专利名称：用于干细胞培养的灌流装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于细胞培养的灌流装置，特别涉及一种用于胚胎干细胞培 养的灌流装置。
背景技术：
20世纪50年代，科学家在畸形胎瘤中首次首次发现了胚胎干细(embryonic StemCell，ES细胞)，从此开创了干细胞生物学研究的历程。干细胞的研究与应用几乎涉及 所有生命科学和生物医学领域，是当今生命科学领域的热点和重点。干细胞能自我更新和 多向分化的生物学特性使得干细胞研究在动物克隆、新型高效药物的开发和肿瘤临床治疗 等方面有着广泛的应用前景。在胚胎干细胞体外培养中，除了正常的培养基外，需要先培养一层特殊的细胞 (如小鼠胚胎成纤维-mouse embryonic fibroblast MEF细胞等)，然后再在其上接种要 实验的干细胞。这些特殊的细胞就是饲养层细胞，通常是成纤维类细胞，这些细胞可以分 泌一些未知的必须生长因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor，LIF)、干细 胞因子(stem cell factor, SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast growth factor, bFGF)等，提供胚胎干细胞、诱导多能干细胞更好的营养。这些因子对干细胞的存 活和增殖是必需的，不仅可以使其数量增加，而且与干细胞在体内外的分化有关。实验证 明，饲养层细胞的作用不仅仅是产生了一些细胞因子，在大多数细胞发育和分化过程中，细 胞的黏附作用都发挥了相当重要的作用。ES细胞不能作为完全独立的细胞而生存，总是与 周围的细胞相联系着，在信号传导中的黏附受体调节着细胞的运动、增殖和分化。通常在胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养体系下，饲养层细胞与干细胞处于共培 养状态，两者无法分离彻底。如果采用饲养层与干细胞分别静态培养的方式，无法实时将饲 养层细胞分泌的因子传送到干细胞培养体系内，且操作过程多，大多不被采用。传统共培养 方式影响干细胞纯度，已在干细胞应用等方面起到了很大的限制作用。
实用新型内容本实用新型的目的在于克服现有培养体系的不足，提供一种既可满足干细胞的独 立培养环境，以保证细胞纯度，又避免参杂饲养层细胞影响的用于干细胞培养的灌流装置。本发明提供的用于干细胞培养的灌流装置，包括灌流瓶和废液瓶，还包括饲养层 细胞培养反应器以及待培养细胞灌流槽；所述饲养层细胞培养反应器包括带有进液口和出 液口的饲养层细胞灌流槽和与所述出液口相连通的连通管；所述连通管与所述待培养细胞灌流槽相连通，所述灌流瓶与所述饲养层细胞灌流 槽的进液口之间以及所述待培养细胞灌流槽与所述废液瓶之间均通过管道相连通；所述饲养层细胞培养反应器内设置有能阻止饲养层细胞进入待培养细胞灌流槽 的过滤装置。该过滤装置可以实现饲养层细胞和待培养细胞是分开培养，也即这样饲养层 细胞分泌的细胞因子等都可以随同培养液一起进入待培养细胞灌流槽中，同时又可以阻止
3饲养层细胞和其它杂细胞进入待培养细胞灌流槽中。在一种实施方式中，上述过滤装置为孔径大小能阻止饲养层细胞穿过但能实现液 体通过的半透膜，所述半透膜设置在所述饲养层细胞灌流槽内。如果所述饲养层细胞灌流槽内设置有细胞培养板，而所述半透膜设置在所述细胞 培养板的上方，所述饲养层细胞灌流槽的进液口和出液口设置在所述半透膜的上方。这样 饲养层细胞就可留在所述半透膜的下方，其培养液可以通过出液口进入下一步的待培养细 胞灌流槽中。如果所述饲养层细胞灌流槽内设置有细胞培养板，而所述半透膜设置在所述细胞 培养板的下方，所述饲养层细胞灌流槽的进液口和出液口设置在所述半透膜的下方。这样 饲养层细胞就可留在所述半透膜的上方，其培养液可以通过出液口进入下一步的待培养细 胞灌流槽中。在另一种实施方式中，上述过滤装置可以为孔径大小能阻止饲养层细胞穿过但能 实现液体通过的半透膜，并且该半透膜设置在所述连通管内的；在又一实施方式中，该半透 膜可设置在所述饲养层细胞灌流槽的出液口处。当然，该半透膜也可设置在所述代培养细胞灌流槽的进液口。上述灌流瓶与废液瓶的瓶盖上均可设有穿过所述瓶盖的气体滤头。这样可以使得 罐流瓶以及废液瓶内的压强与外界相同，并且可以隔绝外界空其中的细菌污染。上述灌流瓶的瓶盖上可设有穿过所述瓶盖的pH计。pH计的测量端与灌流瓶内培 养基接触，这样可实时监控灌流瓶内培养基的PH变化情况。上述灌流瓶与所述饲养层细胞灌流槽的进液口之间的管道上设置一个蠕动泵；所 述待培养细胞灌流槽和废液瓶之间的管道上设置一个蠕动泵。这样控制培养基液体在微灌 流装置中的流速以适应细胞的营养需求，可控制液体的流速是0. 02-0. 45ml/h。在一实施例中中，上述待培养细胞灌流槽的底部可设有一层基质如明胶或 Matrigel基质，有利于细胞贴壁生长。在另一实施例中，上述待培养细胞灌流槽内可设置有细胞培养板。该细胞培养板 可以是现有技术中的细胞培养板。上述待培养细胞具体可以是指胚胎干细胞。本实用新型在使用时，把用于干细胞培养的培养基装于灌流瓶1中，灌流瓶1通过 装设在其上端的气体滤头2与外界空气相通，灌流瓶1中的pH计3对瓶中培养基的pH进 行实时监控；灌流瓶1中的培养基通过蠕动泵5流经输入管4输送到饲养层细胞培养反应 器6内，为饲养层细胞提供营养，胚胎干细胞接种于待培养细胞罐流槽9中，饲养层细胞分 泌的因子和培养液组成条件培养基通过连通管8被传送到待培养细胞罐流槽9中供干细胞 生长，干细胞生长使用后的培养基通过输出管13输送到废液瓶12中收集。本实用新型的灌流装置，不仅可以满足干细胞克隆的独立培养环境，而且可以保 证干细胞纯度，避免参杂饲养层细胞影响干细胞应用，再者可通过液体流动及时排除细胞 代谢毒物，更好的模拟体内环境，防止细胞代谢物堆积导致的细胞分化，促进干细胞生长。 同时本实用新型也可用于干细胞分化研究，饲养层细胞灌流槽内如培养目的分化细胞，其 所释放的相关因子可通过灌流装置流入待培养的干细胞灌流槽，影响干细胞分化。本实用新型又由于其操作相对简便，可重复性强，较传统模式减少了较多的操作环节，降低了污染和饲养层细胞参杂的机会，利于干细胞生长，为干细胞的大规模培养提供 参考价值。
图1为本实用新型实施例1的结构示意图。图号说明1灌流瓶，2、11气体滤头，3pH计，4输入管，5、10蠕动泵，6饲养层细胞 培养反应器，7嵌入式过滤膜，8连通管，9待培养细胞灌流槽，12废液瓶，13输出管，14饲养 层细胞灌流槽。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本实用新型作进一步说明，但本实用新型并不限于以下实 施例。实施例1如图1所示，一种用于细胞培养的微灌流装置，包括灌流瓶1和废液瓶12。灌流瓶 1的瓶盖与废液瓶12的瓶盖上分别设有穿过各自瓶盖的气体滤头2和11，这样可以使得罐 流瓶1以及废液瓶12内的压强与外界相同，并且可以隔绝外界空其中的细菌污染。灌流瓶 1上还设有穿过灌流瓶的瓶盖的PH计3，pH计3的测量端与灌流瓶内培养基接触，这样可 实时监控灌流瓶内培养基的PH变化情况。如图1所示，本发明提供的灌流装置还包括饲养层细胞培养反应器6和待培养细 胞灌流槽9。饲养层细胞培养反应器6包括饲养层细胞灌流槽14以及连通管8。饲养层细 胞灌流槽14的两端分别设有出液口和进液口。饲养层细胞灌流槽14内部设有细胞培养板。该进液口与灌流瓶1之间通过输入管4连通，这样既可将灌流瓶1与饲养层细胞 培养反应器6相连通；该出液口与连通管8相连通。该连通管8与待培养细胞灌流槽9是 相连通的。待培养细胞灌流槽9与所述废液瓶12之间通过输出管13相连通。本发明的优点是饲养层细胞和待培养细胞是分开培养的。饲养层细胞培养反应器 6内设置有能阻止饲养层细胞进入待培养细胞灌流槽9的过滤装置。这样饲养层细胞分泌 的细胞因子等都可以随同培养液一起进入待培养细胞灌流槽9中，同时又可以阻止饲养层 细胞和其它杂细胞进入待培养细胞灌流槽9中。该过滤装置具体可以孔径大小能阻止饲养层细胞穿过但能实现液体通过的半透膜。该半透膜是设置在饲养层细胞培养反应器6的饲养层细胞灌流槽14内的嵌入式 过滤膜7。如果嵌入式过滤膜7设置在饲养层细胞灌流槽14内细胞培养孔板的上方，饲养 层细胞灌流槽14的进液口和出液口应该设置在嵌入式过滤膜7的上方。这样饲养层细胞 就可以被阻挡在嵌入式过滤膜7的下方，其培养液可以通过出液口进入下一步的待培养细 胞灌流槽9中；如果嵌入式过滤膜7设置在饲养层细胞灌流槽14内细胞培养孔板的下方， 饲养层细胞灌流槽14的进液口和出液口应该设置在嵌入式过滤膜7的下方。这样饲养层 细胞就可以被阻挡在嵌入式过滤膜7的上方，其培养液可以通过出液口进入下一步的待培 养细胞灌流槽9中。在本实施例中，优选是将带有饲养层细胞的细胞培养孔板置于嵌入式 过滤膜7的下方培养。[0033]当然，在另一实施例中，该过滤装置具体还可以是设置在饲养层细胞培养反应器 6的连通管8内的半透膜，该半透膜的孔径大小也能阻止饲养层细胞穿过但能实现液体通 过。如果本发明提供的微灌流装置是培养胚胎干细胞的，那么待培养细胞灌流槽9内 装的就是胚胎干细胞。待培养细胞灌流槽9内可铺有Matrigel基质(一种从小鼠肿瘤细 胞中提取出的凝胶，包含细胞外基质ECMs，为干细胞生长提供支架)，也可设置一个现有技 术中的细胞培养板。在本实施例中，为了更好地实现细胞贴壁，在待培养细胞灌流槽9内铺 的是Matrigel基质。为了控制培养基液体在灌流装置中的流速以适应细胞的营养需求，可在输入管4 和输出管13上分别设置蠕动泵5和10，可控制液体的流速是0. 02-0. 45ml/h。本实用新型在使用时，把用于细胞培养的培养基装于灌流瓶1中，灌流瓶1通过装 设在其上端的气体滤头2与外界空气相通，灌流瓶1中的pH计3对瓶中培养基的pH进行 实时监控；灌流瓶1中的培养基通过蠕动泵5流经输入管4输送到饲养层细胞培养反应器 6内，为饲养层细胞提供营养，胚胎干细胞接种于待培养细胞罐流槽9中，饲养层细胞分泌 的因子和培养液组成条件培养基通过连通管8被传送到待培养细胞罐流槽9中供干细胞生 长，干细胞生长使用后的培养基通过输出管13输送到废液瓶12中收集。以上所述之实施方式为本实用新型的实施案例之一，并非以此限制本实用新型的 实施范围，故凡依本实用新型之形状、构造及原理所做的等效变化，均应涵盖在本实用新型 的保护范围内。
权利要求用于干细胞培养的灌流装置，包括灌流瓶和废液瓶，其特征在于所述灌流装置还包括饲养层细胞培养反应器以及待培养细胞灌流槽；所述饲养层细胞培养反应器包括带有进液口和出液口的饲养层细胞灌流槽和与所述出液口相连通的连通管；所述连通管与所述待培养细胞灌流槽相连通，所述灌流瓶与所述饲养层细胞灌流槽的进液口之间以及所述待培养细胞灌流槽与所述废液瓶之间均通过管道相连通；所述饲养层细胞培养反应器内设置有能阻止饲养层细胞进入待培养细胞灌流槽的过滤装置。
2.根据权利要求1所述的灌流装置，其特征在于所述过滤装置为孔径大小能阻止饲 养层细胞穿过但能实现液体通过的半透膜，所述半透膜设置在所述饲养层细胞灌流槽内。
3.根据权利要求2所述的灌流装置，其特征在于所述饲养层细胞灌流槽内设置有细 胞培养板，所述半透膜设置在所述细胞培养板的上方，所述饲养层细胞灌流槽的进液口和 出液口设置在所述半透膜的上方。
4.根据权利要求2所述的灌流装置，其特征在于所述饲养层细胞灌流槽内设置有细 胞培养板，所述半透膜设置在所述细胞培养板的下方，所述饲养层细胞灌流槽的进液口和 出液口设置在所述半透膜的下方。
5.根据权利要求1所述的灌流装置，其特征在于所述过滤装置为孔径大小能阻止饲 养层细胞穿过但能实现液体通过的半透膜；所述半透膜设置在所述连通管内的。
6.根据权利要求2-5中任一所述的灌流装置，其特征在于所述灌流瓶与废液瓶的瓶 盖上均设有穿过所述瓶盖的气体滤头。
7.根据权利要求6所述的灌流装置，其特征在于所述灌流瓶的瓶盖上设有穿过所述 瓶盖的PH计。
8.根据权利要求7所述的灌流装置，其特征在于所述灌流瓶与所述饲养层细胞灌流 槽的进液口之间的管道上设置一个蠕动泵；所述待培养细胞灌流槽和废液瓶之间的管道上 设置一个蠕动泵。
9.根据权利要求8所述的灌流装置，其特征在于所述待培养细胞灌流槽的底部铺设有一层基质。
10.根据权利要求8所述的灌流装置，其特征在于所述待培养细胞灌流槽内设置有细 胞培养板。
专利摘要本实用新型公开了一种用于干细胞培养的灌流装置。该灌流装置包括灌流瓶和废液瓶，还包括饲养层细胞培养反应器以及待培养细胞灌流槽；所述饲养层细胞培养反应器包括带有进液口和出液口的饲养层细胞灌流槽和与所述出液口相连通的连通管；所述连通管与所述待培养细胞灌流槽相连通，所述灌流瓶与所述饲养层细胞灌流槽的进液口之间以及所述待培养细胞灌流槽与所述废液瓶之间均通过管道相连通；所述饲养层细胞培养反应器内设置有能阻止饲养层细胞进入待培养细胞灌流槽的过滤装置。本实用新型既可满足干细胞的独立培养环境，以保证干细胞纯度，又避免参杂饲养层细胞影响，较传统模式减少了较多的操作环节，降低了污染和饲养层细胞参杂的机会。
文档编号C12M3/06GK201626960SQ2010201069
公开日2010年11月10日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者李奎, 牟玉莲, 王皓, 石放雄, 齐念民 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所;上海博因生物技术有限公司