酿酒酵母菌株及用其制备青梅果酒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了青梅果酒发酵专用菌株QM5236，于2013年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?No.8485。以及青梅果酒及其制备方法，以酿酒酵母菌株QM5236为生产菌种，以青梅果浆为原料，经青梅果浆的制备与处理、前发酵、后发酵、陈酿、过滤、密封、杀菌工艺而获得。本技术方案的酿酒酵母菌株QM5236适宜青梅果浆发酵体系，所产果酒特色风味突出、感官品质优良。
【专利说明】酿酒酵母菌株及用其制备青梅果酒
【技术领域】
[0001]本发明属于酿造食品加工【技术领域】，涉及以青梅为原料，经发酵及后处理制作成青梅果酒的方法，尤其涉及一种酿酒酵母菌株及用其制备青梅果酒。
【背景技术】
[0002]青梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)属蔷薇科李属，另I」名酸梅、干枝梅,在中国已有3000多年的栽培历史，《诗经》、《尔雅》等古书均有关于梅的记载，是我国亚热带地区名优特产，以清冽酸爽的口味独树一帜。青梅是传统药食两用的水果，富含膳食纤维、有机酸、氨基酸、还原糖、多酚物质、维生素、矿物质等多种营养成分，其柠檬酸含量居水果之首，必需氨基酸含量也较为丰富，具有生津止渴、调节肠胃、消除疲劳、调节血压、抗过敏、保护肝脏、美容、提高免疫力、预防癌症、预防结石、镇痛等16大功效，是自然界最优秀的碱性食品之一 O
[0003]青梅果实清香宜人，但其有机酸含量高达3.0%-7.0%之间，糖度仅为1.0%左右，糖酸比为0.2-0.3左右，比柠檬还要低，生食口感非常酸涩，不易鲜食，需经加工后方可食用，最早的青梅制品是乌梅与腌梅干，其次是话梅，这些梅制品具有一定的保健功效，在中国历史上发挥了重要作用，曾经治愈过很多的疾病，并成功地用于抵御霍乱等疾病，还可以作为消渴剂、消食剂应用。随着生活水平的提高和人类健康意识的增强，食品消费呈现出多样化和高档化的趋势，消费者更加注重食品安全，营养、保健功能成为决定消费者购买意愿的关键因素。传统的青梅蜜饯类干制产品需经过盐腌、漂洗、糖溃等多步操作，许多有益健康的成份已流失，已不符合目前的健康饮食观念，难以满足消费者的需求。
[0004]近年来，青梅果酒作为一种营养保健食品受到越来越多消费者的欢迎，成为青梅加工的发展趋势。青梅果酒在中国有悠久的历史，在台湾地区、日本、东南亚等国也很受欢迎。据《三国志》记载:建`安5年，刘备“学圃于许田，以为韬晦之计”，曹操以青梅煮酒相邀刘备共论天下英雄，“青梅煮酒论英雄”的典故及青梅酒由此见于史书。青梅果酒有浸泡法和发酵法两种工艺，浸泡法是采用白酒、米酒或者黄酒来浸泡新鲜青梅果，在广东、浙江、江苏的部分地区流行，日本、韩国的部分青梅酒也属于这一类型，以俏雅青梅酒和池田梅酒作为典型代表，浸泡酒的特点是设备与工艺简单，生产投资少，对从业人员的技术要求不高，但青梅的保健功效发挥不充分，且口味稍欠醇厚；发酵法是以青梅整果或者果汁果浆为原料进行酒精发酵，能够使青梅果实的有效成分得到更大的发挥，但对设备及从业人员的技术要求相对较高,产品的成本也较高。
[0005]发酵青梅果酒的生产条件温和，能够尽量保留原料的风味和营养成分，微生物发酵还能使梅果中的大分子分解成小分子，很多生食不能吸收的营养可以通过梅酒得到很好的利用，其有效成分也能得到更大的发挥；另一方面，微生物的代谢产物又赋予产品新的营养成分，特别是维生素等微量元素大大增加，使其功效更强，香味、口味也更醇厚，其保健功能也有所增强。将青梅发酵酿制成青梅酒，不但不与粮食争地，而且节约酿酒粮食，挖掘青梅的潜在附加值，既可以增加我国酒类的花色品种，为国家和企业创造经济效益，又可以促进林果业发展，改善生态环境。高品质发酵梅酒的研制对青梅产业可持续发展有着重要意义，是青梅加工行业的发展趋势。
[0006]虽然我国对青梅发酵酒已经进行了部分研究，如郭正忠等以广东云浮优质成熟青梅为原料，对十二岭梅酒发酵工艺进行研究，以正交实验及感官品评确定最佳生产工艺，最后经调配、澄清、冷冻、除菌过滤包装后，得到浅黄色梅酒。李阿娜等以安徽宣城长农17青梅为原料，以出酒率、总黄酮含量为考查指标，确定适宜的发酵工艺参数，提高青梅酒黄酮类化合物的保存。陈卫平等对全汁干青梅酒进行了研制，采用打浆机冷破碎榨汁，发酵前用K2C4H4O6与CaCO3混合降酸至0.6%_0.8%，发酵后采用115°C高温瞬时热处理，用琼脂做澄清剂，可以有效地提高全汁干青梅的品质。黄星源等通过皂土和壳聚糖两种澄清剂对青梅发酵酒进行澄清，经过综合感官评比分析，得出了最佳澄清剂及最优工艺条件。但目前我国对于青梅果酒的研究主要集中在工艺优化、发酵后调配、降酸、澄清、质量控制等方面，对于青梅果酒发酵专用菌株的研究相当少，大多直接应用葡萄酒酵母或者对其驯化后使用，青梅果实富含柠檬酸、苹果酸等有机酸，酸度高者达30g/L以上，虽然葡萄酒酵母比其他酵母更适应青梅果汁体系，但也只能耐受10g/L左右的酸度，发酵情况并不理想，产品的特色风味不突出，口感也有待提高。
【发明内容】
[0007]为了解决上述的技术问题，本发明的目的是，针对目前青梅果酒生产中缺乏适宜的发酵菌株和风味欠佳的情况，筛选提出一株适宜青梅果浆发酵体系、所产果酒特色风味突出、感官品质优良的青梅果酒发酵专用菌株；本发明的另一目的是提出与该新菌株相配套的液体深层发酵工艺制备青梅果酒的方法。
[0008]为了达到上述的目的， 本发明采用了以下的技术方案:
[0009]用于生产青梅果酒新菌株的选育、鉴定及其生物学特性的研究:
[0010]1、初筛:
[0011]挑选无机械伤、无病虫害、嗅闻略有酒味的过熟青梅果实，无菌条件下切块，称取25g样品加入三角瓶(预灭菌，装有25g玻璃珠与225mL浓度为0.85%的无菌生理盐水)，摇床震荡2h，再以无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，分别取10_5、10' IO-7稀释液涂布于PDA培养基上，30°C好氧培养72h，取菌落形成单位在30-100之间的培养皿，按50%比例挑取典型菌落划线分离；所得纯菌落进行TTC (氯化三苯基四氮唑)显色实验，挑选红色菌落，进行镜检，选择具备酵母形态的菌株；
[0012]2、复筛:
[0013]复筛:初筛得到158株菌落典型、TTC显色为红色的菌株，接入梅汁培养基中进行CO2失重实验，选择15d失重率4%以上菌株，进行传代稳定性及发酵风味研究；经过反复失重实验、获得9株失重较快、发酵风味较好、性能稳定的菌株，分别标记为QM2524、QM2518、QM258、QM235、QM247、QM213、QM5236、QM2410 与 QM2515 ；
[0014]对9菌株进行酒精转化率、糖耐受性、耐受性分析，并将其发酵所产青梅果酒经杀菌、陈酿后对其气味、口感、色泽、澄清度四个方面进行感官分析，发现QM5236菌株能够在糖度350g/L、二氧化硫浓度200ppm的梅汁培养基中正常发酵，发酵所得青梅果酒质量最优，在气味、口感、澄清度方面皆胜于其他菌株，综合考虑各项实验结果，选择QM5236作为青梅果酒的酿造菌株；
[0015]青梅果汁的制备:选择无机械伤、无病虫害的九成熟青梅果实(黄红色，肉质软)，清水漂洗干净，浙去水份去核打浆，所得果浆添加适量果胶酶与纤维素酶，恒温酶解后经200目滤布过滤后得青梅果汁。
[0016]PDA培养基:购买于上海盛思生化科技有限公司，按比例溶化，121°C灭菌15min。
[0017]TTC上层培养基:葡萄糖5g/L，琼脂5g/L，15°C灭菌20min，冷却至50°C~60°C左右时，加入0.5g/L TTC摇匀，立即倾倒与培养皿中下层培养基上(下层为PDA固体培养基)
[0018]梅汁培养基:青梅果汁200g/L，葡萄糖250g/L、酵母粉5g/L，pH值为4.5，121°C灭菌 15min ；
[0019]3、QM5236菌株的生物学特征鉴定:
[0020]形态学特征:菌株QM5236在PDA培养基上生长状况良好，30°C有氧培养48h即可形成明显菌落，菌落直径在1-5.0mm之间，规则圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面较湿润，不产生色素；镜检呈椭圆形，一端出芽，单个或者成对或成链存在；
[0021]生理生化实验:挑取菌株接入VITEK2YST鉴定卡(主要为糖类、有机酸、氨基酸同化实验等)，经VITEK2C0MPACT梅里埃全自动菌种鉴定仪运行96h，鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),概率为 98%。
[0022]基因序列分析:菌株QM5236的18S rDNA序列长度为464bp,与Saccharomycescerevisiae strain D3C、 Saccharomyces cerevisiae strain B1MA、 Saccharomycescerevisiae strain N`42.2.2等菌株的部分18S rDNA核苷酸序列同源性达到99%。
[0023]鉴定结果:将菌株QM5236的形态学特征对照相关的真菌鉴定学手册，结合该菌株的生理生化实验及其18S rDNA序列分析结果，确定菌株QM5236为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),将其命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae QM5236。
[0024]酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae QM5236 (以下称 S.cerevisiae QM5236),于2013年11月19日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8485。
[0025]一种青梅果酒，以酿酒酵母菌株(S.cerevisiae) QM5236为生产菌种，以青梅果浆为原料，经青梅果浆的制备与处理、前发酵、后发酵、陈酿、过滤、密封、杀菌工艺而获得。
[0026]一种青梅果酒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0027](I)青梅果浆的制备与处理:选择九成熟青梅果实，清水漂洗干净，浙去水分去核打浆，所得果浆添加300~1500U/mL果胶酶和250~1000U/mL纤维素酶，45 °C恒温酶解3h,经200目滤布过滤后取滤液，以水稀释2~8倍,添加鹿糖至160~350g/L,以0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至4.0~5.5，制得果浆处理液备用；
[0028](2)青梅果酒的前发酵:将酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)QM5236接种于梅汁培养基中，培养48h后，按照3~15mL/L的接种量接入步骤(1)果浆处理液中，进行液体深层发酵，在20~30°C下，培养3~15d至液面无明显气泡溢出时候，去下层沉淀，将上层澄清的发酵液转移至无菌容器中；
[0029](3)青梅果酒的后发酵:步骤(2)中转移好的发酵液按液体深层发酵方式进行分批发酵，于20~30°C下保温7~25d，至发酵液糖度无明显变化时候，再次去下层沉淀，将上层澄清的发酵液转移至无菌容器中，得青梅原果酒；[0030](4)青梅果酒的陈酿:将步骤(3)的青梅原果酒密封，置于10~20°C、避光处陈酿30~60d ;精滤后，经65~75°C灭菌20~30min后灌装、封口，即成青梅果酒。
[0031]作为优选，所述梅汁培养基为:青梅果汁200g/L，葡萄糖250g/L，酵母粉5g/L，pH值为4.5，121°C灭菌15min ;所述青梅果汁的制备:选择无机械伤、无病虫害的九成熟青梅果实，清水漂洗干净，浙去水份去核打浆，所得果浆添加果胶酶与纤维素酶，450C恒温酶解后经200目滤布过滤后得青梅果汁。
[0032]本发明由于采用了以上的技术方案，具有下述有益效果:
[0033](I)从青梅果实表面筛选到的酿酒酵母S.cerevisiae QM5236菌株能够适应酸度较高的青梅果汁体系，25°C时能够在7d左右完成前发酵，所得产品能够保留并丰富青梅果汁的营养成分，体现并充满青梅鲜果的特征香气。
[0034](2)采用液体深层发酵方式生产青梅果酒，对发酵设备要求较宽泛，有条件的工厂可以使用发酵罐进行发酵，条件一般的单位可以普通的不锈钢罐或者陶瓷罐进行保温发酵，均可在I个月内完成发酵过程，对劳动力要求不高。
[0035](3)所得的青梅果酒质地澄清透明，色泽为柔和的淡黄色，带有青梅鲜果的特征香气，果香与酒香和谐统一，入口清爽柔和，其酒精度在15度左右，酸味与酒度适宜，有鲜明的青梅果酒特点，产品清洁卫生，细菌总数=100个/mL，大肠菌群=3个/IOOmL,致病菌未检出。
【具体实施方式】
[0036]下面对本发明的【具体实施方式】做一个详细的说明。
[0037]对以下实施例所涉材料的说明:
[0038]果胶酶与纤维素酶均为宁夏和氏璧生物技术有限公司产品，果胶酶酶活≤500, 000U/g,纤维素酶酶活> 1，000, 000U/g,产品符合中华人民共和国行业标准QB1805.1-93对食用酶制剂的卫生要求。
[0039]实施例1:(青梅果酒制备I)
[0040](I)青梅果浆的制备与处理:选择九成熟(黄红色，肉质软)青梅果实，清水漂洗干净，浙去水分去核打浆，所得果浆添加300U/mL果胶酶和1000U/mL纤维素酶，45°C恒温酶解3h，经200目滤布过滤后取滤液，以水稀释8倍，添加蔗糖至350g/L，调节pH值至5.5，备用；
[0041](2)青梅果酒的前发酵:将S.cerevisiae QM5236接种于梅汁培养基中，培养48h后，按照3mL/L的接种量接入步骤(1)果浆处理液中，进行液体深层发酵，在20°C下，培养15d至液面无明显气泡溢出时，将上层澄清的发酵液转移至无菌容器中；
[0042](3)青梅果酒的后发酵:步骤(2)中转移好的发酵液按深层发酵方式进行分批发酵，于20°C发酵25d，至发酵液糖度无明显变化时候，再次去下层沉淀，将上层澄清的发酵液转移至无菌容器中，得青梅原果酒；
[0043](4)青梅果酒的陈酿:将步骤(3)的青梅原果酒密封，置于10°C、避光处陈酿60d ；精滤后，经75°C灭菌20min后灌装、封口，即成青梅果酒。
[0044]实施例2:(青梅果酒制备2)
[0045]本例，步骤(1)中青梅果浆添加1500U/mL果胶酶和250U/mL纤维素酶，酶解过滤后取滤液，以水稀释2倍，添加蔗糖至160g/L，调节pH值至4.5，备用；步骤(2)中将
S.cerevisiae QM5236在梅汁培养基中活化好后，按15mL/L的接种量接种，在30°C下培养3d至液面无明显气泡溢出时，转移上层清液；步骤(3)转移好的发酵液置于30°C下，发酵7d，至发酵液糖度无明显变化时，再次转移上清液；步骤(4)中将步骤(3)青梅原果酒密封，在20°C，避光阴凉处陈酿30d，经65°C灭菌30min后灌装、封口，即成青梅果酒。其他与实施例I相同。
[0046]实施例3:(青梅果酒制备3)
[0047]本例，步骤(1)中青梅果浆添加750U/mL果胶酶和500U/mL纤维素酶，酶解过滤后取滤液，以水稀释4倍，添加蔗糖至280g/L，调节pH值至5.0，备用；步骤(2)中将
S.cerevisiae QM5236在梅汁培养基中活化好后，按7mL/L的接种量接种，在25°C下培养7d至液面无明显气泡溢出时，转移上层清液；步骤(3)转移好的发酵液置于25°C下，发酵10d，至发酵液糖度无明显变化时，再次转移上清液；步骤(4)中将步骤(3)青梅原果酒密封，在15°C，避光阴凉处陈酿45d，经70°C灭菌25min后灌装、封口，即成青梅果酒。其他与实施例1相同。
[0048]实施例4:
[0049]本例，步骤(1)中青梅果浆添加1000U/mL果胶酶和750U/mL纤维素酶，酶解过滤后取滤液，以水稀释3倍，添加蔗糖至250g/L，调节pH值至4.5，备用；步骤(2)中将
S.cerevisiae QM5236在梅汁培养基中活化好后，按5mL/L的接种量接种，在27°C下培养6d至液面无明显气泡溢出时，转移上层清液；步骤(3)转移好的发酵液置于26°C下，发酵10d，至发酵液糖度无明显变化时，再次转移上清液；步骤(4)中将步骤(3)青梅原果酒密封，在12°C避光阴凉处陈酿50d，经70°C灭菌25min后灌装、封口，即成青梅果酒。其他与实施例1相同。
[0050]实施例5:
[0051]本例，步骤(1)中青梅果浆添加650U/mL果胶酶和650U/mL纤维素酶，酶解过滤后取滤液，以水稀释6倍，添加蔗糖至300g/L，调节pH值至5.0，备用；步骤(2)中
S.cerevisiae QM5236在梅汁培养基中活化好后，按10mL/L的接种量接种，在28°C下培养5d至液面无明显气泡溢出时，转移上层清液；步骤(3)转移好的发酵液置于28°C下，发酵7d，至发酵液糖度无明显变化时，再次转移上清液；步骤(4)中将步骤(3)青梅原果酒密封，在18°C，避光阴凉处陈酿45d，经75°C灭菌20min后灌装、封口，即成青梅果酒。其他与实施例I相同。
[0052]实施例6:
[0053]本例，步骤(1)中青梅果浆添加1250U/mL果胶酶和350U/mL纤维素酶，酶解过滤后取滤液，以水稀释7倍，添加蔗糖至320g/L，调节pH值至5.2，备用；步骤(2)中
S.cerevisiae QM5236在梅汁培养基中活化好后，按8mL/L的接种量接种，在22°C下培养12d至液面无明显气泡溢出时，转移上层清液；步骤(3)转移好的发酵液置于22°C下，发酵12d，至发酵液糖度无明显变化时，再次转移上清液；步骤(4)中将步骤(3)青梅原果酒密封，在16°C，避光阴凉处陈酿48d，经65°C灭菌30min后灌装、封口，即成青梅果酒。其他与实施例1相同。
[0054]试验例:不同 菌种发酵生产青梅果酒的感官分析[0055]产品1:以安琪酵母有限公司所产的葡萄酒酵母为菌种生产的青梅果酒；
[0056]产品2:以安琪酵母有限公司的果酒酵母为菌种生产的青梅果酒；
[0057]产品3:以安琪酵母有限公司的酿酒高活性干酵母为菌种生产的青梅果酒；
[0058]产品4:以广西丹宝利酵母有限公司的常温酒酵母为菌种生产的青梅果酒；
[0059]产品5:以S.cerevisiae QM5236为发酵菌种生产青梅果酒。
[0060]挑选接受过感官检验训练的食品专业人士 10位组成评定小组，对以5株不同菌种发酵所得青梅果酒的色泽、澄清度、气味以及口感进行打分，满分为25分，取算术平均值，总分满分100分。
[0061]表1感官评分标准
[0062]
【权利要求】
1.一种酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)QM5236，于2013年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8485。
2.一种青梅果酒，以酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)QM5236为生产菌种，以青梅果浆为原料，经青梅果浆的制备与处理、前发酵、后发酵、陈酿、过滤、密封、杀菌工艺而获得。
3.—种青梅果酒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)青梅果浆的制备与处理:选择九成熟青梅果实，清水漂洗干净，浙去水分去核打浆，所得果浆添加300~1500U/mL果胶酶和250~1000U/mL纤维素酶，45°C恒温酶解3小时，经200目滤布过滤后取滤液，以水稀释2~8倍，添加蔗糖至160~350g/L，以0.lmol/L的NaOH溶液调节pH值至4.0~5.5，制得果浆处理液备用； (2)青梅果酒的前发酵:将酿酒酵母菌株(S.cerevisiae) QM5236接种于梅汁培养基中，培养48小时后，按照3~15mL/L的接种量接入步骤(1)果浆处理液中，进行液体深层发酵，在20~30°C下，培养3~15d至液面无明显气泡溢出时候，去下层沉淀，将上层澄清的发酵液转移至无菌容器中； (3)青梅果酒的后发酵:步骤(2)中转移好的发酵液按液体深层发酵方式进行分批发酵，于20~30°C下保温7~25d，至发酵液糖度无明显变化时候，再次去下层沉淀，将上层澄清的发酵液转移至无菌容器中，得青梅原果酒； (4)青梅果酒的陈酿:将步骤(3)的青梅原果酒密封，置于10~20°C、避光处陈酿30~60d ;精滤后，经65~75°C灭菌20~30min后灌装、封口，即成青梅果酒。
4.根据权利要求3所述的一种青梅果酒的制备方法，其特征在于，所述梅汁培养基为:青梅果汁200g/L，葡萄糖250g/L，酵母粉5g/L，pH值为4.5，121°C灭菌15分钟；所述青梅果汁的制备:选择无机械伤、无病虫害的九成熟青梅果实，清水漂洗干净，浙去水份去核打浆，所得果浆添加果胶酶与纤维素酶`，45°C恒温酶解后经200目滤布过滤后得青梅果汁。
【文档编号】C12N1/18GK103773702SQ201410025273
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】杨颖 , 陆胜民, 邢建荣, 夏其乐, 陈剑兵, 张俊 申请人:浙江省农业科学院