一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基及发酵方法
【专利摘要】一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基及发酵方法，属于微生物工程发酵【技术领域】，该发酵方法是将保藏的嗜酸小球菌接种到MRS固体斜面培养基上，37-40℃恒温培养3-5d，得固体斜面菌种；将培养成熟的固体斜面菌种接种到MRS液体种子培养基中，37-40℃恒温静置培养24-36h，得液体菌种；再按2-5%的接种量（V/V）将培养好的液体菌种接种到制备的饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基中，37-40℃恒温静置培养18-26h。本方法生产工艺简单，对设备的要求低、投资小，生产成本低，获得的嗜酸小球菌制剂质量稳定，产品活性高，有利于嗜酸小球菌液在动物养殖业中的推广应用，对提高我国的动物产品质量具有重要的现实意义，同时具有良好的经济效益和社会效益。
【专利说明】一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基及发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物工程发酵【技术领域】，具体涉及一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基及发酵方法。
【背景技术】
[0002]乳酸菌是被各国批准使用的最大一类和最早使用的益生菌。该菌作为人和动物的有益菌(或称为益生菌)广泛用于发酵乳制品(如益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪)、发酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加剂(如在婴儿配方乳粉、中老年乳粉、果蔬汁等中的添加等)、膳食补充剂(片剂、胶囊等)以及饲料微生态制剂中。
[0003]嗜酸小球菌(Ped1coccus acidilactici)是一种乳酸菌,属于革兰氏阳性菌,不运动，兼性厌氧。目前，嗜酸小球菌能赋予食品柔和的酸味及香气，改进食品的品质和营养，还具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异和增强免疫力等重要生物学功能。其作为发酵菌种已经大量的在多国的食品中使用，是备受人们喜爱和接受的有益菌群。此外，其显著的抑菌效果，使得嗜酸小球菌潜藏着巨大的应用价值和广阔的应用前景。
[0004]嗜酸小球菌作为一种新型的微生态制剂，除了具有益生素的功能外，还同时具有保健功能，尤其对人及动物无毒无病原性，对酸有很强的抵抗力，可顺利地通过胃，并在肠道内迅速增殖，调解肠道菌群，分泌类杀菌因子，刺激免疫系统提高免疫能力，促进动物全群健康水平等方面，是饲料业中的绿色添加剂。
[0005]生料发酵是指微生物在培养基中不经过高温高压条件下生长、繁殖和代谢的一种发酵方式。该发酵法起源于国外，最早应用于酿酒工业，以酒精发酵为切入点。到了 20世纪90年代后期，随着我国生物技术水平地不断提高，使生料发酵有了新的进步，技术逐渐成熟，并很快在全国各地和其它行业迅速发展。与熟料发酵相比，生料发酵减少了能耗和培养基中的营养损失。
[0006]目前关于嗜酸小球菌生料发酵及制剂应用于动物养殖的公开文献不多，主要集中在片球菌素的发酵生产和在香肠发酵中的应用，如CN101050437和CN102115720A分别公开了生产片球菌素的方法；CN102127578A公开了一种积累片球菌素的方法，可以增加片球菌素的生产量；CN101289647公开的一株片球菌能够在发酵香肠中作为发酵剂的应用，改善发酵香肠的风味；CN103283950A公开了嗜酸小球菌活菌制剂(作为畜禽饲料添加剂)的生产方法，但该方法是采用传统的发酵技术，存在生产成本高、工艺复杂、设备投资大等缺点。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基及发酵方法，该方法具有生产工艺简单、设备投资少、生产成本和能耗低、易于推广和应用、产品活菌数高且活性高、无三废排放等特点，解决了目前嗜酸小球菌特别是嗜酸小球菌生产工艺上存在的生产工艺复杂，生产成本高，设备投资大等问题。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基，该培养基按重量百分比由下列物质组成:葡萄糖2-5%、蛋白胨0.5-0.8%、牛肉膏0.3-0.5%、酵母膏0.2-0.4%、无水乙酸钠0.8-1.2%、磷酸氢二钾0.1-0.2%、无水硫酸镁 0.05-0.1%、热保护剂 7-11%、杂菌抑制剂 0.1-3% 及水 80-88%，ρΗ5.5-7.0。
[0009]上述热保护剂为海藻糖或甘油中的一种或两种。上述杂菌抑制剂为双乙酸钠或NaCl中的一种或两种。
[0010]上述发酵培养基的制备方法:按比例取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、热保护剂及杂菌抑制剂加入水中，搅拌，使葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、热保护剂及杂菌抑制剂充分溶解，再调节PH值为5.5-7.0。pH值的调节为常规技术，如采用稀NaOH溶液、稀HCl溶液调节。
[0011]一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵方法，该方法步骤如下:
(1)固体斜面菌种制备:将嗜酸小球菌斜面菌种(保藏于4°c环境中)接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，37-40°C恒温培养3-5d ；
(2)液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于经灭菌(115-1211:灭菌25-301^11)并冷却至室温的1--液体种子培养基中，37-401:恒温静置培养24-36h ；
(3)发酵:按2-5%的接种量(V/V)将培养好的液体菌种接种到上述饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基中，37-40°C恒温静置培养18-26h，即得饲用嗜酸小球菌发酵液。
[0012]本发明中用到的嗜酸小球菌为现有技术，保藏号为:嗜酸小球菌acidilactici ) CGMCC1.4、CICC10344、CCAM080049 或 CICMB1355。
[0013]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
(I)本方法使用的嗜酸小球菌热保护剂直接加入液体生料发酵培养基中，增加了嗜酸小球菌对保护剂的适应性，避免了保护剂对菌体的刺激而降低菌体的活性。
[0014](2)本方法采用的液体生料发酵，培养基不需要经过高温灭菌环节，极大地降低了嗜酸小球菌生产过程中的能耗，同时也避免了高温灭菌过程中营养物质的损失。
[0015](3)本方法具有生产工艺简单、设备投资少、生产成本低、易于推广和应用、产品活菌数高且活性高、无三废排放等特点。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例仅对本发明作进一步说明。
[0017]实施例1
1、发酵培养基制备:取葡萄糖35kg、蛋白胨7kg、牛肉膏3.5kg、酵母膏3kg、无水乙酸钠10kg、磷酸氢二钾1.2kg、无水硫酸镁0.7kg、海藻糖85kg、NaC121kg及双乙酸钠9kg置于盛有824.6kg水的容器中，搅拌，使各物质充分溶解，用稀NaOH溶液调节pH值为7.0。
[0018]2、固体斜面菌种制备:将保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，37 °C恒温培养5d。
[0019]3、液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于经灭菌(121°C灭菌25min)并冷却至室温的MRS液体种子培养基中，40°C恒温静置培养24h。
[0020]4、发酵:按4%的接种量(V/V)将培养好的液体菌种接种到前述制备好的发酵培养基中，40°C恒温静置培养18h，即得饲用嗜酸小球菌发酵液。
[0021]实施例2
1、发酵培养基制备:取葡萄糖50kg、蛋白胨5kg、牛肉膏3kg、酵母膏4kg、无水乙酸钠8kg、磷酸氢二钾2kg、无水硫酸镁0.5kg、海藻糖60kg、甘油50kg、NaCl 17.5kg置于盛有800kg水的容器中，搅拌，使各物质充分溶解，用稀HCl溶液调节pH值为5.5。
[0022]2、固体斜面菌种制备:将保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，40°C恒温培养3d。
[0023]3、液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于经灭菌(115°C灭菌30min)并冷却至室温的MRS液体种子培养基中，38°C恒温静置培养30h。
[0024]4、发酵:按2%的接种量(V/V)将培养好的液体菌种接种到前述制备好的发酵培养基中，37°C恒温静置培养26h，即得饲用嗜酸小球菌发酵液。
[0025]实施例3
1、发酵培养基制备:取葡萄糖20kg、蛋白胨8kg、牛肉膏5kg、酵母膏2kg、无水乙酸钠12kg、磷酸氢二钾1kg、无水硫酸镁1kg、甘油70kg及双乙酸钠Ikg置于盛有880kg水的容器中，搅拌，使各物质充分溶解，用稀HCl溶液调节pH值为6.0。
[0026]2、固体斜面菌种制备:将保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，38 °C恒温培养4d。
[0027]3、液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于经灭菌(118°C灭菌28min)并冷却至室温的MRS液体种子培养基中，37°C恒温静置培养 36h。
[0028]4、发酵:按5%的接种量(V/V)将培养好的液体菌种接种到前述制备的发酵培养基中，39°C恒温静置培养22h，即得饲用嗜酸小球菌发酵液。
【权利要求】
1.一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基，其特征在于，该培养基按重量百分比由下列物质组成:葡萄糖2-5%、蛋白胨0.5-0.8%、牛肉膏0.3-0.5%、酵母膏0.2-0.4%、无水乙酸钠0.8-1.2%、磷酸氢二钾0.1-0.2%、无水硫酸镁0.05-0.1%、热保护剂7_11%、杂菌抑制剂0.1-3% 及水 80-88%, ρΗ5.5-7.0。
2.如权利要求1所述的一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基，其特征在于，所述热保护剂为海藻糖或甘油中的一种或两种。
3.如权利要求1所述的一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基，其特征在于，所述杂菌抑制剂为双乙酸钠或NaCl中的一种或两种。
4.一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵方法，其特征在于:该方法步骤如下: (O固体斜面菌种制备:将嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，37-40°C恒温培养3-5d ； (2)液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于已灭菌的MRS液体种子培养基中，37-40°C恒温静置培养24-36h ； (3)发酵:按2-5%的接种量(V/V)将培养好的液体菌种接种到权利要求1-3中任一项所述的饲用嗜酸小球菌液体生料发酵培养基中，37-40°C恒温静置培养18-26h，即得饲用嗜酸小球菌发酵液。
5.如权利要求4所述的一种饲用嗜酸小球菌液体生料发酵方法，其特征在于:步骤(2)中的灭菌是指于115-121°C灭菌25-30min，并冷却至室温。
【文档编号】C12N1/20GK104357360SQ201410643050
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】兰时乐, 周芳如, 肖调义, 李玥, 厉大伟, 王红权 申请人:湖南农业大学