香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的应用的制作方法

本发明涉及食品安全与卫生领域，特别涉及香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的应用。

背景技术：

食品在加工贮藏及运输的各个环节都容易受到食源性致病菌的污染，为了保持食品的新鲜卫生，避免腐烂变质，人们需要在食品中添加各种各样的防腐剂，而其中主要以人工合成的化学类防腐剂居多，但有的化学防腐剂对人类具有一定的危害性，给食品安全带来潜在的风险。

生物膜是微生物镶嵌并生长在自身产生的胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS,主要是胞外多糖、蛋白质和胞外DNA)中的微生物群体，其多附着在物体的表面。生物膜是微生物对环境的一种适应，是与游离态相对应的一种生长状态，它可增强细菌的耐药性、环境适应性及对宿主免疫系统攻击的耐受性，这在食品安全与医疗领域带来严重的风险。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是常见的食源性致病菌，常引起食品安全问题，对人体健康造成威胁，严重的可引起死亡。这些致病菌为了适应外界环境，常聚集在一起，形成生物膜，从而抵御外界环境尤其是抗生素等抗菌物质的清除，成为持续性感染的源头。传统的抗菌物质对生物膜的作用效果较差，而现在的方法主要集中在化学或生物的方法，如化学合成药物、酶解等方法，这些方法要么工艺复杂、要么成本较高、甚至对人体还有副作用。因此开发出新型、高效、安全的天然抗生物膜物质具有重要的理论和现实意义。香辛料是我们日常生活中常见的调味剂，而且大多数都具有抑制细菌生长的作用，但是其对生物膜是否有抑制及清除作用仍鲜有报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题，就是提出香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的应用，所述香辛料提取物为香辛料醇提取物或香辛料水提取物。

优选地，所述香辛料提取物为大蒜、肉桂、辣木叶、辣木茎、丁香的提取物中的一种或两种。

优选地，所述食源性致病菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌或副溶血弧菌。

优选地，所述香辛料提取物按以下方法制备：香辛料备原料破碎处理获得料渣，按料液比1:6～12(m/v)加入提取液，用超声波辅助提取，温度为40～60℃，提取时间为0.5～1.5h，减压抽滤后用旋转蒸发仪进行浓缩，旋转蒸发条件为50～60℃，转入具塞试管定容后即得。

优选地，所述提取液为80％的乙醇或者水。

优选地，所述香辛料提取物对食源性致病菌生物膜的抑制具体体现为抑制食源性致病菌生物膜的形成，抑制代谢活性和抑制产生胞外多糖，且辛香料提取物对食源性致病菌的最小抑菌浓度为6.25mg/mL-12.5mg/mL。具体地，辣木茎提取物和大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为12.5mg/mL；肉桂提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为6.25mg/mL，辣木叶提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为12.5mg/mL；肉桂提取物和大蒜提取物对副溶血弧菌的最小抑菌浓度均为6.25mg/mL。

优选地，所述香辛料提取物对食源性致病菌生物膜的清除具体体现为进入成熟的生物膜中并杀死其中部分食源性致病菌以及分解生物膜的胞外多糖。

因为生物膜具有较强的抗逆性，因此对生物膜的控制应采用多种方法联合，本发明为香辛料提取物在食源性致病菌生物膜控制中的应用提供了理论基础，为研究健康、安全的抗生物膜产品提供了理论依据。

附图说明

图1为不同香辛料提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈的大小示意图；

图2为不同香辛料提取物对大肠杆菌抑菌圈的大小示意图；

图3为不同香辛料提取物对副溶血弧菌抑菌圈的大小示意图；

图4为辣木茎或大蒜的提取物以及辣木茎与大蒜提取物的复配物对金黄色葡萄球菌的MIC对比图；

图5为肉桂或辣木叶的提取物以及肉桂与辣木叶提取物的复配物对大肠杆菌的MIC对比图；

图6为肉桂或大蒜的提取物以及肉桂与大蒜提取物的复配物对副溶血弧菌的MIC对比图；

图7为辣木茎或大蒜的提取物以及辣木茎与大蒜提取物的复配物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制效果对比图；

图8为辣木茎与大蒜提取物对金黄色葡萄球菌生物膜代谢活性的影响对比图；

图9为辣木茎与大蒜提取物对金黄色葡萄球菌胞外多糖的影响示意图；

图10为肉桂或辣木叶的提取物以及肉桂与辣木叶提取物的复配物对大肠杆菌生物膜形成量的影响对比图；

图11为肉桂与辣木叶提取物对大肠杆菌生物膜代谢活性的影响对比图；

图12为肉桂与辣木茎提取物对大肠杆菌胞外多糖的影响示意图；

图13为肉桂或大蒜的提取物以及肉桂与大蒜提取物的复配物对副溶血弧菌生物膜形成量的影响对比图；

图14为肉桂与大蒜提取物对副溶血弧菌生物膜代谢活性的影响对比图；

图15为肉桂与大蒜提取物对副溶血弧菌胞外多糖的影响示意图；

图16为辣木茎提取物、大蒜提取物以及它们的提取物复合物对金黄色葡萄球菌生物膜的清除率对比图；

图17为不同浓度的辣木茎和大蒜提取物对金黄色葡萄球菌成熟生物膜胞外多糖的影响对比图；

图18为肉桂提取物、辣木叶提取物以及它们的提取物复合物对大肠杆菌生物膜的清除率对比图；

图19为不同浓度的肉桂与辣木叶提取物对大肠杆菌成熟生物膜胞外多糖的影响对比图；

图20为肉桂提取物、大蒜提取物以及它们的提取物复合物对副溶血弧菌生物膜的清除率对比图；

图21为不同浓度的肉桂与大蒜提取物对副溶血弧菌成熟生物膜胞外多糖的影响对比图；

图22为CLSM观察大蒜提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用效果图；

图23为CLSM观察肉桂提取物对大肠杆菌生物膜的抑制作用效果图；

图24为CLSM观察肉桂提取物对副溶血弧菌生物膜的抑制作用效果图；

图25为CLSM观察大蒜提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的清除作用效果图；

图26为CLSM观察肉桂提取物对大肠杆菌生物膜的清除作用效果图；

图27为CLSM观察肉桂提取物对副溶血弧菌生物膜的清除作用效果图。

具体实施方式

为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 香辛料等植物提取物的制备

将小茴香、花椒、胡椒、迷迭香、肉桂、丁香干燥、粉碎，洋葱、辣木叶、辣木茎、大蒜、生姜分别用榨汁机绞碎，按料液比1:6～12(m/v)分别加入80％乙醇(v/v)或去离子水，然后用超声波辅助提取，温度为40～60℃，提取时间为0.5～1.5h。减压抽滤后用旋转蒸发仪进行浓缩，旋转蒸发条件为50～60℃，转入具塞试管中，定容后使质量浓度为1g/mL(即1g香辛料提取物定容为1mL)，密封后保存于4℃冰箱中备用。

实施例2 菌悬液的制备

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血弧菌分别接种于TSB培养基中，置于摇床中37℃，120r/min培养12h。将菌悬液离心收集菌体，10倍梯度稀释后与配制好的10mL 0.5麦氏比浊管(0.25％BaCl₂ 0.2mL，1％H₂SO₄ 9.8mL)进行浊度比较，并用平板计数法验证，最终确定其活菌含量约为10⁸CFU/mL。

实施例3 牛津杯法测定香辛料提取物的抑菌能力

在配制好的TSA固体培养基上加入200μL稀释至10⁸CFU/mL的菌液，涂布均匀后，用无菌镊子将灭菌并冷却至常温的牛津杯呈三角形放置在平板上，在每个牛津杯中加入100μL各提取液，置于37℃恒温培养箱中培养24h后观察并测量抑菌圈直径，每次实验以80％乙醇和无菌水作对照。不同提取物对三种食源性致病菌的抑菌圈的大小见附图1-3。

实施例4 二倍稀释法测定香辛料提取物对三种菌的最小抑制浓度(MIC)

在96孔细胞培养板中先加入100μL灭菌后的MH肉汤培养基，然后在第一列加入稀释后的提取物100μL，混合均匀后从中吸取100μL至下一列中，依次至六个浓度梯度，然后再在每孔中加入100μL浓度为10⁶CFU/mL的菌液，这样每列的浓度分别为50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.13mg/mL和1.56mg/mL。每列三个重复，第七行为不加提取物和菌液的空白对照，第八行为不加提取物的阴性对照。不同提取物对三种食源性致病菌的最低抑菌浓度见附图4-6，“**”表示其与对照组差异极显著。

实施例5 结晶紫法定量测定香辛料提取物对生物膜形成的影响

在96孔板中加入TSB培养基，再加入提取物和菌液；同时设空白对照和阴性对照。盖上盖子，并用保鲜膜包裹密封，放入恒温培养箱中培养一定的时间；取出96孔板，弃去培养液，并在每孔中加入250μL生理盐水清洗两遍，去除浮游菌；将96孔板放入60℃鼓风干燥机中干燥15min；在每孔中加入200μL0.1％的结晶紫溶液，染色10min；弃去结晶紫溶液，在每孔中加入250μL的生理盐水清洗三遍，除去未染色的结晶紫；60℃鼓风干燥机中干燥15min；在每孔中加入200μL33％冰乙酸，静置10min。在酶标仪中测其在595nm波长下的OD值。

计算抑制率：

抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。

实施例6 XTT减低法测生物膜中的代谢活性

(1)在96孔板中加入TSB培养基、提取物和菌液；同时设空白对照和阴性对照。盖上盖子，用保鲜膜包裹密封，放入恒温培养箱中培养一定的时间；

(2)取出96孔细胞培养板，弃去内容物；

(3)在每孔中加入100μL PBS缓冲液，然后将XTT溶液和甲萘醌溶液按12.5:1混合后，每孔加入13.5μL，避光孵育4h，温度与培养温度相同；

(4)在420nm波长下测其吸光值。

(5)计算抑制率

抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。

实施例7 测定提香辛料取物对胞外多糖产生的影响

(1)将在含有不同浓度提取物的培养基中培养后的菌液于5000r/min离心10min，除去上清液，将菌重悬于10mL灭菌生理盐水中，煮沸10min，常温下冷却20min；

(2)加入50μL的Pronase E，37℃避光孵育2h；

(3)加入200μL的质量浓度为10％的TCA溶液，冰水放置30min；

(4)10000r/min离心30min，收集上清液，加入等体积的乙醇溶液，-20℃放置1h；

(5)10000r/min离心20min，去掉上清液，沉淀物用95％的乙醇洗涤两次；

(6)最终沉淀重悬于1mL无菌去离子水中，加入质量浓度5％的重蒸酚和浓硫酸，沸水浴10min；

(7)每个样品吸取200μL加入96孔细胞培养板，在420nm波长下测定吸光值；

(8)计算抑制率

抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。

实施例8 香辛料提取物对成熟生物膜内活菌数的影响

在50mL离心管中放入一块灭菌后的盖玻片，然后加入10mL TSB培养基，接入相应的致病菌，使其终浓度约为10⁶CFU/mL。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在37℃下，而副溶血弧菌在30℃下培养48h。将培养后的盖玻片取出用生理盐水洗三遍之后放入新的含有相应浓度提取物的10mL生理盐水的50mL离心管中继续培养24h。然后将盖玻片取出，用生理盐水洗三遍后放入新的含有10mL生理盐水的离心管中，超声波震荡10min。梯度稀释后，取100μL菌液均匀涂布于TSA平板中，相应温度培养24h后观察计数。

实施例9 激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察生物膜的立体结构

(1)在普通培养皿中放入灭菌的载玻片，然后加入15mL含有不同浓度提取物的TSB培养基，接入菌种，使每个培养皿中的终浓度达到10⁶CFU/mL；金黄色葡萄球菌和大肠杆菌放置于37℃，而副溶血弧菌置于30℃恒温培养箱培养24h；

(2)从培养皿中取出载玻片，用PBS冲洗三遍，用滤纸轻轻擦去多余液体；

(3)避光环境下在载玻片上滴加5μL ConA-FITC混合溶液，4℃放置30min；

(4)在相同位置上再滴加5μL PI溶液，4℃放置15min；

(5)放置于CLSM中观察生物膜的结构。

实施例10 数据统计与分析

应用SPSS22.0软件进行平均值和标准偏差的计算，并对其进行显著性分析(P＜0.01为差异极显著，0.01＜P＜0.05为差异显著)。

实施例11 大蒜乙醇提取物、辣木茎乙醇提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

将不同浓度的辣木茎和大蒜的乙醇提取物及它们1:1(v/v)复配后，对金黄色葡萄球菌生物膜的形成进行抑制。结果发现，这些提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成都有抑制作用，都表现出较强的浓度依赖(附图7)；对金黄色葡萄球菌生物膜的代谢活性、胞外多糖的产生也具有很强的抑制作用(附图8、附图9)。注：图中提取物的浓度由低到高均为1/8×MIC-2×MIC；相同字母表示两两之间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示两两之间差异显著(P＜0.05)

实施例12 辣木叶乙醇提取物和肉桂乙醇提取物对大肠杆菌生物膜的抑制作用

将不同浓度的辣木叶乙醇提取物和肉桂乙醇提取物及它们1:1(v/v)复配后，对大肠杆菌生物膜的形成进行抑制。结果发现，这些提取物对大肠杆菌生物膜的形成都有抑制作用，都表现出较强的浓度依赖(附图10)；对大肠杆菌生物膜的代谢活性、胞外多糖的产生也具有很强的抑制作用(附图11、附图12)。注：图中提取物的浓度由低到高均为1/8×MIC-2×MIC；相同字母表示两两之间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示两两之间差异显著(P＜0.05)

实施例13 肉桂乙醇提取物和大蒜乙醇提取物对副溶血弧菌生物膜的抑制作用

将不同浓度的肉桂乙醇提取物和大蒜乙醇提取物及它们1:1(v/v)复配后，对副溶血弧菌生物膜的形成进行抑制。结果发现，这些提取物对大副溶血弧菌生物膜的形成都有抑制作用，都表现出较强的浓度依赖(附图13)；对副溶血弧菌生物膜的代谢活性、胞外多糖的产生也具有很强的抑制作用(附图14、附图15)。

实施例14 大蒜乙醇提取物、辣木茎乙醇提取物对金黄色葡萄球菌成熟生物膜的清除作用

金黄色葡萄球菌培养48h后形成成熟的生物膜，将不同浓度的辣木茎和大蒜的乙醇提取物及它们的1:1(v/v)复配物加入其中，同时设阴性对照，继续培养24h；然后分别测生物膜量、胞外多糖的产生量，计算清除率。结果表明，这些提取物对金黄色葡萄球菌生物膜都有清除作用(附图16)；对金黄色葡萄球菌胞外多糖也具有很强的清除能力(附图17)。注：相同字母表示两两之间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示两两之间差异显著(P＜0.05)。

实施例15 辣木叶乙醇提取物和肉桂乙醇提取物对大肠杆菌成熟生物膜的清除作用

大肠杆菌培养48h后形成成熟的生物膜，将不同浓度的辣木叶乙醇提取物和肉桂乙醇提取物及它们的1:1(v/v)复配物加入其中，同时设阴性对照，继续培养24h；然后分别测生物膜量、胞外多糖的产生量，计算清除率。结果表明，这些提取物对大肠杆菌生物膜都有清除作用(附图18)；对大肠杆菌胞外多糖也具有很强的清除能力(附图19)。注：相同字母表示两两之间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示两两之间差异显著(P＜0.05)。

实施例16 肉桂乙醇提取物和大蒜乙醇提取物对副溶血弧菌成熟生物膜的清除作用

副溶血弧菌培养48h后形成成熟的生物膜，将不同浓度的辣木叶乙醇提取物和肉桂乙醇提取物及它们的1:1(v/v)复配物加入其中，同时设阴性对照，继续培养24h；然后分别测生物膜量、胞外多糖的产生量，计算清除率。结果表明，这些提取物对副溶血弧菌生物膜都有清除作用(附图20)；对副溶血弧菌胞外多糖也具有很强的清除能力(附图21)。注：相同字母表示两两之间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示两两之间差异显著(P＜0.05)。

实施例17 CLSM观察提取物对三种菌生物膜的抑制作用

激光共聚焦扫描显微镜除了能够观察细菌生物膜的平面图像，还能够对生物膜的立体结构进行三维扫描，而且在荧光染料的作用下还能够直观地观察胞外多糖及细胞的多少。通过CLSM观察细菌生物膜的形成及抑制情况，其结果如图22-24所示。注：a、b为对照组，c、d为实验组。

由图22可知，a中，细菌聚集较明显，多糖含量较多且主要分布在细菌周围，而c中多糖分布均匀，细菌分布相对分散；而b与d则清晰地表明了对照组的多糖厚度比实验组的要厚。因此，2×MIC浓度的大蒜提取物处理金黄色葡萄球菌除了能够杀死一部分的细胞外，还能抑制胞外多糖的分泌，从而减少生物膜的形成。

由图23可知，a中的多糖明显比c中的要多，而且多糖聚集比较明显且包围着细菌，而c中的多糖和细胞则非常分散；通过b和d的比较，可以很直观的看出多糖含量的变化。说明2×MIC浓度的肉桂提取物对大肠杆菌的生物膜形成具有很强的抑制作用。

由图24可知，通过a与c以及b与d的比较发现，在经过2×MIC浓度的肉桂提取物处理之后，死细胞的数量明显增多，而多糖含量明显减少，说明肉桂对副溶血弧菌具有较强的杀灭作用，且能够有效地减少胞外多糖的产生。

实施例18 CLSM观察提取物对三种菌生物膜的清除能力

提取物处理成熟的生物膜后，其结构的变化如附图25-27所示。注：a、b为对照组，c、d为实验组。

由图25可知，a中金黄色葡萄球菌培养48h后形成了生物膜，大量的胞外多糖聚集在细菌周围，而c中虽然有大量的细菌，但其多糖含量非常少，且都是死细菌，b与d相比也能够发现实验组多糖含量比对照组减少了很多，说明大蒜提取物出了能够杀死细菌，还能够在一定程度上清除生物膜的多糖。

图26是为肉桂提取物处理大肠杆菌生物膜前后的对比，由图可知，对照组的生物膜生长得比较均一，多糖包裹着细菌，且分布均匀。而经过处理之后，细菌分布比较分散，多糖含量减少，死细菌数量明显增多。说明肉桂对成熟的生物膜仍然具有较强的清除能力。

图27是为肉桂提取物处理副溶血弧菌生物膜前后的对比，由图可知，在对照组中副溶血弧菌生物膜形成量比较大，由多糖包裹着的生物膜，整体呈橙绿色，说明主要是由多糖组成，且死细菌较少。而在实验组中，大部分生物膜已经被清除掉，且颜色变为橙黄色，说明胞外多糖减少了且死细菌的数量增加。这些说明肉桂对副溶血弧菌的生物膜具有良好的清除能力。图22-27中，a、b、c、d主要用于体现对比效果。