一种快速检测转基因烤后烟叶的四重pcr引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR引物及方法。该方法所涉及的引物由烟草内源基因元件NR(硝酸还原酶基因)及外源基因元件(包括35S启动子、NOS终止子、NPTII筛选标记基因)组成。通过四重PCR扩增，在一次PCR反应中可同时检测NR基因及3个外源基因，检测方法包括以下步骤：四对引物稀释成等摩尔浓度后按1:1:1:1(V/V)比例混合，在20μL反应体系中添加Mg2+1.5mmol/L、dNTP125μmol/L、Taq酶1U、混合引物1μmol/L，DNA100ng，在退火温度65℃，循环数35个的PCR反应条件下，能够有效检测出烤后烟叶百分比含量为0.9％(V/V)的转基因成分。本发明的效果是：重复性强、稳定性好、操作简单、节约成本。
【专利说明】-种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因植物检测领域，特别涉及一种快速检测转基因烤后烟叶的四重 PCR引物及方法。
【背景技术】
[0002] 烟草制品作为特殊消费品，各国消费者对转基因烟草均采取"零"容忍态度，对烟 草制品的转基因检测已成为烟草国际贸易的重要壁垒，因此，对烟叶转基因成分进行检测 非常重要。
[0003] 作物转基因成分检测主要包括基于DNA检测和基于蛋白质检测的方法，其中基于 DNA的转基因检测方法应用最为广泛，该方法首先通过对某些遗传元件进行筛查，挑选出使 用频率最高的少数几个遗传元件作为检测靶标，如果检测出其中任何一个元件，表明该样 品含有转基因成分，如果未检出，则表明样品中不含有已知转基因成分。
[0004] 烤后烟叶作为一种经高温和多环节加工的生物材料，其转基因检测方法受DNA降 解程度、PCR扩增效率等多方面影响，与一般植物组织的转基因检测有很大不同。国际上对 烤后烟叶进行转基因筛查的遗传元件为35S启动子、N0S终止子和NPTII筛选标记基因。目 前国标《GB/T24310-2009烟草及烟草制品转基因检测方法》对以上三种遗传元件的PCR定 性检测为单一 PCR反应，即需要在3支PCR管内分别反应对三种靶标序列进行检测，该种方 法不仅耗时费力，而且检测成本较高。另外，也有二重PCR反应的报道，如对35S和NR二重 PCR扩增，或对NPTII和N0S二重PCR扩增，但尚无通过四重PCR反应，一次反应同时检测4 种基因（内源基因 NR，外源基因35S、N0S、NPTII)的方法。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提出一种快速检测转基因烤 后烟叶的四重PCR引物，本发明的另一个目的在于提出一种快速检测转基因烤后烟叶的四 重PCR方法，通过一次PCR反应，同时检测烟叶的1个内源基因及3个外源基因，本方法较 传统单一 PCR检测方法具有操作简单、重复性强的优点，可节省试剂成本及提高检测效率。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] -种快速检测测转基因烤后烟叶的四重PCR引物，四对引物序列分别为：
[0008] NPTII:SEQIDN0:15'-TCACTGAAGCGGGAAGGGACTG-3'
[0009] SEQIDN0:25'-GCGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3'
[0010] 35S:SEQIDN0:35'-CTACCCGAGCAATAATCTCCAGG-3'
[0011] SEQIDN0:45'-TGCTCCACCATGTTGACGAAG-3'
[0012] NOS:SEQIDN0:55'-CCGGTCTTGCGATGATTATCAT-3'
[0013] SEQIDN0:65'-AGTAACATAGATGACACCGCGC-3'
[0014] NR:SEQIDN0:75'-CGCTGATAACTGGATTGAACGC-3'
[0015] SEQIDN0:85'-GGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC-3' 。
[0016] 进一步的，该方法利用上述四重PCR引物在一个反应体系内同时对4种目的基因 元件进行检测，所述4种目的基因元件分别是烟草内源基因 NR(烟草内源硝酸还原酶基 因）、35S启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）、N0S终止子（农杆菌胭脂碱合成酶基因终 止子）、NPTII筛选标记基因（大肠杆菌新霉素磷酸转移酶编码基因）。
[0017] 进一步的，PCR反应体系和扩增条件为：
[0018] (1)将上文所述4对引物经ddH20稀释成等摩尔浓度后按比例混合制成混合引物；
[0019] (2)PCR 反应体系：每 20 μ L，含 Mg2+0. 75-4. 5mmol/L、dNTP100-275 μ mol/L、Taq 酶 L 0-3. 0U、混合引物 0· 50-2. 00 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 将终体积调整到 20ul ;
[0020] (3)PCR 扩增条件：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，57. 5-67. 5°C退火 45s，72°C延 伸45s，共27-35个循环，72°C延伸5min。
[0021] 进一步优选的，PCR反应体系和扩增条件为：
[0022] (1)将上文所述4对引物经ddH20稀释成等摩尔浓度后按比例混合制成混合引物；
[0023] (2)所述 PCR 反应体系：每 20 μ L，含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、 混合引物1 μ mol/L，DNAlOOng，用ddH20将终体积调整到20ul。
[0024] (3)PCR 扩增条件：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，65°C退火 45s，72°C延伸 45s， 共35个循环，72°C延伸5min。
[0025] 进一步的，所述混合引物的混合比例为1:1:1:1 (V/V)。
[0026] 进一步的，该方法应用于快速检测烤后烟叶或鲜烟叶是否有含35S启动子、N0S终 止子、NPTII筛选标记基因3种转基因成分，检测限为0. 9% (V/V)。
[0027] 本发明方法的具体步骤为：
[0028] (1)提取待测烤后烟叶基因组DNA (DNA浓度大于100ng/ μ L，0D260/280在 1. 70-1. 90 之间），用 ddH20 将 DNA 浓度调至 100ng/ μ L。
[0029] (2)将SEQIDN0:1-8的4对引物预先按1:1:1:1 (稀释成相等摩尔浓度）等体积混 合。
[0030] (3)PCR 反应体系：含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、混合引物 1 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 将终体积调整到 20ul。
[0031] (4)?〇?扩增条件：941：预变性51^11，941：变性308,651：退火458,721：延伸458， 共35个循环，72°C延伸5min。
[0032] (5) PCR反应结束后加入5 μ L6 X loadingbuf f er，取8 μ L产物经2 %琼脂糖凝胶电 泳检测，如果出现大小为137bp的NR基因扩增条带，说明所提取的烟叶DNA质量附合PCR检 测要求；如果出现大小为490bp的NPTII基因扩增条带，说明该烟叶含有外源基因 NPTII ; 如果出现大小为345bp的35S基因扩增条带，说明该烟叶含有外源基因35S ;如果出现大小 为199bp的N0S基因扩增条带，说明该烟叶含有外源基因 N0S。
[0033] 所述的一种快速检测转基因烟叶外源基因的四重PCR引物及方法可在一个PCR反 应内同时检测4种基因元件，分别是烟草内源基因 NR，外源基因35S启动子、N0S终止子、 NPTII筛选标记基因。
[0034] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0035] (1)效率高：选用NR基因作为内源参照基因，利用四重PCR反应技术建立了一种 简单、高效、快速、低成本的转基因烤后烟叶检测方法，在同一次PCR反应可以同时检出4种 基因，包括烟草内源基因 NR，外源基因35S启动子、NOS终止子、NPTII筛选标记基因。
[0036] (2)特异性强：1次PCR反应同时检测4种基因，各扩增产物条带清晰，互不干扰， 该方法检测限为0.9% (V/V)。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1转基因烟叶的单一 PCR检测，其中泳道1 -3、4-6、7-9、10-12分别为ΝΡΤ11筛 选标记基因、35S启动子、N0S终止子、NR基因的单次PCR产物，其中1、4、7、10为已知含有 3种外源基因成分的转基因烟叶DNA，2、5、8、11为非转基因烟叶DNA对照，3、5、9、12为空白 对照，Μ 为 lOObpLadderDNAMarker ;
[0038] 图2不同Mg2+含量对四重PCR的影响，泳道1-6为转基因烟叶DNA，Mg 2+依次为 0·75、1.50、2.25、3. 00、3. 75、4. 50mmol/L, Μ 为 lOObpLadderDNAMarker ;
[0039] 图3不同dNTP含量对四重PCR的影响，泳道l-8dNTP含量分别为100、125、150、 175、200、225、250、275 μ mol/L，Μ 为 lOObpLadderDNAMarker ;
[0040] 图4不同Taq酶含量对四重PCR的影响，泳道l_5Taq酶含量分别为1. 0U、1. 5U、 2.0U、2. 5U、3. 0U，Μ 为 lOObpLadderDNAMarker ;
[0041] 图5不同混合引物含量对四重PCR的影响，泳道1-7引物含量分别为0. 50、0. 75、 1.00、1.25、1.50、1. 75、2· 00 μ mol/L，Μ 为 lOObpLadderDNAMarker ;
[0042] 图6不同退火温度对四重PCR的影响，泳道1-5退火温度分别为57. 5°C、60. 0°C、 62. 5°C、65. (TC、67. 5°C，Μ 为 100bpLadderDNA Marker ;
[0043] 图7不同循环对四重PCR的影响，泳道1-5循环数为27、29、31、33、35个循环，M为 lOObpLadderDNAMarker ；
[0044] 图8四重PCR检测限的确定，泳道1-5烟叶转基因含量分别为0.9 %、0.7 %、 0. 5%、0. 3%、0. 1%，泳道1-6为非转基因烟叶。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细说明：
[0046] -种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR方法，具体步骤为：
[0047] (1)提取待测烤后烟叶基因组DNA (DNA浓度大于100ng/ μ L，0D260/280在 1. 70-1. 90 之间），用 ddH20 将 DNA 浓度调至 100ng/ μ L。
[0048] (2)将SEQIDN0:1-8的4对引物预先按1:1:1:1 (稀释成相等摩尔浓度）等体积混 合。
[0049] (3)PCR 反应体系：含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、混合引物 1 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 将终体积调整到 20ul。
[0050] (4)?〇?扩增条件：941：预变性51^11，941：变性308,651：退火458,721：延伸458， 共35个循环，72°C延伸5min。
[0051] (5) PCR反应结束后加入5 μ L6 X loadingbuf f er，取8 μ L产物经2 %琼脂糖凝胶电 泳检测，如果出现大小为137bp的NR基因扩增条带，说明所提取的烟叶DNA质量附合PCR检 测要求；如果出现大小为490bp的NPTII基因扩增条带，说明该烟叶含有外源基因 NPTII ; 如果出现大小为345bp的35S基因扩增条带，说明该烟叶含有外源基因35S ;如果出现大小 为199bp的NOS基因扩增条带，说明该烟叶含有外源基因 NOS。
[0052] 所述的一种快速检测转基因烟叶外源基因的四重PCR引物及方法可在一个PCR反 应内同时检测4种基因元件，分别是烟草内源基因 NR，外源基因35S启动子、N0S终止子、 NPTII筛选标记基因。
[0053] 试验例
[0054] 1引物设计
[0055] 根据GB/T24310-2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》所提出的NPTII、35S、 NOS、NR引物序列在NCBI中搜索原序列，用PrimerPremierV5. 0设计引物，通过软件中的 Multiplex/NestedPrimers功能，筛选出引物间干扰最小的引物组合，再利用01ige6. 0对 设计引物Tm值进行评估，确定最终引物序列。
[0056] 四对引物序列及扩增片段长度如下表：
[0057]
【权利要求】
1. 一种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR引物，其特征在于，四对引物序列分别为： NPTII:SEQIDNO:15'-TCACTGAAGCGGGAAGGGACTG-3' SEQIDNO:25'-GCGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3' 35S:SEQIDNO:35'-CTACCCGAGCAATAATCTCCAGG-3' SEQIDNO:45'-TGCTCCACCATGTTGACGAAG-3' NOS:SEQIDNO:55'-CCGGTCTTGCGATGATTATCAT-3' SEQIDNO:65'-AGTAACATAGATGACACCGCGC-3' NR:SEQIDNO:75'-CGCTGATAACTGGATTGAACGC-3' SEQIDNO:85'-GGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC-3' 。
2. -种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR方法，其特征在于：该方法利用权利要求1 所述四重PCR引物在一个反应体系内同时对4种目的基因元件进行检测，所述4种目的基 因元件分别是烟草内源硝酸还原酶基因、花椰菜花叶病毒35S启动子、农杆菌胭脂碱合成 酶基因终止子、大肠杆菌新霉素磷酸转移酶编码基因。
3. 根据权利要求2所述的一种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR方法，其特征在于， PCR反应体系和扩增条件为： (1) 将权利要求1所述4对引物经ddH20稀释成等摩尔浓度后按比例混合制成混合引 物； (2) PCR 反应体系：每 20 μ L，含 Mg2+0. 75-4. 5mmol/L、dNTP100-275 μ mol/L、Taq 酶 L 0-3. 0U、混合引物 0· 50-2. 00 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 将终体积调整到 20ul ; (3) PCR 扩增条件：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，57. 5-67. 5°C退火 45s，72°C延伸 45s，共 27-35 个循环，72°C延伸 5min。
4. 根据权利要求3所述的一种快速检测转基因烤后烟叶的四重PCR方法，其特征在于， PCR反应体系和扩增条件为： (1)将权利要求1所述4对引物经ddH20稀释成等摩尔浓度后按比例混合制成混合引 物； ⑵所述 PCR 反应体系：每 20 μ L，含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、混合 弓丨物1 μ mol/L，DNAlOOng，用ddH20将终体积调整到20ul ; (3)卩〇?扩增条件：941：预变性51^11，941：变性308,651：退火458,721：延伸458，共35 个循环，72°C延伸5min。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述混合引物的混合比例为 1:1:1:1(V/V)〇
6. 根据权利要求2-5所述的方法，其特征在于，该方法应用于快速检测烤后烟叶或 鲜烟叶是否有含35S启动子、N0S终止子、NPTII筛选标记基因3种转基因成分，检测限为 0.9% (V/V)〇
【文档编号】C12N15/11GK104152541SQ201410217600
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】余婧, 赵杰宏, 邹颉, 郭玉双, 林世锋, 付强, 张孝廉, 余世洲 申请人:贵州省烟草科学研究院