利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法与流程

本发明涉及一种高酸发酵豆粕的制备方法，属于生物饲料领域。
背景技术：
：企业生产发酵豆粕饲料的关注点在于产品的质量和生产成本，选择什么样的菌种是生产优质发酵豆粕的前提条件，也是获得高酸含量、高蛋白消化率发酵产品的关键条件。常用饲料发酵所使用的菌以酵母菌，乳酸菌、枯草芽孢杆菌，豆粕固态发酵过程中，堆积物内部因微生物的生长产热，造成高温(达45℃)缺氧环境，上述的常规菌种在这种环境下生长代谢能力减弱，甚至死亡，从而导致发酵不彻底，降低饲料消化率，浪费饲料资源，增加养殖成本，且无法获得较高酸度、高蛋白消化率的产品。如何进行各种菌种的合理选择和培养才能使多种菌之间发挥高效的协同发酵作用，是实际生产过程中的难点和关键点。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法。本发明的另一目的在于提供由上述方法制备的高酸发酵豆粕。本发明的再一目的在于提供上述高酸发酵豆粕在制备饲料中的应用。本发明所采取的技术方案是：一种利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法，包括以下步骤：1)将凝结芽孢杆菌种子液、酵母种子液、乳酸菌种子液接种于蒸煮后的豆粕中，混匀，并调节水分含量为30％～50％；2)于35℃～37℃，湿度65％～80％条件下发酵72～96h；3)将发酵产物烘干至水分在12％以下。优选的，步骤1)中，所述凝结芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、乳酸菌种子液与蒸煮后的豆粕的用量比为1～6ml：1～2ml：1～4ml：45～55g。优选的，所述蒸煮后的豆粕为经110～130℃处理12～20min后的豆粕。优选的，所述凝结芽孢杆菌种子液为凝结芽孢杆菌固体发酵种子液，其制备方法为：将凝结芽孢杆菌菌粉按0.08～0.12％w/v加入到培养基a中，43～47℃、150～200r/min培养21～27h，得一级凝结芽孢杆菌种子液；再将一级凝结芽孢杆菌种子液按4.5～5.5％v/v接种到培养基b中，43～47℃、120～170r/min培养21～27h，得凝结芽孢杆菌固体发酵种子液；所述培养基a配方为：蛋白胨0.8～1.2％w/v，氯化钠0.8～1.2％w/v，酵母膏0.4～0.6％w/v，ph6.7～6.9，高压灭菌；所述培养基b配方为：葡萄糖1.4～1.8％w/v、氯化钠0.3～0.5％w/v，酵母粉0.5～0.7％w/v，蛋白胨1.8～2.2％w/v，牛肉膏0.5～0.7％w/v，磷酸二氢钾0.15～0.25％w/v，硫酸镁0.08～0.12％w/v，硫酸锰0.02～0.03％w/v，碳酸钙0.25～0.35％w/v，高压灭菌。优选的，所述酵母菌种子液为酵母固体发酵种子液，其制备方法为：将酵母菌接种到培养基c中，27～29℃、150～200r/min培养17～19h，得一级酵母菌种子液；将一级酵母菌种子液按0.8～1.2％v/v接种量接种到培养基c中，29～31℃、90～110r/min培养17～19h，得二级酵母菌种子液；将二级酵母菌种子液按4～6％v/v接种量接种到培养基d中，通气量0.4～0.6v/v.min，29～31℃、90～110r/min培养17～19h，得酵母固体发酵种子液；培养基c配方：酵母膏0.8～1.2％w/v，蛋白胨1.8～2.2％w/v，葡萄糖1.8～2.2％w/v，ph6.9～7.1，高压灭菌；培养基d配方：葡萄糖3.8～4.2％w/v、(nh4)2so40.45～0.55％w/v、蛋白胨0.8～1.2％w/v，酵母粉0.2～0.3％w/v、mgso40.1～0.2％w/v、k2hpo40.04～0.06％w/v，ph6.9～7.1，高压灭菌。优选的，所述乳酸菌种子液为乳酸菌固体发酵种子液，其制备方法为：将乳酸菌接种到培养基e中，36～38℃培养22～26h，得一级乳酸菌种子液；将一级乳酸菌种子液按0.8～1.2％v/v接种量接种到培养基e中，36～38℃培养22～26h，得二级乳酸菌种子液；将二级乳酸菌种子液按4～6％v/v接种量接种到培养基f中，36～38℃培养22～26h，得乳酸菌固体发酵种子液；培养基e配方：牛肉膏0.8～1.2％w/v，蛋白胨0.8～1.2％w/v，酵母膏0.4～0.6％w/v，葡萄糖1.8～2.2％w/v，无水乙酸钠0.4～0.6％w/v，柠檬酸三铵0.15～0.25％w/v，硫酸镁0.04～0.06％w/v，硫酸锰0.02～0.03％w/v，吐温800.08～0.12％v/v，ph6.9～7.1，高压灭菌；培养基f配方：酵母膏0.8～1.2％w/v，葡萄糖1.8～2.2％w/v，无水乙酸钠0.4～0.6％w/v，磷酸二氢钾0.08～0.12％w/v，硫酸镁0.04～0.06％w/v，硫酸锰0.02～0.03％w/v，吐温800.08～0.12％v/v，ph6.9～7.1，高压灭菌。优选的，所述酵母为假丝酵母。优选的，所述假丝酵母为产朊假丝酵母。优选的，所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌。优选的，步骤3)中，所述烘干为流化床烘干至水分12％以下，控制进风口温度150℃～180℃，出风口温度60℃～80℃；且烘干后粉碎。一种高酸发酵豆粕，其制备方法为上述任一项所述的方法。上述所述的高酸发酵豆粕在制备饲料中的应用。本发明的有益效果是：本发明方法发酵制备的高酸发酵豆粕具有高酸度(5％以上)，蛋白消化率高(98％以上)，且含有有效的抑菌物质。附图说明图1不同处理方法发酵豆粕所得产品中蛋白分解的电泳检测图，图中①乳酸菌发酵豆粕，②凝结芽孢杆菌发酵豆粕，③酵母菌发酵豆粕，④实施例1。图2本发明发酵产品(高酸发酵豆粕)的抑菌效果检测。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法(1)原料的处理：选择新鲜无霉变的豆粕，在蒸煮球中，121℃处理15min，冷却后作为发酵原料。(2)种子液的制备：分别制备凝结芽孢杆菌、假丝酵母菌、乳酸菌固体发酵种子液。一级凝结芽孢杆菌种子液的制备：蛋白胨1％w/v，氯化钠1％w/v，酵母膏0.5％w/v，ph6.8，高压灭菌锅121℃灭菌20min，冷却后接入0.1％w/v市售凝结芽孢杆菌菌粉，45℃、180r/min培养24h，即得。凝结芽孢杆菌固体发酵种子液的制备：葡萄糖1.6％w/v、氯化钠0.4％w/v，酵母粉0.6％w/v，蛋白胨2％w/v，牛肉膏0.6％w/v，磷酸二氢钾0.2％w/v，硫酸镁0.1％w/v，硫酸锰0.025％w/v，碳酸钙0.3％w/v，121℃灭菌20min，冷却后接入5％v/v的一级凝结芽孢杆菌种子液，45℃、150r/min培养24h，即得。一级假丝酵母种子液的制备：酵母膏1％w/v，蛋白胨2％w/v，葡萄糖2％w/v，ph7.0,高压灭菌锅121℃灭菌20min。冷却后，接种低温保藏的假丝酵母菌菌种，28℃、180r/min培养18h，即得。二级假丝酵母种子液的制备：酵母膏1％w/v，蛋白胨2％w/v，葡萄糖2％w/v，ph7.0,121℃灭菌20min，冷却至30℃，按1％v/v接种量接入一级假丝酵母种子液，29～31℃、100r/min培养18h，即得。假丝酵母固体发酵种子液的制备：葡萄糖4％w/v、(nh4)2so40.5％w/v、蛋白胨1％w/v，酵母粉0.25％w/v、mgso40.15％w/v、k2hpo40.05％w/v，ph7.0，121℃灭菌20min，冷却至30℃，按5％v/v接种量接入二级假丝酵母种子液，转速100r/min，通气量0.5(v/v.min)，30℃培养18h，即得。一级乳酸菌种子液的制备：牛肉膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，酵母膏0.5％w/v，葡萄糖2％w/v，无水乙酸钠0.5％w/v，柠檬酸三铵0.2％w/v，硫酸镁0.05％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温800.1％v/v，ph7.0,高压灭菌锅121℃灭菌20min。冷却后，将低温保藏的乳酸菌菌种接种此培养基，37℃静置培养24h，即得。二级乳酸菌种子液的制备：牛肉膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，酵母膏0.5％w/v，葡萄糖2％w/v，无水乙酸钠0.5％w/v，柠檬酸三铵0.2％w/v，硫酸镁0.05％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温800.1％v/v，ph7.0,121℃灭菌20min。冷却后，按1％v/v接种量接入一级乳酸菌种子液，37℃静置培养24h，即得。乳酸菌固体发酵种子液的制备：酵母膏1％w/v，葡萄糖2％w/v，乙酸钠0.5％w/v，磷酸二氢钾0.1％w/v，硫酸镁0.05％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温800.1％w/v，ph7.0,121℃灭菌20min，按5％v/v接种量接入二级乳酸菌种子液，37℃静置培养24h，即得。(3)将凝结芽孢杆菌固体发酵种子液、假丝酵母菌固体发酵种子液、乳酸菌固体发酵种子液接种于上述蒸煮后的豆粕中，使凝结芽孢杆菌固体发酵种子液、假丝酵母菌固体发酵种子液、乳酸菌固体发酵种子液与蒸煮后的豆粕的用量比为3ml：1ml：1ml：50g，搅拌均匀，并调节最终水分含量30％-50％。(4)置于恒温发酵房中发酵，发酵房温度控制在35℃-37℃，湿度65％-80％，发酵72-96小时。烘干至水分在12％以下；所述为流化床烘干至水分12％以下，控制进风口温度150℃-180℃，出风口温度60℃-80℃，粉碎过40目筛，得成品；(5)取样检测产品的酸度、蛋白消化率等指标。上述使用的菌种假丝酵母为产朊假丝酵母，保存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种编号为gim2.148；使用的乳酸菌为嗜酸乳杆菌，保存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种编号为gim1.208；使用的凝结芽孢杆菌为市售凝结芽孢杆菌菌粉。对比例1同实施例1，除了将实施例1步骤(3)中的3种固体发酵种子液换成单独一种乳酸菌固体发酵种子液(体积相同)，其他操作条件均相同。对比例2同实施例1，除了将实施例1步骤(3)中的3种固体发酵种子液换成单独一种凝结芽孢杆菌固体发酵种子液(体积相同)，其他操作条件均相同。对比例3同实施例1，除了将实施例1步骤(3)中的3种固体发酵种子液换成单独一种酵母菌固体发酵种子液(体积相同)，其他操作条件均相同。表1各组发酵产物的指标检测组别酸度蛋白消化率水分对比例1(乳酸菌发酵豆粕)2.5％85％8.0％对比例2(凝结芽孢杆菌发酵豆粕)2.5％92％7.5％对比例3(酵母菌发酵豆粕)1.8％88％8.2％实施例15.5％98％8.0％从表1和图1中可以看出，本发明将乳酸菌、凝结芽孢杆菌和酵母菌同时用于豆粕的发酵可使发酵产品中的酸度显著提升到5.5％，蛋白消化率高达98％，而分别单独使用相同量的乳酸菌、凝结芽孢杆菌、酵母菌进行发酵的产品酸度分别仅为2.5％、2.5％、1.8％，蛋白消化率分别为85％、92％、88％，由此可见，本发明将乳酸菌、凝结芽孢杆菌和酵母菌同时用于豆粕的发酵过程，该三种菌发生了显著的不可预料的协同作用，使得在菌体相同用量的情况下，将产品酸度显著提升到5.5％，蛋白消化率提升到98％。可见本发明提供了一种高酸度，蛋白消化率高的发酵豆粕饲料。以便更有利于改善养殖动物肠道健康状况，提高饲料利用率，有效增强养殖动物的机体免疫力，从而降低养殖成本，提高经济效益。实施例2一种利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法(1)原料的处理：选择新鲜无霉变的豆粕，在蒸煮球中，121℃处理15min，冷却后作为发酵原料。(2)种子液的制备：分别制备凝结芽孢杆菌、假丝酵母菌、乳酸菌固体发酵种子液，同实施例1。(3)取制备好的凝结芽孢杆菌固体发酵种子液30ml，假丝酵母菌固体发酵种子液10ml，乳酸菌固体发酵种子液10ml，与50g蒸煮后的豆粕混合均匀，调节终水分35％。(4)置于恒温发酵房中发酵，发酵房温度控制在36℃，湿度70％，发酵72小时后，烘干水分至10％，取样检测产品的酸度为5.12％，蛋白消化率为98.2％。实施例3一种利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法(1)原料的处理：选择新鲜无霉变的豆粕，在蒸煮球中，110℃处理20min，冷却后作为发酵原料。(2)种子液的制备：分别制备凝结芽孢杆菌、假丝酵母菌、乳酸菌固体发酵种子液，同实施例1。(3)取制备好的凝结芽孢杆菌固体发酵种子液30ml，假丝酵母菌固体发酵种子液5ml，乳酸菌固体发酵种子液20ml，与55g蒸煮后的豆粕混合均匀，调节终水分30％。(4)置于恒温发酵房中发酵，发酵房温度控制在37℃，湿度65％，发酵96小时后，烘干水分至12％。实施例4一种利用凝结芽孢杆菌制备高酸发酵豆粕的方法(1)原料的处理：选择新鲜无霉变的豆粕，在蒸煮球中，130℃处理12min，冷却后作为发酵原料。(2)种子液的制备：分别制备凝结芽孢杆菌、假丝酵母菌、乳酸菌固体发酵种子液，同实施例1。(3)取制备好的凝结芽孢杆菌固体发酵种子液30ml，假丝酵母菌固体发酵种子液30ml，乳酸菌固体发酵种子液30ml，与55g蒸煮后的豆粕混合均匀，调节终水分50％。(4)置于恒温发酵房中发酵，发酵房温度控制在35℃，湿度80％，发酵90小时后，烘干水分至8％。下面对本发明发酵产品的抑菌效果进行检测。将本发明发酵产品(高酸发酵豆粕)分别用2倍、5倍、10倍体积的水进行提取，分别获得2倍提取液、5倍提取液、10倍提取液，将所得提取液进行打孔法抑菌试验，将涂布大肠杆菌的固体培养基中的相同大小的孔径中分别加入等体积的2倍提取液、5倍提取液、10倍提取液，观察抑菌圈的情况。观察结果如图2所示，从中可以看出，2倍提取液、5倍提取液周均出现了明显的抑菌圈，即使10倍提取液周围也出现了抑菌圈。说明本发明发酵产品(高酸发酵豆粕)中含有有效的抑菌物质。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12