一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种微生物的筛选方法【技术领域】，具体涉及一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法。其根据七叶灵(6,7-二羟基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原(6,7-二羟基-香豆素)，七叶苷原能和Fe3+作用呈现棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选，同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，所述的筛选方法包括以下操作步骤：(1)培养基的配制；(2)非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；(3)单菌落的活化；(4)在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；(5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。
【专利说明】一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法
[0001] 一、【技术领域】： 本发明涉及一种微生物的筛选方法【技术领域】，具体涉及一种高产β -葡萄糖苷酶酵母 菌株的筛选方法。
[0002] 二、【背景技术】： β-葡萄糖苷酶（EC3. 2. 1. 21)，其英文名是β-glucosidas，是纤维素分解酶系中 重要组成成分之一，属于水解酶类，它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷 键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖和 β-D-木糖苷。β-葡萄糖苷酶的应用非常广泛，被用来增香、分解纤维质产酒精、改善发酵 制品的风味等方面。β_葡萄糖苷酶在很多行业内广泛应用，具有巨大的商业价值。特别 是对于葡萄酒的增香作用更是显著。现今用于酿酒的绝大多数欧亚种（Vitis vinifera) 葡萄栽培品种的成熟果实闻起来没有明显的特征香气，但是所酿酒都有各品种独特的香气 特征。原因是大多数酿酒葡萄品种果实含有的是香气成分的糖苷结合体，人体嗅觉器官无 法感知这些不挥发的香气成分糖苷，酿酒过程促进这些香气前体物质的释放水解，挥发出 游离香气成分。葡萄酒香气糖苷是香气成分的预备库。比它们对应的游离态成分多好几倍， 甚至几十倍。葡萄果粒和酿酒酵母是酿造过程中酶促反应主要酶的来源，但是典型的葡萄 酒生产条件，高含糖量高酒精度低PH值和高浓度多酚物质等，限制了葡萄与酿酒酵母中糖 苷酶的活性。所以，从自然界中直接筛选在葡萄酒酿造环境中仍有高效酶活力的β-葡萄 糖苷酶的酵母菌株，成为得到高产β-葡萄糖苷酶菌株最直接的方法。
[0003] 由于产酶微生物种类丰富，数量巨大，所以通过定量测定β_葡萄糖苷酶活性来 筛选高产β-葡萄糖苷酶的菌株工作量巨大。现在研究开发了几种能定性分析或鉴定 β -葡萄糖苷酶的显色技术，然后在此基础上进行定量分析，就会大大减少工作量，提高筛 选效率。普遍采用的传统初筛方法主要有以下几种：①在聚丙烯酰胺凝胶电泳染色时， 将凝胶保温在对-硝基苯基-β -D-葡萄糖苷溶液中，会在β -葡萄糖苷酶的位置处出现 由硝基酚引起的绿色条带。但其准确性不够，而且由于硝基酚具有较高的扩散性，其条带 会很快逐渐消失。②Rissler利用6-溴-2-萘基β-D-葡萄糖苷为电泳凝胶的保温溶液 并以重盐为作用试剂，酶的降解产物溴萘酚在重盐的作用下形成红色沉淀。由于重盐的感 光性，该技术对操作过程要求苛刻。③使用4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷作为底物，经 β -葡萄糖苷酶作用后分解为4-甲基伞形酮，利用4-甲基伞形酮具有强烈荧光的特点进 行检测，因而需要紫外光才能观察，该技术操作复杂。④以对硝基苯-β -葡萄糖苷作为底 物，经β -葡萄糖苷酶作用后分解为对硝基苯酚，然后加入碳酸钠进行显色反应，产酶的菌 株会呈现亮黄色。该方法灵敏度高，快速，但成本昂贵，而且透明圈和培养基的颜色相似因 此不便于分辨。上述方法同时只能处理筛选一株菌株，所以筛选产糖苷酶菌株工作量巨大。
[0004] 三、
【发明内容】
： 本发明为了解决上述【背景技术】中的不足之处，提供一种高产β_葡萄糖苷酶酵母菌株 的筛选方法，其根据七叶灵（6, 7-二羟基-香豆素 -β -D-葡萄糖苷）在β -葡萄糖苷酶 的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原（6, 7-二羟基-香豆素），七叶苷原能和Fe3+作用呈现 棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选， 同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株 的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法包括以下操作步骤：（1)培养基的配制；（2)非 酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；(3)单菌落的活化；(4)在96孔板中添加培养基和活化后 的单菌落；（5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。
[0006] 所述的步骤（1)培养基的配制：将重量百分比为0. 3%的七叶苷，重量百分比为 0. 05%的柠檬酸铁，重量百分比为0. 2%的NaCl，重量百分比为0. 05%的MgS04. 7Η20,重量百 分比为0. 1%的ΚΗ2Ρ04和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121°C灭菌20min，得培养 基； 所述的步骤（2)非酿酒酵母菌的纯化：将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养 5天，得单菌落； 所述的步骤（3)单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不 同，分别挑取不同的单菌落，在添加 Yro液体培养基的试管中活化，每只试管添加 YH)液体 培养基5mL，活化两天； 所述的步骤（4)在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落：在96孔板中，每孔添加 250 μ 1培养基；再添加经活化后的单菌落15 μ 1，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为 对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号； 所述的步骤（5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株：培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑 色单菌落，得胶红酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、 武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO :Μ2013660 ;分类命 名：胶红酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜璞毕赤酵母(保藏单位 名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年 12月13日，保藏编号：CCTCC N0:M2013659;分类命名：膜璞毕赤酵母南13 (Pichia membranifaciens南13)。），胶红酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏 单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC N0 : M2013660;分类命名：胶红酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜撲毕赤 酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保 藏日期：2013年12月13日，保藏编号：CCTCC NO :M2013659 ;分类命名：膜璞毕赤酵母南 13 (Pichia membranifaciens南13)。）均为高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株。
[0007] 所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假 丝酵母。
[0008] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下： 1、本发明利用96孔板代替传统平板进行筛选产酶菌株，能同时对大量菌株进行筛选， 降低了菌株筛选的工作量，同时通过对比颜色深浅来定性判断菌株产酶高低。
[0009] 2、本发明对96孔板进行创新性应用，96孔板原本是用于培养细胞的平板，在本发 明中用于筛选菌株，可以用很少的筛选培养基筛选大量的菌株。
[0010] 3、本发明筛选培养基的配制，可以使显色反应（棕黑色）与筛选培养基（透明色） 区别明显，所以对筛选产糖苷酶菌株较为灵敏和准确。
[0011] 四、【专利附图】
【附图说明】： 图1为本发明的显色技术流程图。
[0012] 五、【具体实施方式】： 参见图1 :本发明是将筛选培养基加入到96孔板中，然后添加活化的菌株，最终通过显 色筛选出高产糖苷酶菌株。具体实施步骤如下： 所述的步骤（1)培养基的配制：将重量百分比为〇. 3%的七叶苷，重量百分比为0. 05% 的柠檬酸铁，重量百分比为〇. 2%的NaCl，重量百分比为0. 05%的MgS04. 7H20,重量百分比为 0. 1%的ΚΗ2Ρ04和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121°C灭菌20min，得培养基； 所述的步骤（2)非酿酒酵母菌的纯化：为了避免不纯菌株带来干扰，得到较纯的单菌 落菌株，将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落； 所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵 母。
[0013] 所述的步骤（3)单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态 的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加 Yro液体培养基的试管中活化，每只试管添加 ypd 液体培养基5mL，活化两天； 所述的步骤（4)在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落：在96孔板中，每孔添加 250 μ 1培养基；再添加经活化后的单菌落15 μ 1，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为 对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号； 所述的步骤（5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株：培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑 色单菌落，得胶红酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、 武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO :Μ2013660 ;分类命 名：胶红酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜璞毕赤酵母(保藏单位 名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年 12月13日，保藏编号：CCTCC N0:M2013659 ;分类命名：膜璞毕赤酵母南13 (Pichia membranifaciens南13)。），胶红酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏 单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC N0: M2013660;分类命名：胶红酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜撲毕赤 酵母均为高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株。
[0014] 胶红酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、 武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO :Μ2013660 ;分类命名：胶红 酵母北29(Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜璞毕赤酵母(保藏单位名称：中国典 型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年12月13日，保 藏编号：CCTCC NO :M2013659 ;分类命名：膜璞毕赤酵母南 13 (Pichia membranifaciens 南13)。）是高产糖苷酶菌株，可用于混合发酵或产糖苷酶增加葡萄酒香气。经定量方法分 析：胶红酵母产酶活性为42. lU/ml X 10_3 ;膜璞毕赤酵母42. 51U/ml X 10_3。
[0015] 所述的步骤（6)定量验证高产糖苷酶菌株活性： a 提取粗酶液：将筛选的胶红酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保 藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC N0 : M2013660;分类命名：胶红酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜撲毕赤 酵母(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保 藏日期：2013年12月13日，保藏编号：CCTCC NO :M2013659 ;分类命名：膜璞毕赤酵母南 13 (Pichia membranifaciens南13)。）按10%的接种量接入到发酵培养基（300mL三角瓶 装20ml培养基，121°C灭活20min)，温度为30°C，摇床150rpm/min条件下培养72h，取出发 酵液1. 0ml于1. 5ml离心管中，8000rpm/min离心lOmin除菌，收集上清液，即为β -葡萄糖 苷酶粗酶液。
[0016] b波长选择：0. 1、0. 3、0. 5 mmol/L的对硝基苯酚溶液，分别取5ml，用分光光度计 扫描最大吸收峰波长，扫描条件：吸光度范围为〇. 00-3. 00,波长范围为390-415nm。选择最 大吸收波长。
[0017] β -葡萄糖苷酶酶活的测定：（1)对硝基苯酚标准溶液的配制称取0. 0209g对硝 基苯酚，用蒸馈水溶解，转移到l〇〇ml的容量瓶中，定容，摇勻，配制成1. 5mmol/L的对硝基 苯酌溶液。分别配制成 0· 05mmol/L，0· 1 mmol/L，0· 2 mmol/L，0· 3 mmol/L, 0. 4 mmol/L, 0.5mmol/L，0.6 mmol/L，0.7 mmol/L，0.8 mmol/L 的对硝基苯酌·溶液。
[0018] 对硝基苯酚标准曲线取10支25ml刻度管，分别加入0. 05mmol/L，0. 1 mmol/L， 0. 2 mmol/L, 0. 3mmol/L, 0. 4 mmol/L, 0. 5mmol/L, 0. 6 mmol/L, 0· 7 mmol/L, 0· 8 mmol/L对硝 基苯酚溶液0. 4ml,再加入2. 0ml 1 mmol/L的碳酸钠溶液和10ml的蒸馈水，室温放置5min 后摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在上述最大吸收波长处测定吸光值A。以吸光值为纵坐 标，对硝基苯酚的浓度为横坐标，制定标准曲线。
[0019] (2) β-葡萄糖苷酶酶活的测定相对应pH值加入750 μ L柠檬酸-磷酸氢二钠 缓冲液，加入200ul的粗酶提取液，加入250 yLl mmol/L的对硝基苯-β-葡萄糖苷（pNPG) 40°C处理60min，然后加入1.0 ml的lmol/L Na2C03终止反应。在上述最大吸收波长处测 吸光度，蒸馏水为空白对照。每个样重复两次。β-葡萄糖苷酶酶活力单位（IU)定义为 ： 40°C下lmin内催化生成1 μ mol对硝基苯酚所要的酶量。
【权利要求】
1. 一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法包括 以下操作步骤：（1)培养基的配制；（2)非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；（3)单菌落的活 化；(4)在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；（5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。
2. 根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在 于： 所述的步骤（1)培养基的配制：将重量百分比为〇. 3%的七叶苷，重量百分比为0. 05% 的柠檬酸铁，重量百分比为〇. 2%的NaCl，重量百分比为0. 05%的MgS04. 7Η20,重量百分比为 0. 1%的ΚΗ2Ρ04和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121°C灭菌20min，得培养基； 所述的步骤（2)非酿酒酵母菌的纯化：将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养 5天，得单菌落； 所述的步骤（3)单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不 同，分别挑取不同的单菌落，在添加 Yro液体培养基的试管中活化，每只试管添加 YH)液体 培养基5mL，活化两天； 所述的步骤（4)在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落：在96孔板中，每孔添加 250 μ 1培养基；再添加经活化后的单菌落15 μ 1，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为 对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号； 所述的步骤（5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株：培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑色 单菌落，得胶红酵母和膜璞毕赤酵母，胶红酵母和膜璞毕赤酵母均为高产β -葡萄糖苷酶 酵母菌株。
3. 根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于： 所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。
【文档编号】C12N1/16GK104152361SQ201410075528
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】陶永胜, 彭传涛 申请人:西北农林科技大学