ala Ser Asn Asp Arg Leu Cys Ile Glu Ile Leu Glu Gln Ala385 390 395 400Glu Arg Arg Asp Pro Leu Leu Gly Glu Ala Ser Val Ser Leu Ala Met405 410 415Ala Gly Asp Asp Leu Arg Met Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg Val420 425 430Gly Leu Ala Lys Leu Leu Phe Pro Met Glu Ala Lys Val Ala Met Asp435 440 445Ile Ala Gln Val Asp Gly Thr Ser Glu Phe Pro Leu Ala Ser Ile Gly450 455 460Lys Lys Met Ala Asn Ala Gln Arg Thr Thr Val Asp Leu Asn Glu Ala465 470 475 480Pro Phe Lys Ile Lys Glu Glu His Leu Asn Arg Leu Arg Ala Leu Ser485 490 495Arg Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Glu Val500 505 510Leu Asn Lys Ile Met Asp Ala Asp Asp Leu Ser Glu Ile Ala Tyr Met515 520 525Gly Asn Asp Thr Ala Glu Glu Arg Gln Leu Lys Lys Gln Arg Tyr Met530 535 540Glu Leu Gln Glu Ile Leu Thr Lys Ala Phe Thr Glu Asp Lys Glu Glu545 550 555 560Tyr Asp Lys Thr Asn Asn Ile Ser Ser Ser Cys Ser Ser Thr Ser Lys565 570 575Gly Val Asp Lys Pro Asn Lys Leu Pro Phe Arg Lys580 585(2)SEQ ID NO:15的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GTGACAGACT TGCTCCTACT G 21(2)SEQ ID NO:16的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CAGTGTGTAT CAAAGCACCA 20(2)SEQ ID NO:17的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TTCTCCAGAC CACATGATTA T 21(2)SEQ ID NO:18的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:TGAAGCTAAT ATGCACAGGA G 21(2)SEQ ID NO:19的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:GTAGGTGCTC TTGTTCTTCC C 21(2)SEQ ID NO:20的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:CACATAATTC CCACGAGGAT C 21
(2)SEQ ID NO:21的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg1 5 10 15Leu(2)SEQ ID NO:22的资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:23的资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:24的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:AARGARGAYC AYACNAA 17(2)SEQ ID NO:25的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:TAYGTYAAYG TNAARAC 17
(2)SEQ ID NO:26的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:GCCATNGTNG CYTGYTT17(2)SEQ ID NO:27的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:AARGTNAARA ARCAYGT 17(2)SEQ ID NO:28的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)MOLECULE DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:RAAYTCRCAN GTNCCYTTCA T2权利要求
1．含有编码获得性抗性多肽的分离核酸分子，其中所述获得性抗性多肽在表达所述多肽的植物能够赋予抗植物病原体抗性。
2．权利要求1的分离核酸分子，其中所述多肽能够介导病理相关多肽的表达。
3．权利要求1的分离核酸分子，其中所述多肽包含锚蛋白重复基元。
4．权利要求1的分离核酸分子，其中所述多肽从被子植物获得。
5．权利要求4的分离核酸分子，其中所述被子植物是茄科或十字花科的成员。
6．权利要求1的分离核酸分子，其中所述核酸分子是基因组DNA或cDNA。
7．权利要求1的分离核酸分子，其中所述植物病原体是细菌、病毒、类病毒、真菌、线虫或昆虫。
8．编码获得性抗性多肽的分离核酸分子，它特异性杂交到含图4的基因组核酸序列(SEQ ID NO:1)的核酸分子。
9．编码获得性抗性多肽的分离核酸分子，它特异性杂交到含图5的cDNA(SEQ ID NO:2)的核酸分子。
10．编码获得性抗性多肽的分离核酸分子，它特异性杂交到含图7A的cDNA序列(SEQ ID NO:13)的核酸分子。
11．权利要求8-10的分离核酸分子，其中所述核酸分子编码介导表达病理相关多肽的多肽。
12．权利要求8-10的分离核酸分子，其中所述核酸分子编码含锚蛋白重复序列基元的多肽。
13．权利要求1或8-10的分离核酸分子，其中所述核酸分子可操作性连接到表达控制区。
14．含有权利要求1或8-10的核酸分子的载体，所述载体能够指导表达由所述核酸分子编码的多肽。
15．含有权利要求1、8-10或14的分离核酸分子的细胞。
16．权利要求15的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
17．权利要求15的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
18．权利要求17的细胞，其中所述细菌细胞是农杆菌属细菌。
19．权利要求16的细胞，其中所述植物细胞抗植物病原抗性提高。
20．含有权利要求1、8-10或14的核酸分子的转基因植物，其中所述核酸分子在所述转基因植物中表达。
21．权利要求20的转基因植物，其中所述转基因植物是被子植物。
22．权利要求20的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。
23．权利要求20的转基因植物，其中所述双子叶植物是十字花科植物或茄科植物。
24．得自权利要求20的转基因植物的种子。
25．得自权利要求20的转基因植物的细胞。
26．大致纯的获得性抗性多肽，包括至少40％相同于图5(SEQ IDNO:3)或图7B(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的氨基酸序列。
27．权利要求26的大致纯多肽，其中所述多肽能够介导病理相关多肽的表达。
28．权利要求26的大致纯多肽，其中所述多肽包括锚蛋白重复序列基元或G蛋白偶联受体基元。
29．权利要求26的大致纯多肽，其中所述多肽从被子植物获得。
30．权利要求29的大致纯多肽，其中所述被子植物是茄科植物或十字花科植物的成员。
31．产生获得性抗性多肽的方法，所述方法包括步骤(a)提供用权利要求1或8-10的、在细胞中定位表达的核酸分子转化的细胞。(b)在表达该核酸分子的条件下培养所述转化细胞；和(c)回收获得性抗性多肽。
32．用权利要求31的方法产生重组获得性抗性多肽。
33．特异性识别并结合到获得性抗性多肽或其一部分的大致纯抗体。
34．权利要求33的大致纯抗体，其中所述抗体识别并结合到重组获得性抗性多肽或其一部分。
35．提供使得在转基因植物中对植物病原体引起疾病的抗性水平提高的方法，所述方法包括步骤(a)产生含有权利要求1或8-10的核酸分子的转基因植物细胞，其中所述核酸在上述植物细胞定位表达；和(b)从上述植物细胞生长成转基因植物，其中所述核酸分子在该转基因植物中表达，由此该转基因植物对植物病原体导致的疾病的抗性水平提高。
36．权利要求35的方法，其中所述植物病原体是细菌、病毒、类病毒、真菌、线虫或昆虫。
37．权利要求35的方法，其中所述植物病原体是疫霉属、霜霉属或假单胞菌属。
38．分离获得性抗性基因或其片段的方法，所述方法包括步骤(a)在杂交条件下，使图4(SEQ ID NO:1)、图5(SEQ ID NO:2)或图7A(SEQ ID NO:13)的核酸分子或其一部分与得自植物细胞的DNA制剂接触，所述杂交条件提供对至少有40％或更多序列相同于图4(SEQ IDNO:1)、图5(SEQ ID NO:2)或图7A(SEQ ID NO:13)的核酸序列的DNA序列的检测；和(b)分离所述杂交DNA。
39．分离获得性抗性基因或其片段的方法，所述方法包括步骤(a)提供植物细胞DNA样品；(b)提供与图4(SEQ ID NO:1)、图5(SEQ ID NO:2)或图7A(SEQ IDNO:13)的核酸的一个区具有序列同一性的一对寡核苷酸；(c)在适合聚合酶链式反应介导的DNA扩增的条件下，使该对寡核苷酸与所述植物细胞DNA接触；和；(d)分离所扩增的获得性抗性基因或其片段。
40．权利要求39的方法，其中所述扩增步骤采用从植物细胞制备的cDNA样品进行。
41．权利要求39的方法，其中所述对的寡核苷酸基于编码获得性抗性多肽的序列，其中所述获得性抗性多肽至少40％相同于图5(SEQ IDNO:3)或图7B(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
全文摘要
公开了编码植物获得性抗性蛋白的基因组序列和cDNA序列。这些多肽在转基因植物中的表达可用于提供增强的防御机制以对抗植物疾病。
文档编号C12N1/21GK1232468SQ97198570
公开日1999年10月20日 申请日期1997年8月8日 优先权日1996年8月9日
发明者F·M·奥苏贝尔, J·格拉泽布罗克, 董欣年, H·曹 申请人:综合医院公司, 杜克大学