一种新的燕窝提取液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种新的燕窝提取液及其制备方法和其应用，特别是该制备方法，可得到燕窝多肽和高浓度游离唾液酸的燕窝提取液，该燕窝提取物可用于保健品、食品和美容产品当中。

背景技术：

燕窝是雨燕科金丝燕属的鸟类，分泌出的唾液或唾液与其绒羽混合凝结于悬崖峭壁上，而筑成的巢窝。主产地为印度尼西亚、马来西亚、越南、泰国等，据《本草拾遗》记载："燕窝甘淡平，大养肺阴，化痰止咳，补而能清，为调理虚劳之圣药，一切病之由于肺虚，而不能肃清下行者，用此皆可治之。"中医认为燕窝："养阴润燥、益气补中、治虚损、咳痰喘、咯血、久痢，适宜于体质虚弱，营养不良，久痢久疟，痰多咳嗽，老年慢性支气管炎、支气管扩张、肺气肿、肺结核、咯血、吐血和胃痛病人食用。现代研究发现，燕窝可改善免疫功能、促进细胞再生、对抗流感病毒、亦有抗氧化、美白等功能。

燕窝的主要成分为蛋白、氨基酸、唾液酸、矿物质以及微量元素。其中蛋白质的主要成分为大分子糖蛋白，分子量大，人体难吸收。将大分子量的燕窝蛋白分解为小分子的肽组合物，易于消化被人体吸收，大大提高其生物利用度。

唾液酸是燕窝的重要活性成份之一，文献报道约占整个燕窝的9％，但多以结合状态存在。它能有效对抗流感的入侵并保护肺部功能，同时可抑制酪氨酸酶,有美白功效。结合状态唾液酸是与聚醣链结合,而聚醣链又与蛋白相连,不容易释出成游离状态，所以自然界游离唾液酸很少。

目前市场上有很多燕窝产品,大多数是以蒸煮的较单一的粗加工的方式进行提取，通常还保留几乎完整的大分子形式，但大分子蛋白的生物利用度一般比较低。有些使用超声粉碎燕窝，然后再加酶水解；除了酶促水解步骤外，现有的技术还需要经过粉碎、浸泡、煮沸、调节ph值等预处理步骤来提高水解的效率，工艺繁复，产品蛋白收率低。按此方法得到的燕窝提取物不仅活性成分含量低，且还可能含有各种添加剂。所以，提供一种燕窝活性成分高、生物利用高的燕窝提取液的制备方法具有非常重要的意义。

2010年,第一代的燕窝提取液(制备方法参见中国专利号:zl201010162516.8),透过快速检测燕窝的游离唾液酸能有效鉴定其品质,是通过超声提取10分钟，其游离唾液酸的含量仅为燕窝重量的0.01-0.1％,燕窝蛋白的释放不足2％。2013年,第二代燕窝提取液(制备方法参见中国专利号:zl201310391376.5)，应用炖煮技术,把燕窝完成炖溶于水,其蛋白提取率大幅提升到70-90％,游离唾液酸的释出增至0.2-3.8％,并成功应用于美容护肤产品。

本发明将通过进一步优化该提取方法,通过加入模拟人工胃液和胃蛋白酶，使游离唾液酸达到全释出,同时将燕窝的大分子蛋白分解成小份子肽,使其易于被人体易于吸收,我们称之为第三代燕窝提取工艺。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的之一在于提供一种燕窝第三代提取液的制备方法，该方法成本低，简单易操作，且由该法得到的提取液主要含有燕窝多肽和高浓度游离唾液酸。

实现上述目的技术方案如下：

一种燕窝提取液的制备方法，包括以下步骤：

a)以燕窝重量30-100倍的水浸泡燕窝，室温浸泡时间为1.5-12小时，过滤得到燕窝滤渣；所述燕窝是白燕或黄燕的燕窝；以燕窝重量30-100倍的水炖煮所述燕窝滤渣，炖煮时间为3-24小时，得到初步的燕窝提取液；将提取液冷冻干燥,得到燕窝提取物冰冻干燥粉；

或所述燕窝为血燕的燕窝时，以燕窝重量30-100倍的水浸泡燕窝，室温浸泡时间为12-26小时，过滤得到燕窝滤渣；

以燕窝重量30-100倍的水炖煮所述燕窝滤渣，炖煮时间为15-74小时，得到初步的燕窝提取液；将提取液冷冻干燥,得到燕窝提取物冰冻干燥粉；

b)将燕窝提取物冰冻干燥粉和胃蛋白酶粉混合,其重量比例为12-18:1,每50毫克燕窝提取物的冰冻干燥粉中加入4-6毫升的模拟胃酸酸液(加入燕窝的冰冻干燥粉重量的80-120倍模拟胃酸酸液(w/v))，所述模拟胃酸酸液的ph为1-3,放在37±1℃的水浴进行消化；

c)消化1-72小时后收取提取液,加入氢氧化钠中和及降解胃蛋白酶,其ph值为8-10，即得。

本发明的另一地目的是提供一种燕窝提取液。

具体技术方案为：根据上述制备方法得到的燕窝提取液。

在其中一个实施例中，所述燕窝为白燕窝、黄燕窝和红燕窝(或称血燕)。

在其中一个实施例中，所述燕窝可是燕盏、燕条、燕丝、燕饼、燕角、燕碎。

在其中一个实施例中，所述消化时间为8-56小时，更优选为32-48小时。

在其中一个实施例中，所述模拟胃酸酸液的ph为1-3，其中含有0.07m盐酸和0.1m氯化钠。

根据本发明燕窝提取液制备方法得到的燕窝提取液，其采用人工模拟胃酸酸解燕窝水提取物1-72小时，优选8-56小时，获得含有小分子肽的组合物，经高效液相色谱法-质谱联检测，所述肽的分子量主要分布在6.5kda之下，同时增强其重要活性成分燕窝唾液酸的释出,释出率可达燕窝重量的8-12％。

本发明的另一个目的是提供上述燕窝提取液的应用。

上述燕窝提取液可用于制备美白、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗病毒，提高机体免疫力的保健品、食品和美容产品、饮料。

本发明所述的燕窝提取液及其制备方法具有以下优点和有益效果：

本发明找到了适合燕窝提取物的消化方法，可应用于工业，具有简单易操作的特点，该工艺仅需提取和37℃消化两个主要步骤，制备工艺简单,适合大量生产。

本发明通过优化燕窝提取物的消化方法,找出将燕窝唾液酸的最大量释出的方法，同时将燕窝蛋白大分子消化成分子量在6.5kda左右的多肽，使燕窝的主要活性成份更易于被人体吸收。

按照该方法所制得的燕窝提取液，游离唾液酸含量提高，同时将燕窝蛋白大分子消化成分子量在6.5kda左右的多肽。本发明提供的燕窝提取物不仅能提供人体生长发育所需要的营养物质，具有独特的生物学功能，能够抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗病毒，提高机体免疫力。美白能力比第一、二代的提取液更高,同时保留其抗氧化作用。该燕窝提取液可加工为各种产品，广泛地用于保健品、食品、饮料、食品添加剂、营养强化剂或美容用品中，具有巨大的市场潜力。

附图说明

图1为实施例2白燕窝提取液在不同消化时间点收集的hplc图谱。燕窝消化液用superdex7510/300gl分子筛色谱柱分离，在280nm检测蛋白质的吸光度，反映其消化效率。蛋白质标记物为已知分子量的蛋白质为指标。

图2白燕窝色谱图主峰a在不同时间点的峰面积,8小时后,超过90％的燕窝大分子量的蛋白已被消化；48小时基本完全消化。

图3为实施例2黄燕窝提取液在不同消化时间点收集的hplc图谱。

图4黄燕窝色谱图主峰a在不同时间点的峰面积,8小时后,超过90％的燕窝大分子量的蛋白已被消化；48小时基本完全消化。

图5为实施例2红燕提取液在不同消化时间点收集的hplc图谱。

图6红燕色谱图主峰a在不同时间点的峰面积,48小时后,超过90％的燕窝大分子量的蛋白已被消化。

图7为实施例3在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸标准曲线,线性大于0.995。

图8为实施例3在不同时间点收集的白燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸含量,48小时后,燕窝的唾液酸已释放到最大。

图9为实施例3在不同时间点收集的黄燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸含量,48小时后,燕窝的唾液酸已释放到最大。

图10为实施例3在不同时间点收集的红燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸含量,48小时后,燕窝的唾液酸已释放至最大。

图11为实施例4第一、二、三代的白燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,对酪氨酸酶活性的抑制作用结果；抑制作用越高,美白效果越强。

图12为实施例4第一、二、三代的黄燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,对酪氨酸酶活性的抑制作用结果；抑制作用越高,美白效果越强。

图13为实施例4第一、二、三代的红燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,对酪氨酸酶活性的抑制作用结果；抑制作用越高,美白效果越强。

图14为实施例5第一、二、三代的白燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,抗氧化能力测试结果。

图15为实施例5第一、二、三代的黄燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,抗氧化能力测试结果。

图16为实施例5第一、二、三代的红燕窝提取液,包括燕盏和燕碎,抗氧化能力测试结果。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。

实施例1

本实施例所述的燕窝提取液的制备方法，包括以下步骤：

a)以燕窝重量30-100倍的水浸泡燕窝，室温浸泡时间为1.5-12小时，过滤得到燕窝滤渣；所述燕窝是白燕或黄燕的燕窝；

以燕窝重量30-100倍的水炖煮所述燕窝滤渣，炖煮时间为3-24小时，得到初步燕窝提取液(第二代燕窝提取液)，将提取液冷冻干燥,得到燕窝提取物冰冻干燥粉；

或

所述燕窝为血燕的燕窝时，以燕窝重量30-100倍的水浸泡燕窝，室温浸泡时间为12-26小时，过滤得到燕窝滤渣；

以燕窝重量30-100倍的水炖煮所述燕窝滤渣，炖煮时间为15-74小时，得到初步燕窝提取液(第二代燕窝提取液)；将提取液冷冻干燥,得到燕窝提取物冰冻干燥粉；

b)将50毫克的燕窝提取物冰冻干燥粉加上3.8毫克的胃蛋白酶,加上5毫升的模拟胃酸酸液,所述模拟胃酸酸液含有0.07m盐酸和0.1m氯化钠,调节ph为1-3，然后放在37℃的水浴进行消化；

c)消化1-72小时后收取液,加入0.7m氢氧化钠中和及降解胃蛋白酶,调节其ph值为8-10，其中消化0小时做为对照。

实施例2

本实施例所述的燕窝提取液的制备方法，以高效液相色谱法检测燕窝提取液消化效率，包括以下步骤：

a)按照实施例1所述制备方法得到的燕窝提取液中和后,用亲水性0.45μm的过滤膜过滤。

b)高效液相色谱分离

1.仪器：hplc柱：superdex7510/300gl(ge生命科学)

2.层析条件：流速0.5ml/min，进样量10μl

3.层析时间:70分钟

4.流动相：磷酸盐缓冲生理盐水

5.dad吸亮度:280nm

c)测定结果

在不同时间的收集白燕窝、黄燕窝和红燕窝提取液的尺寸排阻色谱,其分子量由不同大小的蛋白质物作为标记可以阐明燕窝蛋白的消化情况,包括抑肽酶(6.5kda)、核糖核酸酶a(13.7kda)、碳酸酐酶(29kda)、卵清蛋白(43kda)、伴清蛋白(75kda)和蓝色葡聚醣(>2000kda)(图1,3,5)。

其主峰a的在不同时间的面积进行积分,计算消化效率。白燕盏和白燕碎,经过48小时消化后,主峰a面积只剩不到1％(图2),结果表示采用人工模拟胃酸酸解白燕窝,消化效率可达99％,而且大部份燕窝肽已小于6.5kda。

黄燕盏和黄燕碎,经过48小时消化后,主峰a面积只剩不到1％(图3和图4),结果表示采用人工模拟胃酸酸解黄燕窝,消化效率可达99％,而且大部份燕窝肽已小于6.5kda。

红燕盏和红燕碎,经过48小时消化后,主峰a面积只剩不到40％(图5和图6),结果表示采用人工模拟胃酸酸解红燕窝,消化效率可达60％,而且大部份燕窝肽已小于6.5kda。

实施例3

本实施例所述的燕窝提取液的制备方法，以高效液相色谱法-质谱联用检测燕窝提取液的游离唾液酸的含量，包括以下步骤：

a)将按照实施例1所述制备方法得到的燕窝消化液中和后,用0.1％甲酸稀释40倍,加入内标。

b)高速离心5分钟,取上清液进样。

c)标准溶液的制备:精密量取10mgn-乙酰-d-神经胺酸，置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀后即得1mg/mln-乙酰-d-神经胺酸标准溶液。

d)液相色谱

条件如下：

1.仪器：hplc柱：eclipsexdb-c18(2.1×100mm,3.5μm)色谱柱

2.层析条件：流速0.3ml/min，进样量5μl。

e)质谱检测

条件如下：

雾化压力：40psi；

干燥气温度：325℃；

干燥气(n2)流速：10.0l/min；

毛细管电压：3500v；

检测极性：negative；

扫描模式：多级反应监测(mrm)方式；

检测离子对：包括检测唾液酸的两对母离子-子离子对，m/z307.9→87.0和m/z307.9→170.0；

碎片电压：135v；

碰撞能：5ev。

e)测定方法

1.标准曲线的绘制

将1mg/mln-乙酰-d-神经胺酸(n-acetyl-d-neuraminicacid)标准溶液加合0.1％formicacid的水稀释至0.00，6.4，32，160，，800，4000，10000和20000ng/ml，按d)液相色谱及e)质谱检测的方法进行测定，绘制标准曲线(图11)，以浓度(c)与吸收率(a)作线性回归(c的单位：ng/ml)，其线性回归方程为：a＝1.2018+0.1864,r＝0.9988，线性范围为0.00-20000ng/ml。

2.燕窝样品中的游离唾液酸含量测定

以n-乙酰-d-神经胺酸(n-acetyl-d-neuraminicacid)为对照，根据标准曲线的线性回归方程计算燕窝样品中的游离唾液酸含量。

f)测定结果

以n-乙酰-d-神经胺酸(n-acetyl-d-neuraminicacid)作为标准，根据子离子峰面积进行积分，制定标准曲线。经过样品处理的燕窝样品，以hplc-qqq测定全离子色谱图；另以多级反应监测(mrm)方式，检测离子对：包括检测唾液酸的两对母离子-子离子对，m/z307.9或308.1→87.0和m/z307.9或308.1→170.0，并以标准曲线计算样品中的游离唾液酸含量。

图7为实施例3在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸标准曲线,线性大于0.995。

图8为白燕窝提取液在不同时间点收集的样品,包括燕盏和燕碎。在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸含量,48小时后,燕窝的唾液酸已释放到最大。释出率达燕窝重量的9.6％和11.3％。图9为黄燕窝提取液在不同时间点收集的样品,包括燕盏和燕碎。在液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸含量,48小时后,燕窝的唾液酸已释放到最大。释出率达燕窝重量的11.2和11.7％。图10为红燕窝提取液在不同时间点收集的样品,包括燕盏和燕碎。液相色谱法-质谱联用分析下的唾液酸含量,48小时后,燕窝的唾液酸已释放至最大。释出率达燕窝重量的10.2和8.1％。结果表示采用人工模拟胃酸酸解燕窝48小时,燕窝的游离唾液酸的释放到最大,可达燕窝重量的8-12％,与文献记载的总唾液酸(燕窝重量的9％)相约。

实施例4

本实施例所述的酪氨酸酶抑制作用实验，包括以下步骤：

1)参照“一种测定燕窝中游离唾液酸含量以鉴定燕窝品质的方法”(中国专利号:zl201010162516.8)制备第一代的燕窝提取液；参照“燕窝提取液及其制备方法和应用”(中国专利号:zl201310391376.5)制备第二代的燕窝提取液、同时参照实施例1制备方法得到第三代的燕窝提取液。制备的一、二、三代的燕窝提取液都包括白燕盏、白燕碎、黄燕盏、黄燕碎、红燕盏及红燕碎。

方法具体如下：

a)以燕窝重量100倍的水浸泡燕窝，室温浸泡时间为3小时，过滤得到燕窝滤渣；所述燕窝是白燕或黄燕的燕窝；

以燕窝重量50倍的水炖煮所述燕窝滤渣，炖煮时间为6小时左右，得到初步燕窝提取液(第二代燕窝提取液)，将提取液冷冻干燥,得到燕窝提取物冰冻干燥粉；

或

所述燕窝为血燕的燕窝时，以燕窝重量100倍的水浸泡燕窝，室温浸泡时间为24小时左右，过滤得到燕窝滤渣；

以燕窝重量50倍的水炖煮所述燕窝滤渣，炖煮时间为72小时左右，得到初步燕窝提取液(第二代燕窝提取液)；将提取液冷冻干燥,得到燕窝提取物冰冻干燥粉；

b)将50毫克的燕窝提取物冰冻干燥粉加上3.8毫克的胃蛋白酶,加上5毫升的模拟胃酸酸液,所述模拟胃酸酸液ph为1-3,含有0.07m盐酸和0.1m氯化钠,然后放在37℃的水浴进行消化；

c)消化48小时后收取液,加入0.7m氢氧化钠中和及降解胃蛋白酶,调节其ph值为8-10，其中消化0小时做为对照。

2)将一、二、三代的燕窝提取液分别用于酪氨酸酶活性抑制作用测试，同时加入没有任何抑制剂的测试结果作为实验对照、维生素c(美白作用)的测试结果作为实验阳性对照。

3)酪氨酸酶活性抑制作用测试是筛选美白药品的传统测试方法。由于酪氨酸酶可以将酪氨酸转化为多巴色素，故此在该测试中，多巴色素生成量越低，则说明提取液对酪氨酸酶的抑制作用越好。

4)请参阅图11、12、13。第一、二、三代的燕窝提取液对酪氨酸酶均有的抑制作用，而三代的燕窝提取液更好。唾液酸是燕窝其中的重要美白成份,随着被人工胃酸消化,更多的唾液酸释放成游离状态,更大的抑制酪氨酸酶,所以第三代的燕窝提取液美白效果最好,最高可达60％。

整体来说,燕盏的美白作用比燕碎好,是由于燕碎经过的加工过程比较燕盏多,例如浸泡、清洗等,唾液酸的水溶性高,可能在加工过程流失。

实施例5

本实施例所述的抗氧化能力实验，包括以下步骤：

a)参照“一种测定燕窝中游离唾液酸含量以鉴定燕窝品质的方法”(中国专利号:zl201010162516.8)制备第一代的燕窝提取液；参照“燕窝提取液及其制备方法和应用”(中国专利号:zl201310391376.5)制备第二代的燕窝提取液、同时参照实施例1制备方法得到第三代的燕窝提取液(具体方法同实施例4)。制备的一、二、三代的燕窝提取液都包括白燕盏、白燕碎、黄燕盏、黄燕碎、红燕盏及红燕碎。

b)trolox(一种维生素e的类似物)的抗铜离子氧化能力来建立标准曲线。

c)各提取液分别用于抗氧化能力的试剂盒测试，同时以没有加入任何提取液的测试结果为实验阴性对照。

d)以trolox(一种维生素e的类似物)的抗铜离子氧化能力建立标准曲线，并根据该标准曲线来计算提取液的总抗氧化能力。在此测试中，trolox等值越高，则说明提取液抗氧化能力越好。

e)请参阅图14、15、16。第一、二、三代的燕窝提取液均有的抗氧化作用，而第二代的燕窝提取液更好，第三代的白燕窝和黄燕窝的抗氧化能力约为二代的70％。随着被人工胃酸消化,99％大份子蛋白被分解成肽,抗氧化能力下降。而在第三代红燕窝提取液,大份子蛋白消化率为60％,其抗氧化作用与第二代的提取液的差不多。由此推断燕窝主要的抗氧化能力来白其大份子蛋白。

总体而言，燕盏和燕碎的抗氧化作用差不多,可能由于燕窝蛋白不易溶于水,所以在加工过程不易流失。

承第二代提取液“燕窝提取液及其制备方法和应用”(中国专利号:zl201310391376.5)制备燕窝提取液,将整个燕窝完成溶解于水,完整保留了燕窝的营养,其蛋白大于100kda,而游离唾液酸为0.2-3.8％。本发明提供了第三化崭新的燕窝提取液,将其提取液用人工模拟胃酸酸解,找出最佳消化时间,将大份子的燕窝蛋白消化成肽分子，分子量主要分布在6.5kda之下，同时增强其重要活性成分燕窝唾液酸的释出,释出率可到燕窝重量的8-12％，达至游离唾液酸全释出，与文献记载的总唾液酸(燕窝重量的9％)相约。与一般同类方法相比，该方法工艺流程简单，生产成本降低；完整的保留了燕窝的营养，产物产率提高。按照该方法所制得的燕窝提取液，美白能力比第一,二代的提取液更高,同时保留其抗氧化作用，可加工为各种产品，广泛用于保健品、食品和美容产品当中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，均属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。