本发明属于益生菌发酵饮料和食品技术领域，具体涉及利用多种益生菌以豆浆为基质混菌发酵生产益生菌功能性饮料和食品。
背景技术：
随着社会进步以及人民生活水平的提高，人们对营养的需求已超出单纯满足生存或者防止缺乏病的范畴，而且也作为防治疾病的重要手段。合理的膳食结构，是人类提高生存质量、延长生存年限、保持健康状态的有效方法。豆类食物属于五谷与水相融的食物，是四季皆宜的，既安全又营养。其中大豆中含有35％～40％的高质量的蛋白质，是植物性食物中含蛋白质最多的食品，完全可以用来替代动物性蛋白食用。大豆中含有8种人体必需氨基酸，而普通的谷物中普遍缺乏赖氨酸，食用大豆，可以与谷类蛋白互补，使人体摄入的氨基酸更加全面。大豆中含有20％脂肪、27％碳水化合物、丰富的矿物质和维生素，特别是钙、铁、维生素B1、维生素B2含量较高。此外，大豆中不含胆固醇，只有豆固醇，大豆异黄酮类的物质含量也非常高，因此，大豆具有降低人体血清胆固醇，防止乳糖不耐症、动脉硬化和脑溢血的功能。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，定植于宿主肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌可以通过刺激肠道内的免疫机能，将过低或过高的免疫活性调节至正常状态。益生菌这种免疫调节的作用也被认为有助于抗癌与抑制过敏性疾病。对于促进肠道消化系统健康也有一定的效果，益生菌可以抑制有害菌在肠内的繁殖，减少毒素，促进肠道蠕动，从而提高肠道机能，改善排便状况。用益生菌对豆浆进行发酵不仅仅能保留大豆原有的营养物质，发酵后能产生很多更易人体吸收的小分子物质，而且在发酵过程中还能产生特殊的香味，可以掩盖豆制品原有的特殊腥味。另外豆浆经益生菌发酵后能有效的提高大豆异黄酮的含量，对于延缓女性衰老、改善更年期症状、骨质疏松、血脂升高、心脏病、疏松症、心血管疾病等，并且大豆异黄酮显著的降低了乳腺癌的发病率，研究还指出在平时多食用富含大豆异黄酮的食物有助于抑制前列腺癌细胞的生长，研究显示，多吃低脂肪，富含大豆蛋白食品的人群患前列腺癌的概率会更低。
酸奶自从上市以来由于对肥胖、改善肠道功能、降低胆固醇以及预防心血管疾病都有一定的效果，深受广大消费者的喜爱，供不应求。当今发展中，国家人口的不断增加和蛋白质供给的相对匮乏，是造成了人口营养不良的首要原因。在动物性蛋白质严重不足,价格相对昂贵的情况下,要满足蛋白质的市场需求，迫使研究者的目光投向到植物蛋白的开发上来。由于豆浆经益生菌发酵后只含低量的饱和脂肪酸、而不含胆固醇和乳糖，使其具备营养与健康的双标签，并且大豆来源广泛、价格低廉，豆浆及其相关产品逐渐成为研究者关注的焦点。为了改善牛奶供应不足的情况，本发明提供了一种对豆浆进行发酵的技术。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明目的是利用多种益生菌、尤其利用青春双歧杆菌与植物乳杆菌的组合，以豆浆为基质混菌发酵生产高品质的益生菌功能性饮料或食品。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种豆浆发酵活菌型益生菌饮料，所述的活菌型益生菌饮料是以豆浆作为发酵基质，采用植物乳杆菌和青春双歧杆菌经混菌搅拌发酵后，进行无菌灌装获得的液态发酵产品，不添加食品添加剂。
本发明还提供一种豆浆发酵灭菌型益生菌饮料，所述的灭菌型益生菌饮料是以豆浆作为发酵基质，采用植物乳杆菌和青春双歧杆菌经混菌搅拌发酵后，进行灭菌、无菌灌装后获得的液态发酵产品，不添加食品添加剂。
本发明还提供一种豆浆发酵凝固型益生菌食品，所述的凝固型益生菌食品是以豆浆作为发酵基质，在包装容器中无菌灌装，采用植物乳杆菌和青春双歧杆菌直接在包装容器中混菌发酵后获得的凝固型发酵产品，不添加食品添加剂。
所述豆浆可以是黄豆或黑豆至少一种或再混入少量其他豆类，加水打浆过滤而得，也可以是各种市售豆浆。
所述植物乳杆菌在混菌发酵后的发酵产品中活菌数不少于1.0×108CFU/mL。
所述青春双歧杆菌在混菌发酵后的发酵产品中活菌数不少于1.0×108CFU/mL。
优选的，所述青春双歧杆菌是由本发明提供的一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，该菌株已于2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12784，分类命名为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。此株青春双歧杆菌具有良好的耐氧特性，能产生具有促进生物有丝分裂的活性物质，具有抗衰老的作用，并且是治疗腹泻的优选用药。TK99在pH4.5时有较强的生存能力，2h活菌数可达107CFU/mL以上，且能在含0.3％的胆汁盐中存活，2h活菌总数可达106CFU/mL以上。同时TK99对致病性大肠埃希菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌作用。
优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9(专利申请CN 105661230A),该菌株已于2015年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11891。此株植物乳杆菌具有较好的抗胃酸、抗胆盐的能力，在pH 3时2h存活率88.03％，0.3％胆盐4h存活率81.06％，并且具有广泛的抗真菌性，不需要添加额外的防腐剂，也可以延长饮料和食品保藏时间。
进一步地，所述豆浆发酵活菌型益生菌饮料的制备方法如下：
(1)菌种活化：植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％(v/w)接种于以豆浆为基质的活化培养基进行活化，pH 6.5-7.0，控制温度为37±1℃；分别活化0～20h后，按10％(v/w)的接种量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化16～24h后得二级种子液；
(2)混菌发酵：将植物乳杆菌和青春双歧杆菌分别按接种量为1×106～5×107CFU/mL接种于以豆浆为基质的发酵培养基中，搅拌转速为50～100r/min，第一阶段37℃发酵6～24h，第二阶段30℃发酵0～12h；
(3)发酵结束后进行无菌灌装后获得的液态发酵产品即为豆浆发酵活菌型益生菌饮料。
进一步地，所述豆浆发酵灭菌型益生菌饮料的制备方法如下：将所述豆浆发酵活菌型益生菌饮料在混菌发酵结束后进行灭菌，再无菌灌装后获得的液态发酵产品即为豆浆发酵灭菌型益生菌饮料。
优选的，所述灭菌的条件为95℃高温灭菌10min。
进一步地，所述豆浆发酵凝固型益生菌食品的制备方法如下：
(1)菌种活化：植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％接种于以豆浆为基质的活化培养基进行活化，pH6.5-7.0，控制温度为37±1℃；分别活化0～20h后，按10％(v/w)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化16～24h后得二级种子液；
(2)混菌发酵：以豆浆为基质的发酵培养基灭菌后，在包装容器中无菌灌装，将植物乳杆菌和青春双歧杆菌分别按接种量为106～107CFU/mL直接接种于各包装容器中，第一阶段37℃发酵6～24h，第二阶段30℃发酵0～12h，即得凝固型益生菌食品。
在上述豆浆发酵益生菌饮料或食品的制备方法中：
优选的，所述活化培养基为：黄豆或黑豆至少一种，或再混入少量其他豆类，加水打浆过滤，添加豆浆质量比1～10％的蔗糖，灭菌后为活化培养基。
所述活化培养基也可以为灭菌的市售含糖型豆浆，或市售无糖型豆浆添加质量比1～10％的蔗糖后灭菌。
所述发酵培养基为：活化培养基中添加质量比1～10％的南瓜粉、姜汁或其他果蔬汁中至少一种后灭菌。
优选的，所述混菌发酵的接种量为植物乳杆菌和青春双歧杆菌1:1。
优选的，所述混菌发酵为第一阶段37℃发酵8h，第二阶段30℃发酵4h。
有益效果：
豆浆作为一种高蛋白的营养食品，经益生菌发酵具有不同程度的抗氧化、降血压以及对心脑血管疾病的预防作用，调理肠道，本发明制备方法简单，益生菌发酵饮料和食品可以满足各类消费群体的需求。选择合适的植物乳杆菌和青春双歧杆菌混菌发酵，利用菌株间的协同发酵作用，既能提高产率、促进彼此生长繁殖，组合菌株的产酶、产酸和产营养物质以及对基质的分解利用能力等要显著优于单菌发酵或其它菌株组合形式，品质、口感较好且稳定，风味独特。
本发明经益生菌发酵后的豆浆功能性饮料或食品中活性成分含量显著提高，如大豆苷元、染料木素等可预防心血管疾病、改善骨质疏松及预防癌症；液态饮料中的总酚类物质可高达7.53(mg GAE/g)，该物质具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加身体抵抗力的作用并可防止动脉硬化和血栓的形成；液态饮料中的γ-氨基丁酸(GABA)达到2.489mg/g，对高血压具有缓解和治疗的功效；同时，抗氧化物含量能达到(0.0874mmol TE/g)。
本发明采用植物乳杆菌和青春双歧杆菌混菌发酵，首先，发酵后相对于植物乳杆菌或青春双歧杆菌单独发酵在活菌数大幅度提升的同时益生物质也有不同程度的提高；其次，青春双歧杆菌在生长过程中能产生促进细胞有丝分裂的活性物质，这种物质存在于青春双歧杆菌菌体内，而且在双歧杆菌菌体外也并不丧失活性，所以，使用含有青春双歧杆菌发酵的产品具有延年益寿，抗衰老的作用，另外，青春双歧杆菌也是治疗便秘和伪膜性肠炎的首选药物。因此，本发明豆浆益生菌发酵饮料的制备方法在活菌数大大提升的同时还能产生很多对人体有益的代谢产物。本发明提供的青春双歧杆菌TK99具有良好的耐氧特性，更利于工业化的生产，并且能产生与其他双歧杆菌相比更多的乳酸，这样可以有效地延长保质期，另外TK99对部分致病性革兰氏阳性菌具有抗性作用，植物乳杆菌TK9具有光谱抗真菌性，本发明益生菌饮料或食品在不添加任何化学添加剂的情况下保质期可以达到180天，并且产品本身品质和风味等不受影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中涉及到的物质检测方法，若未特别说明，利用GB/T 23788-2009方法测定大豆异黄酮含量；利用GB/T8143.2-89方法测定氨基态氮的含量；利用高效液相法测定GABA含量；利用福林酚反应测定总酚类含量；利用活氧指数法(ORAC)测定抗氧化物含量。
实施例中涉及到的发酵菌种，若未特别说明，所述植物乳杆菌均为TK9，所述青春双歧杆菌均为TK99，其他益生菌为商业菌种保藏机构购买菌种。
实施例中涉及到的培养基，若未特别说明，所述活化培养基为：黄豆或黑豆至少一种，或再混入少量其他豆类，加水打浆过滤，添加豆浆质量比1～10％的蔗糖，灭菌后为活化培养基；所述发酵培养基为：活化培养基中添加质量比1～10％的南瓜粉、姜汁或其他果蔬汁中至少一种后灭菌。
实施例1：
活菌型益生菌饮料发酵工艺的研究。
本实施例中以市售含糖型黄豆豆浆经灭菌后作为活化培养基，发酵培养基为活化培养基添加1-10％南瓜粉。
(1)发酵菌种的选择
将不同菌种甘油管分别按1％(v/w)接种于活化培养基进行一次活化，均活化18h，然后均按10％(v/w)的接菌量二次转接入活化培养基中，二次活化20h，在发酵培养基(活化培养基+5％南瓜粉)中接种1×107CFU/mL单菌或混菌的组合进行37℃发酵12h，搅拌转速50r/min。
混菌菌种组合优化结果及单菌或各混菌组合发酵后饮料中的益生菌总活菌数见表1所示。
表1单菌或不同混菌组合发酵后饮料中的益生菌总活菌数
结果：液态发酵饮料中混菌发酵更为优异，其中最优的菌种组合为植物乳杆菌和青春双歧杆菌的组合。
(2)接种量及接种比例的确定
将植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％(v/w)接种于活化培养基进行一次活化，均活化18h，然后均按10％(v/w)的接菌量二次转接入活化培养基中，二次活化20h，在发酵培养基中选择不同的接种量以及接种比例，37℃混菌发酵12h，通过发酵后饮料中的益生菌总活菌数对接种量以及接种比例进行优化，结果如表2所示。
表2植物乳杆菌与青春双歧杆菌混菌发酵对接种量优化的益生菌总活菌数
结果：在植物乳杆菌和青春双歧杆菌的接种比例为1:1、接种量分别为1.0×107CFU/mL时，发酵后益生菌活菌总数最高，能达到1.5×109CFU/mL。
(3)发酵形式的影响
将植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％(v/w)接种于活化培养基进行一次活化，均活化18h，然后均按10％(v/w)的接菌量二次转接入活化培养基中，二次活化20h，在发酵培养基中接种植物乳杆菌和青春双歧杆菌，接种量均为1.0×107CFU/mL，接种比例为1:1，搅拌转速为100r/min，对发酵温度和发酵时间进行优化。结果如表3和表4所示。
表3发酵时间对益生菌活菌数的影响(活菌数单位：CFU/mL)
表4分段发酵对益生菌活菌数及口味的影响
结果：37℃发酵12h活菌数最高，但30℃发酵可以明显的改善豆浆发酵饮料的口感，所以本产品采用分段发酵的方式，优选的发酵时间为第一阶段37℃8h、第二阶段30℃4h。
实施例2：
豆浆发酵活菌型益生菌饮料。
将植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％(v/w)接种于活化培养基进行一次活化，均活化18h，然后均按10％(v/w)的接菌量二次转接入活化培养基中，二次活化20h；在发酵罐的发酵培养基中接种植物乳杆菌和青春双歧杆菌，接种量分别为1.0×107CFU/mL，接种比例为1:1，搅拌发酵，转速为60r/min，第一阶段37℃发酵8h，第二阶段30℃发酵4h，对致病菌进行检测，在无菌条件下进行灌装成产品。
发酵结束测定发酵产品中各活性成分含量的变化，用同样的方法测定植物乳杆菌或青春双歧杆菌单菌发酵产品中各活性成分含量的变化。结果如表5和表6所示。
大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。与雌激素有相似结构，大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，具有较强的抗氧化性和抗真菌活性，是天然的癌症化学预防剂，它还可防止骨质疏松症、肾炎以及自身免疫的疾病。大豆异黄酮是一种具有多种重要生理活性的天然营养因子，是纯天然的植物黄酮类化合物雌激素，容易被人体吸收，能迅速补充营养。
表5活菌型益生菌饮料中活性物质的测定
表6活菌型益生菌饮料中致病菌的检测
结果：无致病菌检出，其他均符合国际制品安全标准。
实施例3：
豆浆发酵灭菌型益生菌饮料。
将植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％(v/w)接种于活化培养基进行一次活化，均活化18h，然后均按10％(v/w)的接菌量二次转接入活化培养基中，二次活化20h；在发酵罐的发酵培养基中接种植物乳杆菌和青春双歧杆菌，接种量分别为1.0×107CFU/mL，接种比例为1:1，搅拌发酵，转速为60r/min，第一阶段37℃发酵8h，第二阶段30℃发酵4h，90℃杀菌10min，对致病菌进行检测，在无菌条件下灌装成产品。
测定饮料保藏时间对质量的影响。测定发酵产品中各活性成分含量的变化，用同样的方法测定植物乳杆菌或青春双歧杆菌单菌发酵产品中各活性成分含量的变化。结果如表7-9所示。
表7致病菌的检测
结果：无致病菌检出，其他均符合国际制品安全标准。
表8保藏时间对产品质量的影响
表9灭菌型益生菌饮料中活性物质的测定
综上可以看出，植物乳杆菌和青春双歧杆菌混菌发酵的活菌数明显高于单菌发酵的活菌数，发酵产物中活性物质如大豆苷元、染料木素等含量显著增加，该成分具有预防心血管疾病、改善骨质疏松及预防癌症的功效；混菌发酵后的总酚类以及抗氧化物含量也有明显提高，该物质可抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂及增加身体抵抗力，并可防止动脉硬化和血栓的形成；并且发酵产物中的γ-氨基丁酸(GABA)对高血压具有缓解和治疗的功效。豆浆发酵饮料中益生物质有明显的增加，营养丰富，更加有益于身体的健康。
实施例4：
豆浆发酵凝固型益生菌食品。
将植物乳杆菌和青春双歧杆菌甘油管分别按1％(v/w)接种于活化培养基进行一次活化，均活化18h，然后均按10％(v/w)的接菌量二次转接入活化培养基中，二次活化20h；在灌装在包装容器中的发酵培养基中接种植物乳杆菌和青春双歧杆菌直接发酵，接种量分别为1.0×107CFU/mL，接种比例为1:1，第一阶段37℃发酵8h，第二阶段30℃发酵4h，即为成品。
测定发酵产品中各活性成分含量的变化，用同样的方法测定植物乳杆菌或青春双歧杆菌单菌发酵产品中各活性成分含量的变化。
表10凝固型益生菌食品中活性物质的测定