一种具有降压功能的扇贝裙边发酵产物的制作方法与流程

本发明涉及扇贝食品加工技术领域，尤其涉及一种具有降压功能的扇贝裙边发酵产物的制作方法。

背景技术：

纳豆菌是1905年由日本学者从日本传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的，属细菌科、芽孢杆菌属，被鉴定为枯草芽孢杆菌的一个亚种，是对人体无病原性的安全菌株。许多研究表明，纳豆菌在发酵过程中，可以产生以纳豆激酶为典型代表的活性酶，发酵产物具有纤溶、降胆固醇、降血脂、降血压、抗菌和抗氧化等多种营养保健功能。

扇贝是我国重要经济海产品之一，产量仅次于牡蛎和蛤类，是我国第三大经济贝类。在加工贝类制品的过程中，产生了碎小贝柱和扇贝贝边等下脚料。加工1kg扇贝柱，需9kg扇贝，产生扇贝裙边2.5kg。扇贝裙边中含有丰富的蛋白质、微量元素、维生素B₁₂、叶酸等营养成分，是一种高蛋白低脂肪低糖类的食料，其中蛋白含量达67.83％。研究表明扇贝裙边中含有多种活性物质，具有一定的抗衰老、抗肿瘤和抗病毒等生物功能。将占扇贝重量30％的扇贝裙边进行开发利用，进行精深加工，将更大程度的提高其附加值，解决资源浪费和环境污染等问题，而且更有利于提高人类生活质量和身体健康。

高血压(Hypertension)是指以体循环动脉血压(收缩压或舒张压)增高为主要特征，可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征。高血压是最常见的慢性病，也是心脑血管病最主要的危险因素，严重威胁全人类健康。临床降压药都具有较强副作用，且药效不稳定。开发具有降压功能的食品，辅助或替代药物治疗是今后健康领域重要研究趋势。

技术实现要素：

本发明的目的在于拓宽扇贝生产副产品——扇贝裙边的利用率，避免资源浪费、环境污染，开发一种营养丰富、易于制作、具有高附加值的性扇贝裙边产品；同时，提升扇贝裙边产品的功能性，得到具有降压功能、以扇贝裙边为原料的产品。

为了达到上述目的，本发明提供了一种具有降压功能的扇贝裙边发酵产物的制作方法，包括如下步骤：

S1、原料预处理：取扇贝裙边去杂质、洗净、沥干，在-80℃预冻4～24h，冻干、粉碎，得到扇贝裙边干粉，备用；

S2、制作基础培养基：将步骤S1制得的扇贝裙边冻干粉与水按质量体积比1:10～50(g/mL)混合，得到混合液；向所述混合液中加入蔗糖，加入盐酸或氢氧化钠调节初始pH至6.2～10.2，制得扇贝裙边基础培养基；

所述蔗糖加入量与制得的所述扇贝裙边基础培养基的质量体积比为2～6:100g/mL；

S3、灭菌：将步骤S2制得的培养基置于121℃环境下，灭菌20min，得到灭菌培养基；

S4、接种及发酵：待步骤S3制得的灭菌培养基冷却到40～55℃后，加入所述灭菌培养基体积2～5％的纳豆菌菌悬液，所述灭菌培养基中纳豆菌的终浓度为10⁶～10⁸CFU/mL；在31～43℃、通风条件下，在转速为140～260r/min的摇床中培养24～60h，获得扇贝裙边发酵液；

S5、将步骤S4制得的扇贝裙边发酵液在7000r/min下离心20min，收集上清液；将所述上清液进行浓缩、冻干，得到具有降压功能的扇贝裙边发酵产物。

优选方式下，步骤S1在-80℃预冻时间为4～10h。

优选方式下，步骤S2所述蔗糖的浓度为4g/100mL。

优选方式下，步骤S2中，加入NaOH调节pH至8.2。

优选方式下，步骤S4为：待步骤S3制得的灭菌发酵混合物冷却到40～55℃后，加入所述灭菌培养基体积4％的纳豆菌菌悬液，所述灭菌培养基中纳豆菌的终浓度为10⁷CFU/mL；在37℃、通风条件下，在转速为180r/min的摇床中培养36h，获得扇贝裙边发酵液。

本发明的优点在于：

1、本发明先将含有扇贝裙边的培养基经高压高温(121℃，20min)处理，提高扇贝裙边对纳豆菌发酵过程中所分泌蛋白酶的敏感度，使液态发酵系统中的纳豆菌更好的利用扇贝裙边蛋白产生具有生物活性的产物。通过Folin-酚的方法测定可溶性蛋白结果显示，即将进行发酵的扇贝裙边样品由于高压处理，使热敏感蛋白溶出，蛋白含量达7.3mg/mL，发酵后蛋白含量可达到12.3mg/mL；TCA结合Folin-酚的方法测定样品多肽含量发现，准备进行发酵的扇贝裙边样品中的多肽含量约为0.2mg/mL，而发酵后所得扇贝裙边发酵产物中多肽含量可达7mg/mL。

2、本发明以扇贝裙边为原料，采用纳豆菌发酵，所得发酵产物具有良好的降压溶栓活性。本发明方法制得的扇贝裙边发酵产物作为一种新型发酵食品，可在一定程度上丰富扇贝裙边的利用方法，同时具有一定程度上降压溶栓等生物活性。

3、本发明原料蛋白含量高，制作过程中原料利用率高，在原料预处理阶段省时省力，相对于以低蛋白含量原料为发酵底物的现有技术，节约资源及能源，节约了生产成本。

4、本发明方法制得的扇贝裙边产物可以应用于功能食品、饲料、调味品等方面，拓展了扇贝裙边的综合利用途径。

综上，本发明将扇贝裙边经纳豆菌发酵，不但可产生具有溶解血栓作用的酶类物质，扇贝裙边中的蛋白还被降解成分子量更小的蛋白和多肽，增加了发酵产物多肽含量，利于消化吸收，同时，进一步丰富了发酵产物的功能性，使发酵产物具有溶栓降压等多种复合生物活性。本发明采用的原料为扇贝加工的副产品——扇贝裙边，提供了扇贝的利用率，避免了资源浪费、环境污染，丰富了扇贝类产品的形式，提高了扇贝产品的附加值，具有一定的现实意义和深远的经济价值。

附图说明

图1是扇贝裙边发酵过程中TCA可溶性寡肽的变化；

图2是扇贝裙边发酵过程中可溶性蛋白的变化；

图3是扇贝裙边发酵过程中溶栓活性的变化；

图4是扇贝裙边和豆粉发酵36h后的血管紧张素转换酶(ACE)抑制率；

图5是扇贝裙边和豆粉发酵36h后的抗凝血活性；

图6是扇贝裙边和豆粉发酵60h后的血管紧张素转换酶(ACE)抑制率。

具体实施方式

本发明公开了一种具有降压功能的扇贝裙边发酵产物的制备方法，包括如下步骤：将扇贝裙边洗净、去杂质、沥干，冻干粉碎，得到扇贝裙边冻干粉，备用；将扇贝裙边冻干粉与水按质量体积比1:10～50(g/mL)混合，蔗糖加入量为2～6g/100mL，加入盐酸或氢氧化钠调节初始pH至6.2～10.2，制得扇贝裙边基础培养基，在121℃下灭菌20min后，加入纳豆菌菌悬液体积为基础培养基的2～5％，于31～43℃、通风条件下，在转速为140～260r/min的摇床中培养24～60h，获得扇贝裙边发酵液；将扇贝裙边发酵液在7000r/min下离心20min，收集上清液；将所述上清液，经浓缩、冻干，得到具有降压功能的扇贝裙边发酵产物。本发明将扇贝裙边经纳豆菌发酵，不但可产生具有溶解血栓作用的酶类，扇贝裙边中的蛋白还被降解成分子量更小的蛋白和多肽，利于消化吸收；进一步增加了发酵产物的功能性，使发酵产物充分发挥降压溶栓等多种复合生物活性。

本发明实施例及对比例采用下述方法进行表征：

测试1：三氯乙酸(TCA)结合Folin-酚法测可溶性寡肽含量的方法如下：

发酵样品100μL加入100μL浓度为20％TCA，震荡混匀，静置20min，16500g/min下离心15min，取上清进行稀释，取稀释后的待测样品100μL，利用Folin-酚的方法测定可溶性寡肽含量，加入Folin-酚甲液500μL，室温反应10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反应30min，500nm测吸光度，根据标准曲线确定可溶性寡肽含量。标准曲线绘制如下：用结晶牛血清蛋白，根据其纯度配制成0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL，依次加入500μl Folin-酚甲液，混匀。室温下放置10min，再加入50μl Folin-酚乙液，立即振荡均匀，室温下放置30min。然后，在500nm波长下，用酶标仪测定吸光度。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光度(500nm)为纵坐标，绘制标准曲线。

测试2：Folin-酚法测可溶性蛋白的测定方法如下：

取稀释后的待测样品100μL，利用Folin-酚的方法测定可溶性蛋白含量，加入Folin-酚甲液500μL，室温反应10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反应30min，500nm测吸光度，根据标准曲线确定可溶性蛋白含量。标准曲线绘制同测试1。

测试3：溶栓活性的测定方法如下：

取0.7mL硼酸缓冲液(0.05mol/L)置于样品管中，再加入0.2mL纤维蛋白原(0.72％)，于37℃水浴预5min，加入0.05mL凝血酶(1BP/mL)，37℃水浴使纤维蛋白凝固，准确计时10min，加入待测样品0.05mL，混匀5s，于37℃水浴反应，分别于20min和40min时，混匀5s，60min后，加入TCA(0.2mol/L)溶液1mL，充分混匀，在37℃水浴保温20min后，3000r/min，离心10min，取上清，12000r/min再次离心10min。取上清于275nm测定吸光度。空白管中先加TCA(0.2mol/L)混匀5s以灭酶，然后加待测样品。其它操作相同。标准曲线绘制，将蚓激酶配制成0、1、2、4、6、8FU/μL的酶液，分别按照上述方法测定蚓激酶溶栓活性，绘制标准曲线。酶活力计算，样品吸光度减空白组吸光度，代入标准曲线，计算样品溶栓的酶活力。

测试4：ACE抑制活性的测定方法如下：

ACE抑制活性空白组：于1.5mL离心管中，取25μL超纯水，加入25μL的ACE(酶活为0.047U/mL)，漩涡震荡2min，37℃保温5min。加入50μL，5mmol/L底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)，37℃保温，反应1h。然后加入20μL，0.2MHCl终止反应。反应液过孔径为0.45μm的膜后，用HPLC(Waters)检测马尿酸(HA)生成量。

ACE抑制活性样品组：于1.5mL离心管中，取25μL发酵液，加入25μL的ACE(酶活力为0.047U/mL)，漩涡震荡2min，37℃保温5min。加入50μL，5mmol/L底物HHL，37℃保温，反应1h。然后加入20μL，0.2MHCl终止反应。反应液经孔径为0.45μm的膜过滤后，用HPLC(Waters)检测HA生成量。

A：加入发酵样品组中HA的峰面积；

B：空白对照组中HA的峰面积。

测试5：抗凝血活性测定方法如下：

抗凝血活性测定：将30份来自健康人体检的血液，加入3.8％枸橼酸钠作为抗凝剂，混合均匀，以3000r/min离心15min，收集血浆。将待测血浆加入试管，每管0.9mL，加入发酵产物0.1mL。按试剂盒说明书操作，测定TT、PT、APTT。

TT、PT、APTT是检测凝血功能的常见指标。TT是反映凝血酶活性及纤维蛋白原含量的指标，健康人TT为14.0～21.0s；PT主要反映外源性凝血途径的功能，健康人PT在9.5～15.5s；APTT主要反映内源性凝血途径有关因子的活性，健康人APPT为23.0～43.0s。

本发明以扇贝裙边为生产原料，以黄豆冻干粉作为扇贝裙边发酵产物降压和抗凝血活性测的对比例。经凯氏定氮法测定黄豆冻干粉中总蛋白含量约为39％(干基)，扇贝裙边中总蛋白含量约为74％(干基)。

实施例1

取扇贝裙边冻干粉2.97g(总蛋白含量＝扇贝裙边样品质量×扇贝裙边总蛋白含量＝2.97g×74％＝2.2g)，加入40mL去离子水，加入1.2g蔗糖，用NaOH调整培养基pH到8.2，将培养基封口，置于121℃灭菌20min，待灭菌结束后，取出灭菌培养基。待灭菌培养基温度在40～55℃时，加入2mL纳豆菌菌悬液，使培养基中菌浓度最终达到10⁷CFU/mL，将纳豆菌菌悬液与灭菌培养基充分混合后，置于37℃，180r/min的摇床中，通风培养0～72h。

每隔12h取发酵液一次，采用TCA结合Folin-酚法测可溶性寡肽含量的方法测定本实施例发酵过程中，发酵产物中的TCA可溶寡肽含量，如图1所示；采用Folin-酚法测可溶性蛋白含量的方法测定本实施例发酵过程中，发酵产物上清液蛋白含量，如图2所示，由于高温高压使扇贝裙边中的部分蛋白溶出，使0h上清液有一定的蛋白含量约7.3mg/mL，随着发酵的进行，蛋白含量逐渐增加，36h时，蛋白含量达到最大值12.3mg/mL，之后蛋白略有下降，60～72h基本趋于稳定。

0h时，有一定的蛋白含量但是TCA可溶性寡肽含量很低约0.2mg/mL，说明在0h时高温高压溶出的扇贝裙边蛋白并未被纳豆菌分解，随着发酵时间的延长，TCA可溶性寡肽含量明显增加，说明纳豆菌利用了培养基中的大分子蛋白，使其降解为小分子蛋白和多肽，发酵36h时TCA可溶性肽含量达到最高约7mg/mL，之后略有下降。

每隔12h取发酵液一次，经过7000r/min离心20min后，取上清液进行按照测试3溶栓活性测定，结果如图3，可以发现，本发明制得的扇贝裙边发酵产物具有溶栓效果，能够用于血栓性疾病的辅助治疗和控制。

实施例2

取冻干后的扇贝裙边，打粉，取6g(总蛋白含量＝扇贝裙边样品质量×扇贝裙边总蛋白含量＝6g×74％＝4.44g)，加水至100mL，加入蔗糖3g，调整pH为8.2，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，接入5mL纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养36h。发酵液经过7000r/min离心20min，得到具有扇贝裙边发酵液85mL，通过Folin-酚法测定上清液中蛋白含量为15mg/mL，上清液经过浓缩、冻干、粉碎后得到发酵产物1.3g，蛋白回收率为29％。

蛋白回收率＝发酵后蛋白含量/总蛋白×100％

对比例1

取冻干后的黄豆，打粉，取11.38g(总蛋白含量＝黄豆粉样品质量×黄豆粉总蛋白含量＝11.38g×39％＝4.44g)，加水至100mL，加入蔗糖3g，调整pH为8.2，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，接入5mL纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养36h。发酵液经过7000r/min离心20min，得到具有扇贝裙边发酵液70mL，通过Folin-酚法测定上清液中蛋白含量为28mg/mL，上清液经过浓缩、冻干、粉碎后得到发酵产物1.96g，蛋白回收率为44％。

蛋白回收率＝发酵后蛋白含量/总蛋白×100％

取上述实施例2和对比例1的发酵产物，按照测试4方法检测发酵产物的ACE抑制活性，检测结果如图4；按照测试5的方法检测发酵产物的抗凝血活性，并用生理盐水做空白对照，检测结果如图5。

图4结果显示，发酵36h后扇贝裙边具有明显的ACE抑制活性，即降压活性，但略微小于同等条件下发酵的黄豆粉，说明扇贝裙边经纳豆菌发酵可以产生具有降压功能的多肽类物质，且降压功能良好，能够用于高血压及血栓性疾病的辅助治疗和控制。图5结果显示，发酵36h后，豆粉和扇贝裙边的抗凝血活性基本相当，且都在正常水平范围内。

实施例3

取冻干后的扇贝裙边，打粉，取6g(总蛋白含量＝扇贝裙边样品质量×扇贝裙边总蛋白含量＝6g×74％＝4.44g)，加水至100mL，加入蔗糖3g，调整pH为8.2，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，接入5mL纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养60h。发酵液经过7000r/min离心20min，得到具有扇贝裙边发酵液87mL，通过Folin-酚法测定上清液中蛋白含量为18mg/mL，上清液经过浓缩、冻干、粉碎后得到发酵产物1.6g，蛋白回收率为36％。

蛋白回收率＝发酵后蛋白含量/总蛋白×100％

对比例2

取冻干后的黄豆，打粉，取11.38g(总蛋白含量＝黄豆粉样品质量×黄豆粉总蛋白含量＝11.38g×39％＝4.44g)，加水至100mL，加入蔗糖3g，调整pH为8.2，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，接入5mL纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养60h。发酵液经过7000r/min离心20min，得到具有扇贝裙边发酵液70mL，通过Folin-酚法测定上清液中蛋白含量为30mg/mL，上清液经过浓缩、冻干、粉碎后得到发酵产物2.1g，蛋白回收率为47％。

蛋白回收率＝发酵后蛋白含量/总蛋白×100％

取上述实施例3和对比例2的发酵产物，按照测试4方法检测发酵产物的ACE抑制活性，检测结果如图6。发酵60h后，扇贝裙边和豆粉发酵产物的ACE抑制活性均有提高，但扇贝裙边提高幅度较大，且60h时，发酵的扇贝裙边ACE抑制活性高于发酵的豆粉，说明随着发酵时间的延长，会有大量ACE抑制肽的释放，因此，发酵产物能应用于降压功能产品的研制及高血压性疾病的辅助治疗。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。