微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途
【专利摘要】本发明公开了微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途、用于诱导干细胞巨核分化的培养基以及促进干细胞巨核分化的方法。在干细胞向巨核细胞培养分化的体系中添加微囊泡，能够有效提高巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板的细胞活性。
【专利说明】微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途。
【背景技术】
[0002] 核辐射，武器伤，大剂量的化疗，异体组织器官移植，免疫系统和血液系统的一些 疾病都会导致血小板数量的减少或者功能不良，引起内出血而危及生命。临床上多通过反 复输注血小板，预防病人内出血的发生。因此，血小板的需求量巨大。目前常采用的机采血 小板却存在着供者舒适度低，供应量少，保存时间短，会产生免疫反应及病原体污染等不利 因素，要解决血液来源匮乏的问题，开发新的血源变得尤为迫切，其中干细胞研究为体外制 备血小板提供了新的研究方向，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSC)及脐带、骨髓、夕卜 周血来源的造血干祖细胞都可以作为种子细胞，通过大量诱导扩增生成可用于移植的巨核 祖细胞、巨核细胞或者血小板。经研究证实，在体外扩增的造血干细胞，诱导其分化为巨核 细胞和血小板，重新回输入体内，也可以发挥相应的凝血功能。健康新生儿的脐带血因具有 从临床较易获得、对捐献者无伤害且无伦理学争议等独特优势，已经成为干细胞移植领域 中，继骨髓、动员外周血之后的又一种新的造血干/祖细胞来源，成功用于临床上再生障碍 性贫血、白血病、急性辐射损伤等病人的造血重建。
[0003] 虽然诱导干细胞获得巨核细胞和成熟血小板的研究不断见诸报导，但是目前的干 细胞的巨核分化效率和细胞活性低，产生的有功能的细胞和血小板的生成量少，不能满足 临床应用需要。因而，目前的诱导干细胞巨核分化的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种巨核分化效率高、细胞活性好的诱导干细胞巨核分化的方法。
[0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 生理条件下，造血干细胞向红系定向分化的过程经历了如下过程： pluripotent stem cell (多能干细胞）一committed stem cell (定向干细 胞）-CFU-GEMM(colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte and megakaryocyte :粒细胞，红细胞，单核细胞及巨核细胞集落形成单位；多能造血祖细 胞）一BFU_MK(burst forming unit-megakaryocyte:爆式巨核细胞集落形成单位；前 巨核细胞系祖细胞）一CFU_MK(colony forming unit-megakaryocyte:巨核细胞集落 形成单位；巨核细胞系祖细胞）一promegakaryoblast(前原始巨核细胞；前成巨核细 胞）一megakaryoblast (原始巨核细胞；成巨核细胞）一promegakaryocyte (幼稚巨核细 胞）一megakaryocyte (巨核细胞）一platelet (血小板）。
[0007] 微囊泡是由细胞膜的出芽形成的一种磷脂膜结构包裹的颗粒，直径在 100-1000nm，多在200nm左右。血液中70% -90%的微囊泡来自于激活的血小板，因为在膜 出芽生成的同时微囊泡还包裹了一些胞质成分，所以其富含细胞因子，趋化因子，酶类，生 长因子等各种发挥不同生物学功能的物质。微囊泡通过受体配体连接作用，捕获靶细胞，从 而形成特殊的脂质复合物，进而把生物活性物质传递到靶细胞中，更重要的是，微囊泡是在 循环血中运送独特MicroRNA的主要载体形式，在细胞间信息传递中发挥了重要作用。而且 血小板产生的微囊泡参与了血栓形成、炎症反应和血管再生等过程，在促进内皮细胞和平 滑肌细胞生长、促进造血干祖细胞增殖，存活，粘附，趋化性和移植的存活率等方面有着重 要作用。
[0008] 发明人研究发现，特发性血小板减少性紫癜，阵发性血红蛋白尿，肝素诱导的血小 板减少这些特发的或者某些药物引起的由自身免疫系统对血小板进行破坏的疾病中，外周 血中由血小板产生的微囊泡的数量增加，骨髓也呈现出巨核系的增生象，因而，发明人推测 这两者之间可能会存在着某种联系。进而，发明人在无血清无基质细胞的、造血干细胞向巨 核细胞的培养分化的体系中添加由血小板生成的微囊泡，结果发现，相对于对照，添加微囊 泡后造血干细胞的扩增能力和向巨核细胞分化的能力均显著增加，从而获得了数量更多成 熟度更高的巨核细胞。因而，发明人认为，微囊泡能够显著增加造血干细胞或其他干细胞的 巨核分化能力。
[0009] 为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的 用途。由此，在干细胞向巨核细胞培养分化的体系（如诱导分化培养基）中添加微囊泡，能 够有效提高巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板的细胞活性。
[0010] 根据本发明的实施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，干细胞的巨核分化效率 高，获得的巨核细胞或血小板活性好。
[0011] 根据本发明的实施例，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。即微囊 泡对造血干细胞尤其是脐带血单个核细胞的巨核分化促进效果尤其显著。
[0012] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于诱导干细胞巨核分化的培养 基。根据本发明的实施例，该培养基包含微囊泡。由此，利用本发明的培养基能够高效地诱 导干细胞向巨核细胞分化，从而能够获得大量细胞活性好的巨核细胞或血小板。
[0013] 另外，根据本发明上述实施例的用于诱导干细胞巨核分化的培养基还可以具有如 下附加的技术特征：
[0014] 根据本发明的实施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，利用本发明的用于诱导干 细胞巨核分化的培养基诱导干细胞巨核分化时，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细 胞或血小板活性好。
[0015] 根据本发明的实施例，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。
[0016] 根据本发明的实施例，所述培养基中包含1-25X 105个/ml微囊泡。由此，干细胞 的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。
[0017] 根据本发明的实施例，所述培养基为添加了 100ng/mL rhTP0、100ng/mL SCF、 20ng/mL IL_3、50ng/mL IL-6 和 20ng/mL IL-11 的 Stemspan 培养基。由此，干细胞的巨核 分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。
[0018] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种促进干细胞巨核分化的方法。根据 本发明的实施例，该方法利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞。发明人惊奇 地发现，利用该方法能够有效地促进干细胞巨核分化，提高干细胞的巨核分化效率和获得 的巨核细胞或血小板的细胞活性。
[0019] 根据本发明的实施例，所述诱导分化培养基中添加有1-25 X 105个/ml微囊泡。由 此，利用本发明的方法诱导干细胞巨核分化时，能够显著提高干细胞的巨核分化效率和获 得的巨核细胞或血小板活性。
[0020] 根据本发明的实施例，所述添加微囊泡的诱导分化培养基为前面所述的本发明的 用于诱导干细胞巨核分化的培养基。由此，能够显著提高干细胞的巨核分化效率和获得的 巨核细胞或血小板的细胞活性。进而，根据本发明的另一些实施例，于37摄氏度，5% C02条 件下，利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞7-15天，其中，隔天半量换液，并 使所述诱导分化培养基中各成分浓度不变。由此，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细 胞或血小板活性好。
[0021] 根据本发明的实施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，干细胞的巨核分化效率 高，获得的巨核细胞或血小板活性好。
[0022] 根据本发明的实施例，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。
[0023] 此外，需要说明的是，本发明通过添加血小板提取的微囊泡，解决了巨核细胞在无 血清无滋养层细胞的条件下，体外分化效率低，增殖能力差，成熟度不高的问题。
[0024] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0026] 图1显示了实施例1中获得的血小板生成的微囊泡的免疫表型检测结果，其中，
[0027] 图1A显示了依据微囊泡的大小划定微囊泡的范围P1的结果，
[0028] 图1B显示了依据乳糜微粒大小不同，划定的乳糜微粒和微囊泡的范围的结果，
[0029] 图1C显示了对图1B划定范围的微囊泡进行表面标志分析的结果；
[0030] 图2显示了实施例1中获得的血小板生成的微囊泡的透射电镜扫描结果；
[0031] 图3-图8显示了实施例2中，微囊泡是否添加、添加时间点和添加浓度对诱导干 细胞巨核分化的影响实验的结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。
[0033] 本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本 发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条 件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得 的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
[0034] 实施例1微囊泡的制备
[0035] 按照以下步骤制备微囊泡：
[0036] a.血小板的分离
[0037] 1)取新鲜的经检验合格并经抗凝处理的全血，经过4°C，2000r/min离心20-30分 钟，分离出上层血浆。
[0038] 2)使用1)中获取的血浆，或直接使用新鲜合格的单采血小板以及富血小板血浆， 经4°C，2000g/min离心15-20分钟，取下层沉淀，为分离的血小板。
[0039] 3)并用缓冲盐溶液悬起，重复步骤2)。
[0040] b.血小板的激活
[0041] 4)将分离得到的血小板用缓冲盐溶液悬起，加入血小板的激活剂（如凝血酶、 CaCl2、ADP、A23187等）后37°C，200r震荡15-25分钟，使血小板充分激活。主要激活方法 如下表：
[0042]
【权利要求】
1. 微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单 个核细胞。
4. 一种用于诱导干细胞巨核分化的培养基，其特征在于，包含微囊泡。
5. 根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成。
6. 根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血 单个核细胞。
7. 根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包含1-25 X 105个/ml微 囊泡， 任选地,所述培养基为添加了 100ng/mL rhTP0、100ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、50ng/ mLIL-6 和 20ng/mL IL-11 的 Stemspan 培养基。
8. -种促进干细胞巨核分化的方法，其特征在于， 利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导分化培养基中添加有1-25 X 105 个/ml微囊泡， 任选地，所述添加微囊泡的诱导分化培养基为权利要求4-7任一项所述的培养基， 任选地，于37摄氏度，5 % C02条件下，利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干 细胞7-15天，其中，隔天半量换液，并使所述诱导分化培养基中各成分浓度不变。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成， 任选地，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。
【文档编号】C12N5/078GK104195107SQ201410309772
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】裴雪涛, 谢小燕, 曲洺逸 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所