酰基辅酶A硫酯酶及其基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用、降解玉米赤霉烯酮的制剂的制作方法

本发明涉及酰基辅酶a硫酯酶及其基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用、降解玉米赤霉烯酮的制剂，属于真菌毒素生物降解技术领域。

背景技术：

根据联合国粮食及农业组织的统计，每年全球约有25%的作物受到真菌毒素污染，约有2%的作物因严重污染而失去营养和经济价值，造成数千亿美元的经济损失。真菌毒素超标已成为危害农产品质量安全的重要因素，给粮食、食用油和饲料工业造成巨大的经济损失，严重威胁着人类和畜禽动物的健康和安全。玉米赤霉烯酮（zearalenone，zen）是一种由许多镰刀菌属产生的类雌激素真菌毒素。在玉米、小麦和其他谷物收获前后，极易受到镰刀菌属的污染，若储存、加工、运输不当，致使zen普遍超标。食用zen超标的饲料后，母猪表现出强烈的雌激素活性，引起乳腺癌、母猪繁殖障碍等严重疾病，家禽食用后表现出生长不良和产蛋性能下降，给畜牧业造成了巨大损失。因此，研发安全、方便和有效的降解真菌毒素的技术具有重要意义。

目前，毒素污染饲料的脱毒方法主要有物理脱毒、化学脱毒和生物解毒等。理化脱毒方法存在操作困难、营养品质下降、饲料适口性下降等缺点，应用效果不好。生物解毒具有反应条件温和、对原料感官性状和适口性影响小、提高原料营养价值等优点，它被认为是最好的解毒方法。因此，利用生物酶制剂进行解毒已成为当今世界的研究热点，相关研究成果显示出良好的发展和应用前景。

目前，zen生物降解机理以及相关的功能基因研究较少。公开号为cn105755023a的中国发明专利申请公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶基因，名称为zhd-101基因，根据毕赤酵母密码子偏好性优化后的基因序列长度为795bp，密码子适应指数为0.91%，gc含量为43.6%，mrna稳定性高、半衰期长。采用该基因构建的重组毕赤酵母菌株经过高密度发酵可以高效分泌表达玉米赤霉烯酮降解酶，其发酵上清液能迅速高效地降解zen及其衍生物。

公开号为cn106047749a的中国发明专利申请公开了一种玉米赤霉烯酮降解菌，该菌株为本研究前期筛选的一株可降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌h6（cctccno:m2016129），其是以zen为唯一碳源和能源筛选得到，可用于降解玉米赤霉烯酮或是制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或饲料添加剂。但是该菌株的降解机理及相关功能基因还不明确。

技术实现要素：

本发明的目的是提供酰基辅酶a硫酯酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用，为玉米赤霉烯酮的生物降解提供一种新思路。

本发明还提供了酰基辅酶a硫酯酶基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用，为玉米赤霉烯酮的生物降解提供一种新思路。

本发明还提供了含有酰基辅酶a硫酯酶基因的重组表达载体在降解玉米赤霉烯酮中的应用，为玉米赤霉烯酮的生物降解提供一种新思路。

本发明还提供了含有酰基辅酶a硫酯酶基因的微生物在降解玉米赤霉烯酮中的应用，为玉米赤霉烯酮的生物降解提供一种新思路。

本发明还提供了酰基辅酶a硫酯酶在制备降解玉米赤霉烯酮的酶制剂或复合酶制剂中的应用，为玉米赤霉烯酮的生物降解提供一种新思路。

本发明还提供了降解玉米赤霉烯酮的酶制剂，该酶制剂中主要成分为酰基辅酶a硫酯酶，是一种新型的玉米赤霉烯酮降解酶制剂。

本发明还提供了降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂，该复合酶制剂中包含酰基辅酶a硫酯酶，是一种新型的玉米赤霉烯酮降解酶制剂。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

酰基辅酶a硫酯酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用，所述酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

本发明中通过转录组测序分析发现解淀粉芽孢杆菌h6菌株中ybgc/fadm家族的酰基辅酶a硫酯酶基因是降解玉米赤霉烯酮的关键基因，将该酰基辅酶a硫酯酶基因经密码子优化后在大肠杆菌中进行表达，发现表达蛋白为可溶性蛋白，纯化获得重组蛋白，玉米赤霉烯酮elisa试剂盒检测发现其具有高效降解zen的生物学活性，因此酰基辅酶a硫酯酶能够用于降解玉米赤霉烯酮。

所述酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.4所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.6所示的氨基酸序列。

如seqidno.4、seqidno.6所示的氨基酸序列为本发明中的解淀粉芽孢杆菌h6菌株中ybgc/fadm家族的酰基辅酶a硫酯酶的同源序列，其同样也具有降解玉米赤霉烯酮的功能。

酰基辅酶a硫酯酶基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用，所述酰基辅酶a硫酯酶基因编码的蛋白具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

本发明中通过转录组测序分析发现解淀粉芽孢杆菌h6菌株中ybgc/fadm家族的酰基辅酶a硫酯酶基因是降解玉米赤霉烯酮的关键基因，将该酰基辅酶a硫酯酶基因经密码子优化后在大肠杆菌中可溶性表达，并纯化获得重组蛋白，经检测发现重组蛋白具有高效降解zen的生物学活性，因此酰基辅酶a硫酯酶及其编码基因能够用于降解玉米赤霉烯酮。

所述酰基辅酶a硫酯酶基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，或者具有与seqidno.1所示的核苷酸序列95%以上同源性的核苷酸序列，或者由seqidno.1所示的核苷酸序列经过密码子优化后得到。

如seqidno.1所示的核苷酸序列能够编码酰基辅酶a硫酯酶，与其同源的序列和密码子优化的序列也能够编码酰基辅酶a硫酯酶，用于降解玉米赤霉烯酮。

含有酰基辅酶a硫酯酶基因的重组表达载体在降解玉米赤霉烯酮中的应用，所述酰基辅酶a硫酯酶基因编码的蛋白具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

含有酰基辅酶a硫酯酶基因的重组表达载体能够表达酰基辅酶a硫酯酶，用于降解玉米赤霉烯酮。

所述重组表达载体是将酰基辅酶a硫酯酶基因克隆到表达载体中，构建得到重组表达载体。该重组表达载体可以使用常规的基因工程方法得到。

含有酰基辅酶a硫酯酶基因的微生物在降解玉米赤霉烯酮中的应用，所述酰基辅酶a硫酯酶基因编码的蛋白具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

含有酰基辅酶a硫酯酶基因的微生物能够表达酰基辅酶a硫酯酶，用于降解玉米赤霉烯酮。

酰基辅酶a硫酯酶在制备降解玉米赤霉烯酮的酶制剂或复合酶制剂中的应用，所述酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

酰基辅酶a硫酯酶具有降解玉米赤霉烯酮的能力因此能够用于制备降解玉米赤霉烯酮的酶制剂或复合酶制剂。

降解玉米赤霉烯酮的酶制剂，所述酶制剂的有效成分为酰基辅酶a硫酯酶；所述酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

酰基辅酶a硫酯酶对于玉米赤霉烯酮具有很高的降解能力，用其为主要成分制得酶制剂对于玉米赤霉烯酮也具有很高的降解能力。

降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂，所述复合酶制剂的有效成分包括酰基辅酶a硫酯酶；所述酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，或者具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所形成的氨基酸序列。

酰基辅酶a硫酯酶对于玉米赤霉烯酮具有很高的降解能力，包含酰基辅酶a硫酯酶的复合酶制剂对于玉米赤霉烯酮也具有很高的降解能力。

附图说明

图1为本发明实验例中总离子流图；

图2为本发明实验例中m1一级质谱图；

图3为本发明实验例中m1二级质谱图；

图4为本发明实验例中m2一级质谱图；

图5为本发明实验例中m2二级质谱图；

图6为本发明实验例中bl21（de3）表达的zte138蛋白的sds-page分析图；

图7为本发明实验例中纯化得到的zte138蛋白的sds-page和westernblot分析图；

图8为本发明实验例中推断的的m1的分子式结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及实验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。下文中所涉及到的菌株解淀粉芽孢杆菌h6已于公开号为cn106047749a的中国发明专利申请中公开。

解淀粉芽孢杆菌h6保藏证明和存活证明说明：

保藏菌株：解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）h6，保藏编号：cctccno:m2016129，保藏日期：2016年3月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏地址：中国武汉武汉大学（湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心）。

酰基辅酶a硫酯酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用的实施例1

本实施例酰基辅酶a硫酯酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用中所使用的酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。酰基辅酶a硫酯酶也可以具有如seqidno.4或者如seqidno.6所示的氨基酸序列。

酰基辅酶a硫酯酶基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用的实施例1

本实施例酰基辅酶a硫酯酶基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用中的酰基辅酶a硫酯酶基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。酰基辅酶a硫酯酶基因也可以具有如seqidno.3或者如seqidno.5所示的核苷酸序列。

含有酰基辅酶a硫酯酶基因的重组表达载体在降解玉米赤霉烯酮中的应用的实施例1

本实施例含有酰基辅酶a硫酯酶基因的重组表达载体在降解玉米赤霉烯酮中的应用中，重组表达载体中插入有酰基辅酶a硫酯酶基因，所述酰基辅酶a硫酯酶基因具有如seqidno.1、seqidno.3或者如seqidno.5所示的核苷酸序列。

含有酰基辅酶a硫酯酶基因的微生物在降解玉米赤霉烯酮中的应用的实施例1

本实施例含有酰基辅酶a硫酯酶基因的微生物在降解玉米赤霉烯酮中的应用中，微生物中包含重组表达载体，重组表达载体中插入有酰基辅酶a硫酯酶基因，所述酰基辅酶a硫酯酶基因具有如seqidno.1、seqidno.3或者如seqidno.5所示的核苷酸序列。所述微生物可以是重组菌，具体是将克隆有编码玉米赤霉烯酮降解酶的基因的重组表达载体转入宿主细菌中，构建得到重组菌。

酰基辅酶a硫酯酶在制备降解玉米赤霉烯酮的酶制剂或复合酶制剂中的应用的实施例1

本实施例中酰基辅酶a硫酯酶在制备降解玉米赤霉烯酮的酶制剂或复合酶制剂中的应用中，是将酰基辅酶a硫酯酶作为降解玉米赤霉烯酮的酶制剂的主要有效成分，或者作为降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的部分有效成分。

降解玉米赤霉烯酮的酶制剂的实施例1

本实施例降解玉米赤霉烯酮的酶制剂中主要有效成分为酰基辅酶a硫酯酶，酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。酰基辅酶a硫酯酶也可以具有如seqidno.4或者如seqidno.6所示的氨基酸序列。所述酶制剂中还含有辅料成分。

降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的实施例1

本实施例降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂中有效成分为酰基辅酶a硫酯酶和zhd蛋白（如cn105755023a中所示），还含有辅料成分；酰基辅酶a硫酯酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。酰基辅酶a硫酯酶也可以具有如seqidno.4或者如seqidno.6所示的氨基酸序列。

实验例

1.研究过程

1.1实验所用材料

1.1.1菌株：解淀粉芽孢杆菌h6是一个早期筛选出具有玉米赤霉烯酮降解特性的菌株（如cn106047749a中所示）。表达株bl21（de3）和原核表达载体pet-30a为商用菌株和载体。

1.1.2主要试剂：zebralenonestandard（pribola）、甲醇、营养肉汤、qiaquick-pcrkit（takara）、rneasyminikit（takara）、dntpstakara、rnaseh（takara）、dna聚合酶i（takara）、溶解缓冲液、iptg和tritionx-100（biotechnologybioengineering（shanghai）co.，ltd.）、质粒提取试剂盒和dna提取试剂盒（tiangenbiochemicalte）科技（北京）有限公司、t4-dna连接酶、taq-dna聚合酶（宝生物工程（大连）有限公司）。

1.2实验方法和结果

1.2.1样品制备：选择单个菌落接种至50ml营养液（含50ml营养液的250ml三角瓶）中，在37℃条件下180r/min培养8小时，然后以6%的接种量分别接种至6瓶100ml营养液（含100ml营养液的250ml三角瓶），37℃条件下180r/min，培养24h制得发酵液。其中三瓶发酵液中加入200μl的zen（1000μg/ml），标记为：z1、z2、z3（实验组），其余三瓶加入200μl甲醇，标记为c1、c2、c3（空白对照组）。在37℃、180r/min条件下培养12h后，在12000r/min高速冷冻离心机中离心6分钟，收集菌体细胞，冷冻在液氮中，然后在-80℃下储存直至使用。

1.2.2总rna提取及质量检测：根据rna提取说明书，从细菌中提取总rna。采用nanodrop和agilent2100生化分析仪测定样品rna浓度和od260/od280比值。使用安捷伦2100检测生化分析仪测定总rna质量，以确定rna完整性。

1.2.3测序文库的构建：用无核糖核酸酶dna酶法去除rna样品中的dna，用核糖核酸酶清除试剂盒去除原核总rna中的rrna，然后用随机酶消化法破坏纯化后的mrna。以短片段的形式，以随机六聚体为模板，以片段mrna为模板合成第一条cdna链。去除dntps后，通过加入缓冲液、datp、dgtp、dctp、dutp、rnaseh和dna聚合酶i合成第二条cdna链，用qiaquick-pcr试剂盒纯化得到的双链cdna，经末端修复后，加入polya并连接到测序连接子上，再用ung酶消化第二条cdna链。用微洗脱pcr纯化试剂盒纯化后，进行pcr扩增。构建的测序文库使用illuminahiseq2500进行测序。

经6个样品的总rna提取和质量检测，共建立了6个转录序列库。配对的末端转录组使用illumminahiseq2500测序平台进行测序。去除不合格的读取，并进行数据分析。以ncbi数据库中的解淀粉芽孢杆菌dsm7（nc014551.1）全基因组为参考，对6组数据进行基因匹配，基因比对率达84%以上，结果优良可以进行后续的数据分析。

1.2.4差异表达基因的筛选：使用python工具包中的htseq软件将比对的基因定位到外显子上，然后通过rpkm估算基因表达水平。应用deseqr软件，在差异倍数≥1.5，p值≤0.05的筛选条件下筛选差异表达基因。共筛选出77个差异表达基因，其中16个上调基因，61个下调基因。

1.2.5zen降解产物的分析：将1.2.1中离心获取的上清液应用uplc三重tof/ms系统进行分析，获得总离子流图（如图1所示）。实验组降解产物与空白对照组相比在4.067min和14.786min时存在两个明显的差异峰。

4.067min差异峰（m1）的一级质谱结果如图2所示，其中离子峰m/z399、381、416、797、798和799分别为[m1+h]⁺、[m1+h]⁺、[m1+nh4]⁺、[m1+h]⁺、[2m1+h]⁺、[2m1+2h]⁺、[2m1+2h]⁺和[2m1+3h]⁺。用二级质谱法测定m1（4.067min差异峰）的分子式可以是c18h23o8p或c25h18o5或c32h14（如图3所示）。

14.786min差异峰（m2）的一级质谱结果如图4所示，其中离子峰m/z1036、1037、1038、1058、1059和1060分别为[m2+h]⁺、[m2+2h]⁺、[m2+3h]⁺、[m2+h+na]⁺、[m2+2h+na]⁺和[m2+3h+na]+。用二级质谱法测定m2分子式可以是c64h93no10、c52h97n3o7、c5993n3o12或c71h895（如图5所示）。由于m2分子中含有n元素，分析认为m2可能是一种多肽或蛋白酶，因此认为m1是玉米赤霉烯酮的降解产物。

1.2.6功能基因的预测、表达与鉴定

在16个上调的差异基因中进行分析筛选，其中有二个未知基因可能与玉米赤霉烯酮降解有关。其中由138个氨基酸组成的蛋白基因（命名为zte138）在上调基因中排在第2位，可能是玉米赤霉烯酮降解的关键基因，故对此基因进行克隆，功能基因zte138（核苷酸序列如seqidno.1所示）与ybgc/fadm家族酰基辅酶a硫酯酶基因（如seqidno.3所示）在ncbi上的比较表明，414个核苷酸序列，识别率为99%。编码138个氨基酸的酸性蛋白平均分子量为16974da，只有第2位氨基酸不匹配，zte138蛋白序列如seqidno.2所示，ybgc/fadm家族酰基辅酶a硫酯酶（登录号：wp017417881.1）蛋白序列如seqidno.4所示。

利用密码子优化软件maxcodontm优化程序（v13）获得zte138基因，对zte138蛋白（个别点突变）的氨基酸序列进行优化，优化后的基因序列如seqidno.5所示，优化后的蛋白序列如seqidno.6所示。应用质粒pet-30a（+）在bl21（de3）工程菌上表达，经鉴定表达蛋白为可溶性蛋白。

sds-page检测表明zte138蛋白获得了表达，结果如图6所示，m道：sds-page蛋白maker；0道：对照；1道：15℃诱导16小时；2道：37℃诱导16小时；从图中可以看出相对于对照组，诱导表达组在10-20kda之间都具有明显的条带（如箭头所示），而对照组没有。

然后纯化后进行western-blot检测，结果如图7所示，m1：sds-pagemaker（kda）；m2：western-blotmaker（kda）；1道：bsa；2道：zte138蛋白质。结果表明最终得到纯度超过90%的可溶性zte138蛋白。最终结果表明，重组表达载体pet-30a（+）-zte138在大肠杆菌bl21（de3）中得到了正确表达，纯化得到了可溶性zte138蛋白。

生物学活性鉴定：用玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒鉴定zte138重组蛋白降解玉米赤霉烯酮的活性。

从100ml诱导培养液中纯化获得的重组蛋白溶于100ml营养液中，加入200μl的zen（1000μg/ml），在37℃、180r/min条件下反应12h，酶联免疫检测试剂盒检测zen的含量，结果表明其降解率为95.91%。

此结果表明，重组表达载体pet-30a（+）-zte138所表达的可溶性蛋白具有降解zen的能力。

讨论

本发明中为了筛选玉米赤霉烯酮降解的关键基因，采用高通量测序技术对玉米赤霉烯酮处理的解淀粉芽孢杆菌h6的转录产物进行了测序。转录组测序分析表明，玉米赤霉烯酮对解淀粉芽孢杆菌77个基因有显著影响，其中16个基因上调，61个基因下调。分析认为在玉米赤霉烯酮处理下，细菌上调的基因主要是能利用毒素促进细菌生长的酶，和利用毒素降解或转化为其他物质的相关基因。筛选差异表达基因，并对预测的差异表达基因进行克隆和表达，对表达蛋白进行降解玉米赤霉烯酮活性检测，验证该基因降解zen的生物学活性。

zte138基因为ybgc/fadm家族酰基辅酶a硫酯酶（解淀粉芽孢杆菌），玉米赤霉烯酮为二羟苯甲酸内酯。玉米赤霉烯酮的内酯键可在内酯水解酶的作用下断裂，内酯水解酶将酯环结构打开成直链结构，然后自发脱羧基，形成不与雌激素受体结合的断裂，从而降低毒性。

液相色谱-质谱分析表明，m1的分子式为c18h23o8p或c25h18o5或c32h14，分子量为398，玉米赤霉烯酮的分子量为c18h22o5，分子量为318.36。本研究玉米赤霉烯酮降解产物m1的分子量大于玉米赤霉烯酮的分子量，这可能是由于玉米赤霉烯酮在zte138的作用下破坏了酯环键，亚磷酸盐取代了苯环支链中的羟基所致。因此，推断本文中m1的分子式为c18h23o8p（如图8所示），其结构为（1e，10s）-1-（3,5-二羟基-6-苯甲酸）-11’-亚磷酸-2’-十二烯基-7’-酮。

功能基因zte138在体外的表达表明，表达产物主要存在于上清液中；经纯化、鉴定、检测，得到可溶性蛋白，酶联免疫吸附法检测结果表明该可溶性蛋白具有降解zen的能力。这些结果表明，功能基因zte138是降解zen的关键基因。zte138编码的蛋白具有降解玉米赤霉烯酮的能力。

<110>河南农业大学

<120>酰基辅酶a硫酯酶及其基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用、降解玉米赤霉烯酮的制剂

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<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>解淀粉芽孢杆菌

<221>酰基辅酶a硫酯酶基因

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<213>解淀粉芽孢杆菌

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<213>解淀粉芽孢杆菌

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<213>人工序列

<221>优化的酰基辅酶a硫酯酶基因

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<213>人工序列

<221>优化的酰基辅酶a硫酯酶

<400>6

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