一株荔枝内生乳酸菌及其发酵果汁饮料的制作方法

本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一株荔枝内生菌的筛选及其发酵的果汁饮料。

背景技术

荔枝(litchiichinensissonn.)为无患子科荔枝属常绿小乔木,原产于我国华南亚热带,在我国有着悠久的种植历史。荔枝色美味香甜，富含糖分、有机酸、维生素、氨基酸等营养物质和多酚、花色苷等生物活性物质，具备抗氧化、延缓衰老、降血脂、降血糖、增强免疫力和抑制乙肝病毒表面抗原的保健功效，是岭南特色水果中的佳品。我国是世界最大的荔枝产出国，世界上荔枝消费主要是由中国种植供应。由于在盛夏高温季节采收，加上其结构特殊，荔枝采收后极易褐变和腐烂变质,不耐贮藏。目前，市场上的主要荔枝加工品有荔枝干、荔枝罐头、果汁饮料、果酒等。因此，急需一批技术含量高、营养功能成分保护好、产品附加值高的果蔬深加工技术和产品。以水果为发酵基质的乳酸菌发酵果汁是集水果的营养价值和益生菌的保健功能于一体的新型发酵饮料。国内外研究乳酸菌发酵果汁结果显示，经乳酸菌发酵后的果汁产品，色、香、味均大有改善，果汁具有的调节胃肠道消化、抑制病原菌、增强免疫力以及抗衰老等功能，且能有效改善传统益生菌乳制品乳糖不耐症和高胆固醇。国内学者对荔枝汁和荔枝果渣进行了乳酸菌发酵研究，开发了功能性汁荔枝发酵饮料和果渣果粉产品。但发酵菌株均以牛奶、蔬菜发酵菌株为多。

菌株选择是乳酸菌果汁发酵的关键之一。目前，研究中用于水果发酵的乳酸菌菌株专用菌甚少，所用菌株对水果发酵适应性不强，造成现有乳酸菌发酵水果产品风味、活菌数、营养成分等方面不理想。因此，筛选出具有优良发酵性能的水果发酵专用菌是乳酸菌果汁发酵技术的首要任务。

植物内生菌是指存活于健康植物组织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群。研究表明，植物内生菌和其宿主之间存在着相互依存及互惠的关系，植物内生菌中分离出的次生代谢产物也存在生物活性成分。荔枝内生菌仅见荔枝病害抑制、保鲜和卷烟产香等研究，目前尚未见荔枝内生菌用于果汁发酵的研究和报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有优良发酵性能水果发酵的专用菌少的技术缺陷和不足，提供一株新的肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.dextranicum)。该菌株是从荔枝果肉中筛选一株荔枝内生乳酸菌，并能用于制备水果乳酸菌发酵饮料。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明以荔枝果肉为材料，通过mrs-溴甲酚紫平板筛选法分离荔枝内生乳酸菌。通过测定筛选菌株的发酵产酸能力(ph值)和生长能力(24h活菌数、od值)筛选出具有发酵性能优良的一株荔枝内生乳酸菌。

一株荔枝内生乳酸菌(leuconostocmesenteroidessubsp.dextranicum),于2018年4月13日，保藏地址为：中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno:60353。生理生化试验和16srdna鉴定试验结果表明该株荔枝内生乳酸菌为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种。

含上述荔枝内生乳酸菌的果汁饮料，所述果汁优选为荔枝果汁。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以常用果蔬汁发酵菌种植物乳杆菌为对照菌株进行该荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌发酵荔枝果汁的微生物、理化指标和营养物质含量研究。荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌能在荔枝果汁中良好生长，活菌数达10⁹cfu/ml，优于对照菌植物乳杆菌，但差异不显著(p＜0.05)；发酵果汁的乳酸从对照果汁的0.44升高到肠膜明串珠菌的9.6和植物乳杆菌的13.9，ph值从对照果汁的4.68下降到肠膜明串珠菌的3.73和植物乳杆菌的3.54，差异显著(p＜0.05)；荔枝内生乳酸菌发酵荔枝果汁中的vc含量比对照菌植物乳杆菌和未接菌果汁都高，其对果汁中果糖、葡萄糖的利用能力也强于对照菌植物乳杆菌，两株菌葡萄糖含量的降幅分别为31.42％和26.7％，果糖含量的降幅分别为43.3％和21.7％；内生乳酸菌发酵果汁中游离氨基酸氨基酸保留率为87.3％略高于对照菌植物乳杆菌的84.36％，但两种菌在发酵过程中各种氨基酸的变化不同。筛选的荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌发酵荔枝果汁具有良好的适应性，能有效保持荔枝营养物质，显著降低荔枝汁中还原糖含量，适合于开发低糖健康型荔枝乳酸菌发酵功能性饮料。本发明不但为开发低糖健康型的荔枝乳酸菌发酵功能性饮料提供参考，还为果汁功能型发酵饮料的专用菌种筛选提供了新思路。

附图说明

图1为荔枝内生乳酸菌lz的菌落形态和细胞形态图；

图2为荔枝内生乳酸菌lz扩增产物测定的序列比对图；

图3为荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌和对照菌植物乳杆菌发酵荔枝果汁及未接菌的对照果汁中的游离氨基酸含量的测定结果图。

具体实施方式

材料：

荔枝：试验荔枝品种为‘桂味’，由东莞市农业科学研究中心提供，种植于东莞市农业科学研究中心内，采收时间为2017年7月，采收后运送至实验室于-10℃冷库保存备用。菌种：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)：实验室保藏。

仪器与试剂：

(1)仪器

榨汁机(cucina)：飞利浦；立式蒸汽灭菌锅(yxq-ls-sⅱ)：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；台式冷冻离心机(3k15)：德国sigma公司；生化培养箱(lrh-250)：上海一恒科学仪器有限公司；uv-1800全波长扫描分光光度计：日本岛津公司；ph计(fiveeasy)：瑞士梅特勒-托利多；电热恒温水浴锅(hws26型)：上海一恒科学仪器有限公司；液相色谱仪(1260)：美国安捷伦科技有限公司；超高压液相色谱仪(ultimate3000)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

(2)试剂

mrs肉汤培养基：广东环凯生物科技有限公司；mrs琼脂培养基：广东环凯生物科技有限公司；溴甲酚紫：天津市天新精细化工开发中心；乳酸、l-抗坏血酸、d-果糖：均购自德国dr.ehrenstorfer；d-葡萄糖：中国食品药品检定研究院；氨基酸混合标液：中国计量科学研究院。

实施例1：荔枝内生乳酸菌筛选：

将荔枝表面消毒后去皮，果肉用榨汁机打成浆，转入液体培养基中，富集培养后采用mrs-溴甲酚紫平板筛选法分离出产酸菌，再通过测定各产酸菌发酵产酸能力(ph值)和生长能力(24h活菌数、od值)筛选出具有发酵性能优良的菌株。

(1)荔枝内生乳酸菌的初筛。将果实表面消毒后去皮，果肉用榨汁机打成浆，取15ml果浆转入200ml灭菌mrs液体培养基中，富集培养24h后取其发酵液。以无菌生理盐水按10的倍数逐级稀释荔枝果汁发酵液。将各级稀释液分别涂布于加有溴甲酚紫的mrs培养基平板上，在36℃下培养24h，进行产酸菌分离。在出现单菌落的平板上，根据菌落形态，挑取使溴甲酚紫产生变色的菌落进行镜检，并接入肉汤培养基进行培养，进一步挑选出g(+)菌落，如此反复3次，分离纯化得到纯培养。将筛选出的各乳酸菌菌株分别编号。

(2)优良发酵菌株的筛选。筛选出的各乳酸菌菌株分别接种于250mlmrs肉汤培养基中，在36℃下培养24h后测定各产酸菌发酵产酸能力(ph值)和生长能力(24h活菌数、od值)，筛选出发酵性能优良的荔枝内生乳酸菌菌株，进行鉴定。

研究将mrs-溴甲酚紫平板筛选法分离筛选出的乳酸菌进行发酵产酸能力研究，确定优良的荔枝内生乳酸菌菌株1株(编号lz)，该菌发酵产酸和生长能力较强，在36℃下培养24h后测定，该菌株ph值为4.25，活菌数达1.6×10¹⁰，od值为1.46。将该菌株进行鉴定和荔枝果汁发酵试验研究。

实施例2：荔枝内生乳酸菌的鉴定

(1)形态学观察。挑取乳酸菌培养基上生长的幼龄培养物。涂片、革兰氏染色，显微镜下观察菌体形状、大小、革兰氏染色反应等；观察芽孢的有无、形态和着生位置。

荔枝内生乳酸菌lz在mrs平板上培养48h后进行菌落形态及细胞形态观察,结果如图1所示。结果显示，菌落呈圆形，乳白色，凸起，边缘整齐；革兰氏染色反应显微镜观察，lz为革兰氏阳性细菌，细胞呈球形或卵圆形，菌体单个、成对或链状排列。

(2)生理生化试验。进行氧化酶、接触酶、葡萄糖产酸产气、碳水化合物发酵产酸、精氨酸产氨、淀粉水解、七叶灵水解、明胶液化等生理生化试验。

荔枝内生乳酸菌lz生理生化试验结果见表1

表1lz的生化鉴定结果

(“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应)

(3)16srdna鉴定。引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，1492r：

5’-ggttaccttgttacgactt-3’，pcr反应体系为25μl，其体系为10×taqbuffer2.5μl，dntps(2.5mm)2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，27f(10μm)0.5μl，1492r(10μm)0.5μl，ddh2o16.25μl，3μldna模板。pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。pcr完成后电泳检测为阳性的pcr产物，扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交genbank进行blast比对分析，并选取同属内近缘种的16srrna基因序列。

将荔枝内生乳酸菌lz扩增产物送至美吉生物有限公司测序。将测定的序列进行blast比对，比对结果见图2。结果发现与肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.dextranicum)的同源性达到99.56％。同时结合lz的形态特征及生理生化试验结果，鉴定菌株lz为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种。

以荔枝果肉为材料，通过mrs-溴甲酚紫平板筛选法分离荔枝内生乳酸菌。通过测定筛选菌株的发酵产酸能力(ph值)和生长能力(24h活菌数、od值)筛选出具有发酵性能优良的菌株1株。生理生化试验和16srdna鉴定试验结果表明该株荔枝内生乳酸菌为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种。肠膜明串珠菌能够代谢产生适量的co2气体、多种风味化合物以及某些特殊的功能性成分,在发酵食品方面占有非常重要的地位。

实施例3：荔枝果汁内生乳酸菌发酵特性试验

荔枝经清洗、去皮、去核并打浆，取250g果浆倒入已灭菌的三角瓶内，80℃杀菌10min，迅速冷却至40℃左右备用。将荔枝内生乳酸菌(肠膜明串珠菌葡聚糖亚种)、对照菌植物乳杆菌的保藏培养物分别置于mrs肉汤中进行活化复壮，活化复壮后再在mrs肉汤(36℃，静止发酵)中培养20h。制备两组(每组3瓶)发酵用荔枝汁，向其中一组接入2％活化好的荔枝内生乳酸菌菌液，另一组接入2％活化好的植物乳杆菌菌液，在36℃下培养24h后放入4℃的冰箱中后熟24h，再取样分析微生物、理化指标和营养物质含量。以不接菌的发酵用荔枝液为对照。

(1)乳酸菌菌落总数的测定参照gb4789-2010对发酵果汁进行乳酸菌菌落总数计数。(2)ph值的测定用ph计直接测定。

(3)乳酸含量测定参照gb5009.157-2016

(4)l(+)-抗坏血酸总量测定参照gb5009.86-2016

(5)果糖、葡萄糖含量测定参照gb5009.8-2016

(6)游离氨基酸的总和：利用柱前衍生气相色谱法测定游离氨基酸，具体样品处理和测定步骤参照文献【实用食物营养成分分析手册】。

以常用果蔬发酵菌植物乳杆菌为对照菌，对筛选的荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌进行荔枝果汁发酵特性试验研究，包括微生物、理化指标和营养物质含量等，设不接菌对照试验。两株菌发酵的荔枝果汁口感酸甜，有浓郁的荔枝清香味，对照菌植物乳杆菌发酵果汁比内生乳酸菌肠膜明串珠菌发酵果汁口感偏酸，在后熟过程有植物乳杆菌果汁的液面淡褐色漂浮物出现，果汁整体色泽不如肠膜明串珠菌发酵果汁。

1.荔枝内生乳酸菌发酵果汁微生物和理化指标测定

研究分别测定荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌和对照菌植物乳杆菌发酵荔枝果汁的乳酸菌活菌数、ph值和乳酸含量等微生物和理化指标，结果见表2。荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌能在荔枝果汁中良好生长，活菌数达10⁹cfu/ml，优于对照菌植物乳杆菌,但差异不显著(p＜0.05)；乳酸是肠膜明串珠菌和植物乳杆菌产生的主要有机酸。发酵果汁的乳酸从对照果汁的0.44升高到肠膜明串珠菌的9.6和植物乳杆菌的13.9，随着乳酸浓度的升高，ph值从对照果汁的4.68下降到肠膜明串珠菌的3.73和植物乳杆菌的3.54，差异显著(p＜0.05)。

表2不同菌种的荔枝发酵果汁微生物和理化指标

2.荔枝内生乳酸菌发酵果汁中主要营养物质含量测定

2.1荔枝内生乳酸菌发酵果汁中vc、果糖和葡萄糖含量测定

荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌和对照菌植物乳杆菌发酵荔枝果汁及未接菌的对照果汁中的vc、果糖和葡萄糖含量的测定结果见表3。

荔枝内生乳酸菌发酵荔枝果汁中的vc含量比对照菌植物乳杆菌和未接菌果汁都高，两种发酵果汁的vc含量均高于未接菌果汁，差异显著(p＜0.05)。

荔枝内生乳酸菌对果汁中果糖、葡萄糖的利用能力也强于对照菌植物乳杆菌，两株菌葡萄糖含量的降幅分别为31.42％和26.7％，差异不显著(p＜0.05)；果糖含量的降幅分别为43.3％和21.7％，差异显著(p＜0.05)。

表3不同菌种的荔枝发酵果汁vc、果糖和葡萄糖含量

2.2荔枝内生乳酸菌发酵果汁中游离氨基酸的含量

荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌和对照菌植物乳杆菌发酵荔枝果汁及未接菌的对照果汁中的游离氨基酸含量的测定结果见图3。由图3可知，3种果汁中的氨基酸种类不同，含量也不尽相同。从未接种的对照果汁样品中共检测出了11种氨基酸组分，肠膜明串珠菌中检出9种，植物乳杆菌中检出10种。两种乳酸菌发酵果汁中游离氨基酸的总和均比对照果汁减少，肠膜明串珠菌的氨基酸保留率为87.3％略高于植物乳杆菌的84.36％，但在两种菌发酵过程中各种氨基酸的含量变化不同。两株菌在发酵中均能消耗脯氨酸和丝氨酸，此外，肠膜明串珠菌发酵过程消耗果汁中全部的甲硫氨酸、赖氨酸和31.4％缬氨酸,植物乳杆菌发酵过程消耗果汁中全部的丝氨酸和36.8％天门冬氨酸。

内生乳酸菌的发酵能很好的保持果蔬中的主要营养物质及果蔬汁液流变特性，也能最大限度的延长果蔬汁的保质期。本发明筛选出的荔枝内生乳酸菌不但在荔枝果汁中生长良好，活菌数高，达10⁹cfu/ml，产生适量的乳酸，口感适宜，还保持了荔枝果汁的营养物质，提高vc含量，降低还原糖含量，保留80％以上的游离氨基酸。研究表明荔枝内生菌发酵荔枝果汁的能力优于常用果蔬汁发酵菌植物乳杆菌，为果汁功能型发酵饮料的专用菌种筛选提供了新思路。

荔枝含糖高，不适合肥胖症、糖尿病等人食用。乳酸菌发酵果汁能显著降低水果中糖含量，有利于开发低糖型健康食品。本发明筛选的荔枝内生乳酸菌肠膜明串珠菌对水果中常见的还原糖果糖和葡萄糖表现出良好的降解能力，效果优于对照菌植物乳杆菌。适合于开发低糖健康型荔枝乳酸菌发酵功能性饮料。