一种三维灌流式细胞培养器及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种三维灌流式细胞培养装置及其应用，包括盒体，盖体及弹性卡夹，盒体的顶面设置有第一圆形凹槽，盖体的底面设置有与第一圆形凹槽半径大小相同的第二圆形凹槽；本发明在细胞培养装置中的凹槽底面由聚酯纤维组成的脉管，细胞或组织外植体位于两层脉管之间，形成“三明治”夹心培养，用聚酯纤维组成的脉管代替支架材料，最大程度减少了细胞培养的死角体积，更符合体内的生理微环境。在培养装置盒体的侧壁，分别设置了培养液进液通道和出液通道，培养液通过进液通道流入凹槽腔内，再从出液通道流走，从而实现灌流培养。本发明的装置使新生肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞成功分化为肾小管组织。
【专利说明】一种三维灌流式细胞培养器及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养设备或装置领域，具体涉及一种三维灌流式细胞培养器，同时还涉及一种三维灌流式细胞培养器的用途，在三维灌流培养条件下，使新生肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞成功分化为肾小管组织的一种细胞培养器。
【背景技术】
[0002]自Willhelm Roux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养，单层细胞培养技术已有百余年的历史。一个多世纪以来，单层细胞培养有了蓬勃的发展。特别是在制药或者疫苗合成等产业化领域，通过细胞的快速分裂，高效率地制造产品。但在生命科学基础研究领域，对于细胞的体外培养，关注的不仅仅是它们的分裂生长，更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下，单层细胞培养技术所取得的研究结果和体内的情况不符合，因为细胞在体外改变的环境下增生，逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行，但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程。另外，我们在动物身上所观察到的结果，往往是最终呈现的表现型，而非研究者最为关心的中间过程。显然，如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟，一直是生命科学家思索的问题。尤其是在再生医学领域，迫切需要建立一套细胞培养技术，既能生长传代，还能最大程度地维持体内性状，并使干细胞分化产生新的组织结构，以便替代体内因疾病损坏的组织。随着组织工程的新兴发展，三维细胞培养技术应运而生。
[0003]体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的单层细胞培养，三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养中，细胞外基质蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织结构，所创建的细胞生长环境，需要最大程度地模拟体内环境。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等领域得到了广泛的应用；同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面，利用三维培养获得了和二维单层培养完全不同的结果，引起了药物学家的极大兴趣。
[0004]在常规的三维细胞培养中，一般采用静态培养的方法。仔细观察静态培养中的微环境，不难发现培养液的总体积数倍大于与所培植细胞真正接触的培养液体积，这一过大的“死角体积”阻碍了细胞的分化。在静态环境中，细胞产生的代谢废物积累在培养腔室中，对分化有害。引入动态的灌流培养，保证持续新鲜的化学培养液以恒定的速率进入培养器内部，提供细胞分化所必须的营养和诱导因子，并及时移去代谢废物。离开灌注培养器的培养液不再循环使用，而是通过乳胶导管被导入废液瓶。这为分化奠定了前提。
[0005]运用脉管取代支架材料，填充在培养器内的凹槽腔中。实验证实，和支架材料相比较，外观海绵状的脉管能更明显地降低培养的“死角体积”。化学合成的脉管由约5 μ m截断直径的中空管状纤维组成，管状纤维的侧面分布有大量nm级的孔洞。脉管铺设在凹槽腔中后，细胞营养液先经过进流腔流入脉管的中空管内，再从侧面孔洞中渗漏出来才接触到细胞，从而真实模拟体内毛细血管供血的生理状况，使体外再生组织成为可能。
[0006]即使按照以上工艺步骤，引入了灌流式营养液运输及在细胞器中填充脉管降低死角体积，如果所选用的脉管材料不合适，仍不能使干细胞分化成组织。脉管是一种具有网孔结构的高分子合成材料，它应该具备充分的可变形性，足够的亲水性表面以及最佳的生物适配性。在寻找适于作为脉管的材料方面，不能考虑刚性物质。通过对胶原纤维和羊毛等大量海绵类物质进行实验筛选，我们最终发现，聚酯纤维是适合制造脉管的最佳材料。[0007]干细胞是具有多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在加入特定诱导因子的条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。目前，干细胞治疗方兴未艾，即把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的组织的目的。近年来，成人干细胞移植在挽救白血病、淋巴癌和其它血液病人生命方面发挥了重要作用。但是，直接将干细胞植入人体内，存在着发展成肿瘤的风险。毫无疑问，将干细胞在体外预先定向分化成所需的组织，再移植到体内，代表了未来临床治疗的方向。
[0008]透析和器官移植是目前临床上处理肾衰竭的二种常用治疗方案。然而，高昂的医疗费用，短暂的透析寿命(一般仅能维持几年)和匮乏的供体器官是造成急慢性肾衰竭死亡率高的成因。运用本发明三维灌流式细胞培养器，我们在世界上首次使新生肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞成功分化为肾小管，为治疗肾小管坏死造成的急慢性肾炎带来新的希望。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是在于提供了一种三维灌流式细胞培养装置，本发明在细胞培养装置中的凹槽底面设置由聚酯纤维组成的脉管，细胞或组织外植体位于两层脉管之间，形成“三明治”夹心培养，用聚酯纤维组成的脉管代替支架材料，最大程度减少了细胞培养的死角体积，更符合体内的生理微环境。在培养装置盒体的侧壁，分别设置了培养液进液通道和出液通道，培养液通过进液通道流入凹槽腔内，再从出液通道流走，从而实现灌流培养。
[0010]本发明的另一个目的是在于提供了一种三维灌流式细胞培养器在细胞培养中的应用。本发明所述装置可使新生肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞成功分化为肾小管组织。
[0011]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0012]一种三维灌流式细胞培养装置，包括盒体，盖体及弹性卡夹，盖体设置在盒体上方并通过连接件与盒体活动连接，盒体的顶面设置有第一圆形凹槽，盒体侧壁上水平设置有与第一圆形凹槽连通的进液通道；盒体上与进液通道相对的另一侧壁上水平设置有与第一圆形凹槽连通的出液通道；进液通道的轴线与出液通道的轴线错开；盖体的底面设置有与第一圆形凹槽半径大小相同的第二圆形凹槽；第一圆形凹槽与第二圆形凹槽同轴，第一圆形凹槽的底面设置有第一纤维层，第二圆形凹槽的底面设置有第二纤维层；盖体的底面开设的圆环形凹槽内设置有第一圆形弹性垫圈，第一圆形弹性垫圈凸出于盖体的底面，第二圆形凹槽的槽口设置在第一圆形弹性垫圈内，装置闭合时通过弹性卡夹将盒体和盖体夹紧，第一圆形凹槽和第二圆形凹槽构成圆柱形内腔。
[0013]所述的第一圆形凹槽槽口处的槽壁开设的内凹环设置有第二圆形弹性垫圈，第二圆形凹槽的槽口处的槽壁开设的内凹环设置有第三圆形弹性垫圈；
[0014]所述的第二圆形弹性垫圈的顶面与盒体的顶面在同一平面上，第三圆形垫圈的底面与盖体的底面在同一平面上；
[0015]所述的第一纤维层和第二纤维层的材质均为聚酯纤维；
[0016]所述的第一圆形凹槽的尺寸为半径5mm,高度5mm,第二圆形凹槽的尺寸为半径5mm,高度 5mm ；
[0017]所述的盒体尺寸为长度45mm,宽度40mm,高度36mm ；
[0018]所述的盒体为半透明的聚碳酸酯材料制成；
[0019]所述的弹性卡夹为不锈钢材质，与盒体通过不锈钢连接件活动连接。
[0020]一种三维灌流式细胞培养装置在细胞培养中的应用，其具体步骤如下:
[0021](I)将培养装置中的聚酯纤维(以下称为脉管)用镊子夹入到含培养液的平皿中，反复浸泡，以除去其中的气泡；
[0022](2)在双目放大镜下，用尖嘴镊将胚胎膜放置在脉管上。铺放平展后，再加上另一片圆形脉管，成为典型的“三 明治”组织外植体夹心培养；
[0023](3)乳胶导管一端放置在培养瓶中(含培养液)，通过一个高精度蠕动泵，与细胞培养装置的进液通道连接；另一条乳胶导管则将细胞培养装置的出液通道和废液瓶相连通；将细胞培养装置置于控温板上；
[0024](4)将步骤(2)中获得“三明治”组织外植体的置于第一圆形凹槽的底部，加少许培养液赶走气泡；合上培养装置盖体，夹上弹性夹片，使培养器底部和顶部固定密合；第一圆形凹槽和第二圆形凹槽构成圆柱形内腔，该内腔处于与外界隔绝的无菌状态；
[0025](5)将高精度蠕动泵设置成Iml/小时的流速，控温板设置为37摄氏度，保证细胞的培养和分化尽可能模拟体内条件，检测细胞培养情况。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0027]1、连续灌注培养保证供应细胞持续新鲜的营养成分，有利于增殖和分化；
[0028]2、培养过程无需CO2培养箱，高精度蠕动泵形成连续负压实现自动化培养，省去了常规单层细胞培养中易造成污染的换液等步骤；
[0029]3、和常规单层细胞培养相比较，三维灌流式培养技术无需使用血清，血清价格昂贵,无血清培养极大地降低了培养成本；
[0030]4、细胞培养器由聚碳酸酯材料组成，能够耐受多次反复的高温灭菌而不变形，使用寿命长。另外，聚碳酸酯的半透明特点，方便了实验操作者在培养阶段用显微镜动态观察组织再生过程；
[0031]5、将新生兔肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞铺设在该系统中，培养液中加入诱导因子醛固酮后，能分化出具有典型结构的肾小管组织，有希望用于替代疾病损伤的组织。
[0032]6.本发明在细胞培养器中的两个凹槽底部，均铺设了由聚酯纤维组成的脉管，细胞或组织外植体位于二层 脉管之间，形成“三明治”夹心培养，用聚酯纤维组成的脉管代替支架材料，最大程度减少了细胞培养的死角体积，更符合体内的生理微环境。
【专利附图】
【附图说明】[0033]图1A为一种三维灌流式细胞培养装置合盖时的三维结构示意图。
[0034]图1B为一种三维灌流式细胞培养装置开盖时的三维结构示意图。
[0035]图2为一种三维灌流式细胞培养装置的结构示意图；
[0036]图2A为一种三维灌流式细胞培养装置合盖时的剖面图；
[0037]图2B为一种三维灌流式细胞培养装置盖体的剖面图；
[0038]图2C为一种三维灌流式细胞培养装置盒体的剖面图；
[0039]图2D为一种三维灌流式细胞培养装置的外部结构示意图；
[0040]其中，1-盒体，2-盖体，3-弹性卡夹，4-连接件，5-1-第一圆形凹槽，5-2-第二圆形凹槽，6-1-进液通道,6-2-出液通道,7-第一圆形弹性垫圈，8-1-第二圆形弹性垫圈，8-2-第三圆形弹性垫圈，9-1-第一纤维层，9-2-第二纤维层。
[0041]图3为细胞培养装置内部培养情况示意图；
[0042]其中A为结构示意图，B为实物图:凹槽腔内设置了由聚酯纤维组成的脉管，胚胎干细胞位于二层脉管之间，形成“三明治”夹心培养。新生的肾小管组织能被染料着色，而脉管不被染色。
[0043]图4为本发明实施例3中的细胞培养装置的设置示意图；
[0044]其中a_灌注培养瓶，b_乳胶导管，C-高精度蠕动泵，d-细胞培养器，e-恒温热板，f_废液收集瓶。
[0045]图5为新生肾小管的免疫组织化学分析图。
【具体实施方式】
[0046]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
[0047]实施例1:
[0048]一种三维灌流式细胞培养装置，包括盒体1，盖体2及弹性卡夹3，盖体2设置在盒体I上方并通过连接件4与盒体1活动连接，盒体2的顶面设置有第一圆形凹槽5-1，盒体I侧壁上水平设置有与第一圆形凹槽5-1连通的进液通道6-1 ;盒体I上与进液通道相对的另一侧壁上水平设置有与第一圆形凹槽5-1连通的出液通道6-2 ;进液通道的轴线与出液通道的轴线错开；盖体2的底面设置有与第一圆形凹槽5-1半径大小相同的第二圆形凹槽5-2 ;第一圆形凹槽5-1与第二圆形凹槽5-2同轴，第一圆形凹槽5-1的底面设置有第一纤维层9-1，第二圆形凹槽5-2的底面设置有第二纤维层9-2 ;盖体2的底面开设的圆环形凹槽内设置有第一圆形弹性垫圈7，第一圆形弹性垫圈7凸出于盖体2的底面；第二圆形凹槽5-2的槽口设置在第一圆形弹性垫圈7内，装置闭合时通过弹性卡夹3将盒体I和盖体2夹紧，第一圆形凹槽5-1和第二圆形凹槽5-2构成圆柱形内腔,第一圆形弹性垫圈7由于压力缩回至圆环形凹槽，使得盖体2和盒体I紧密闭合。第一圆形凹槽5-1槽口处的槽壁开设的内凹环设置有第二圆形弹性垫圈8-1，第二圆形凹槽5-2的槽口处的槽壁开设的内凹环设置有第三圆形弹性垫圈8-2。第二圆形弹性垫圈8-1的顶面与盒体I的顶面在同一平面上，第三圆形垫圈8-2的底面与盖体的底面在同一平面上；第一纤维层9-1和第二纤维层9-2的材质均为聚酯纤维。第一圆形凹槽5-1的尺寸为半径5mm,高度5mm,第二圆形凹槽5-2的尺寸为半径5mm,高度5mm。盒体I尺寸为长度45mm,宽度40mm,高度36mm,为半透明的聚碳酸酯材料制成。弹性卡夹3为不锈钢材质，与盒体通过不锈钢连接件活动连接。(图1A,图1B,图2)
[0049]实施例2:
[0050]分离细胞
[0051]从新生兔中分离肾脏:
[0052]1、准备工作:手术剪刀、镊子等预先灭菌，100ml小烧杯中盛有不含酚红的MDM培养液，该培养液购自Gibco公司，货号21056# ;使用前加4-羟乙基哌嗪乙磺酸(英文缩写为HEPES )至终浓度5% ；
[0053]2、从动物房取新生2天内的兔娃。在通风橱内，将乙醚润湿一张厚棉垫，放置在I个圆玻璃皿中，将新生兔娃放置到含乙醚的园玻璃皿中1-2分钟，使麻醉；
[0054]3、将已麻醉的兔娃放置在一张厚白色棉垫上，颈部剪除动脉，使死亡；
[0055]4、用70%乙醇在兔腹部冲洗；
[0056]5、剪开兔娃下腹，小心地取出黄豆大小的2个小肾，置于MDM培养液中，立即用于
三维培养实验。
[0057]分离肾胚胎区用于三维培养:
[0058]1、取出新鲜分离的2个小肾，置入MDM培养液中浸泡；
[0059]2、在超净工作台内，用灭菌的不含酚红的MDM培养液反复清洗，使新鲜分离的肾保持无圃状态；
[0060]3、将小肾周边黄色脂肪组织去掉，将干净的小肾置入另一含培养液的平皿中；
[0061]4、用镊子穿刺肾脏，用剪刀剪掉肾脏二端使成平块，将新的剪成平快的肾脏置入新的含培养液的平皿中；
[0062]5、分离肾胚胎区:用镊子小心掀下肾块外膜，又称胚胎区膜，其表面含大量的胚胎干细胞或称祖先细胞；将获得的胚胎区膜置入一含IMDM培养液的灭菌平皿中。
[0063]实施例3:
[0064]一种三维灌流式细胞培养装置在细胞培养中的应用，其具体步骤如下:
[0065]本实施例所用器皿及工具都已经过灭菌步骤。
[0066](I)将培养装置中的聚酯纤维(以下称为脉管)用镊子夹入到含IMDM培养液的平皿中，反复浸泡，以除去其中的气泡；
[0067](2)在双目放大镜下，用尖嘴镊将平皿中的胚胎膜展开，放置在一圆形的脉管上。铺放平展后，再加上另一片圆形脉管，成为典型的“三明治”组织外植体夹心培养，图3 ；
[0068](3)乳胶导管一端放置在培养瓶中(含500mlIHA工作培养液)，通过一个高精度蠕动泵，与细胞培养装置的进液通道连接；另一条乳胶导管则将细胞培养装置的出液通道和废液瓶相连通；将细胞培养装置置于控温板上；
[0069]所述的IHA工作培养液的配制:使用500ml含酚红的MDM培养液，购自Gibco公司，货号21980#，已含谷氨酰胺(Glutamine)和25mM HEPES ;先移去30ml该培养液，再分别加入 25ml HEPES(购自 Gibco 公司，货号 15630#，lM，100ml/瓶)、5ml Mix(购自 Gibco 公司，货号 15240#,含 IOOx Ant1-Anti, antibiotica-antimycotic)、500 μ I 预先过滤灭菌的1χ10_4Μ醛固酮母液，使得其在IHA工作培养液的终浓度为1χ10_7Μ ；[0070](4)将步骤(2)中获得“三明治”组织外植体的置于第一圆形凹槽的底部，加少许MDM培养液赶走气泡；合上培养装置盖体，夹上弹性夹片，使培养器底部和顶部固定密合；第一圆形凹槽和第二圆形凹槽构成圆柱形内腔，该内腔处于与外界隔绝的无菌状态；
[0071](5)将高精度蠕动泵设置成Iml/小时的流速，控温板设置为37摄氏度，保证细胞的培养和分化尽可能模拟体内条件；
[0072]整个三维灌流式细胞培养系统各组件的相互连接和配合关系见图4。
[0073]实施例4:
[0074]用免疫组化方法分析再生肾小管组织的形态结构:
[0075]实施例3中的胚胎区膜经过2周的灌注培养后，能分化出大量的肾小管。
[0076]免疫组织化学分析显示，肾小管在长达2到5周的培养时间内维持完整结构而不崩解。图5是培养2周后，不同视野下的层粘蛋白Yl (a-f)和闭合素(a’ -f’)免疫组织化学结果。标记层粘蛋白Y I的肾小管边缘结构清晰而连续(b、d中的星号*);多数视野下，闭合素结构清晰可见(a’ -d’中用白色箭头表示)。[0077]以上通过具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限于这些具体的实施例。本领域技术人员应当理解，还可以对本发明做各种修改、等同替换、变化等等。但是，这些变换只要未偏离本发明的精神，都应在本发明的保护范围之内。另外，本申请说明书和权利要求书所使用的一些术语并不是限制性的，仅仅是为了便于描述。
【权利要求】
1.一种三维灌流式细胞培养装置，包括盒体(1)，盖体(2)及弹性卡夹(3)，其特征在于:盖体(2)设置在盒体(1)上方并通过连接件(4)与盒体(1)活动连接，盒体(1)的顶面设置有第一圆形凹槽(5-1 )，盒体(1)侧壁上水平设置有与第一圆形凹槽(5-1)连通的进液通道(6-1);盒体(1)上与进液通道相对的另一侧壁上水平设置有与第一圆形凹槽连通的出液通道(6-2);进液通道的轴线与出液通道的轴线错开；盖体(1)的底面设置有与第一圆形凹槽半径大小相同的第二圆形凹槽(5-2);第一圆形凹槽(5-1)与第二圆形凹槽(5-2)同轴，第一圆形凹槽(5-1)的底面设置有第一纤维层(9-1)，第二圆形凹槽(5-2)的底面设置有第二纤维层(9-2);盖体(1)的底面开设的圆环形凹槽内设置有第一圆形弹性垫圈(7)，第一圆形弹性垫圈(7)凸出于盖体(2)的底面；第二圆形凹槽(5-2)的槽口设置在第一圆形弹性垫圈(7)内，装置闭合时通过弹性卡夹(3)将盒体(1)和盖体(2)夹紧，第一圆形凹槽(5-1)和第二圆形凹槽(5-2)构成圆柱形内腔。
2.根据权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的第一圆形凹槽(5-1)槽口处的槽壁开设的内凹环设置有第二圆形弹性垫圈(8-1)，第二圆形凹槽(5-2)的槽口处的槽壁开设的内凹环设置有第三圆形弹性垫圈(8-2)。
3.根据权 利要求2所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的第二圆形弹性垫圈(8-1)的顶面与盒体的顶面在同一平面上，第三圆形垫圈(8-2)的底面与盖体的底面在同一平面上。
4.根据权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的第一纤维层(9-1)和第二纤维层(9-2)的材质均为聚酯纤维。
5.根据权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的第一圆形凹槽(5-1)的尺寸为半径5mm,高度5mm,第二圆形凹槽(5-2)的尺寸为半径5mm,高度5mm。
6.根据权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的盒体(1)尺寸为长度45mm,宽度 40mm,高度 36mm。
7.根据权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的盒体(1)为半透明的聚碳酸酯材料制成。
8.根据权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置，所述的弹性卡夹(3)为不锈钢材质，与盒体(1)通过不锈钢连接件活动连接。
9.权利要求1所述的一种三维灌流式细胞培养装置在细胞培养中的应用。
【文档编号】C12M3/00GK103740591SQ201410024728
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】胡康洪 申请人:康珞生物科技（武汉）有限公司