专利名称：大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统的制作方法
技术领域：
本发明属卫生细菌学检验领域，具体说是一种大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统。
为提高卫生水平和预防肠道传染病，大肠菌群仍是现今卫生细菌学检验中最重要的常规指标。目前国内沿用的该指标检验方法的原理均未能脱离基于大肠菌发酵乳糖产酸产气的生化特性和在特定培养基上菌落色泽的辨认上，因此存在操作步骤繁琐、耗时过长，定性不够准确，定量灵敏度精确不高以及对损伤或变异型大肠菌群漏检等方法上的缺点。
近年来在细菌遗传学和基因工程研究基础上，国外发展了“酶-底物反应法”检测大肠菌群。即利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶(β-GAD)来“诊断”大肠菌群；uidA基因编码的β-葡糖醛酸苷酶(β-GAD)来“诊断”埃希氏大肠菌(E.Coli)。美国环境保护局批准的大肠菌自动检测(Autoanalysis Colilert，简称AC法)的关键试剂是两个底物，即邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)和4-甲基伞形基-β-D-葡糖醛酸苷(MUG)。ONPG被β-GAD酶水解，生成黄色的邻-硝基酚；MUG被β-GUD酶水解生成发蓝绿色荧光的4-甲基伞形酮(4-Mu)，因而可相应的用来检测水中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌。
鉴于目前我国有关卫生标准中仍以总大肠菌群和粪大肠菌群为指标，尚无对大肠埃希氏菌的具体要求，而大肠埃希氏菌并不等同于粪大肠菌，AC法中以ONPG为底物多管比色法检测水中总大肠菌群已在1992年10月美国标准方法委员会第18版《水与废水检验标准方法》中正式予以推荐。又考虑到荧光法无论是定性的准确性、抗干扰和定量的灵敏性等方面都远优越于比色法。故若能实现以一种水解后产荧光的底物来替代ONPG，并使酶-底物反应从试管的液相反应改变为膜上的固相反应，则具有更大的技术上的优越性和应用上的实际意义。
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种吸取MUG中水解后发荧光的4-甲基伞形酮部分和ONPG中能被β-GAD酶水解的半乳糖苷部分，将两者合成4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(MUGAL)，以MUGAL为底物，再结合微孔膜技术的应用和相应的配套器材，发展和完善了大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统。
本发明的目的可以通过以下措施来达到1.以半乳糖和4-甲基伞形酮为主要原料，采用三步亲核取代反应，合成4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(MUGAL)获白色针状结晶纯品。其具体程序如下 步骤(1)于三颈瓶中加入乙酐和高氯酸，在搅拌下加入半乳糖，在冰水浴冷却下加入PB3，加毕，在搅拌下加入水，放置2h后加入氯仿萃取，萃取液用水和NaHC3溶液分别洗涤，用CaCl2干燥后减压蒸去氯仿，残余物用乙醚和石油醚混合液处理得到溴代乙醚半乳糖(I)，收率72.7％；(2)取(I)及4-甲基伞形酮溶解于丙酮中，在搅拌下加入1mol/L的NaOH溶液，放置，减压蒸去丙酮，残余物用氯仿萃取，萃取液用5％NaOH及水分别洗涤后减压蒸去氯仿，用乙醇溶液重结晶，得白色晶体为乙酰化MOGAL(II)mp163℃，收率65％；(3)于反应瓶中加入(II)及甲醇搅拌成悬浊液，然后加入1mol/L甲醇钠溶液，放置。过滤，固体用水洗后干燥，用混合溶剂重结晶，得白色针状结晶，即为MUGAL，mp233℃，收率90％。
2、通过正交试验获得含MUGAL最佳的培养液配方培养液成分如下K2HPO41％；NaNH4HPO40.35％；MgSO4·7H2O 0.02％；NaCl 0.02％；枸橼酸钠0.05％；Mn++，Zn++微量(0.5ug/L)；蛋白胨0.15％；牛肉膏0.03％；乳糖0.35％；十二烷基硫酸钠0.02％；去氧胆酸钠0.01％；MUGAL 0.0075％；异丙基硫状半乳糖苷0.1％；其空白对照液的本底荧光值最小，但种入“3个”E.Coli菌置37℃，15h可检出肉跟观察明显的荧光。微孔膜阴留的“单个”E.Coli菌用培养液衬垫支持，37℃下培养9h即出现针尖样荧光，12h后特征性荧光斑点亮强烈，数目稳定。
3.将酶-底物荧光反应与微孔膜技术相结合采用孔径为0.45um的微孔膜及手动滤过装置，使具有lacZ基因的大肠菌群阻留在滤膜上，再用浸润有底物的培养液支持，大肠菌群的β-GAD酶使底物水解形成色泽、形态、出现时间具有特征性的荧光斑点，以此来定量检测大肠菌群，在37℃下若被水解产荧光显示检样中存在总大肠菌群，在44.5℃下水解产荧光则显示存在粪大肠菌群。
本发明相比现有技术具有如下优点
1 国外的AC法着眼于lacZ和uidA二个基因，其中测总大肠菌群用ONPG为底物在试管中比色判别，需要多管试验求最可能数(MPN)，以MUG为底多管荧光法检E.Coli菌也是最可能数，且不能得出粪大肠菌群的结果。我们针对单一的lacZ基因，用MUGAL为底物来替代ONPG。MUGAL被β-GAD酶水解生成4-Mu具有特殊的强荧光性，比ONPG水解后生成黄色的邻-硝荃酚，更易被客观地辨认和灵敏地测得。采用微孔膜后，大肠菌和它分解底物产生的4-Mu，不象AC法那样分散在液体中，而是集中于一点，因而产生特征性荧光斑点的时间快，可直接计数，还可纯培养进一步研究。若通过印痕法仍用同一培养液，只需将培养温度提高到44.5C，可得其中的粪大肠菌群数。这样即适合于我国卫生标准，又可与国外新标准接轨。而且膜荧光法与AC法比较还克服了因假单胞菌产生荧光色素而带来的假阳性干扰。
2 膜荧光法大大简化了操作步骤，缩短了检验周期经典的标准多管发酵法需经过初发酵，平板分离，复发酵三步，从开始检测到最终出结果需要72小时，标准滤膜法也需要48小时，而膜荧光法操作简化为一步，从采样现场检测到出结果只需12-15小时，无需进一步确证试验。
3 膜荧光法可以节省大量试剂药品，材料和人力以饮用水水样检测为例，采用标准多管发酵法仅所需的培养液就比膜荧光法要多耗费一百多倍，AC法(多管)所耗培养液也比膜荧光法多近50倍。
4 膜荧光法检测系统的携带式培养箱采用集成芯片、智能温控、液晶显示、带时间和培养周期内最高最低温度的记忆和显示功能，仪器内附10安时容量的全封闭免维护电瓶，交、直流两用，交流电充电的同时不影响孵箱的连续工作。仪器加热元件采用发热陶瓷(PTC)，耗电小、热效率高、具备温度开关性能，即低温度下加热功率大，当温度升到80℃时功率降为最小并自动停止升温以保证用电安生。仪器工作室一次可培养30份检样。
其它配套器材的合理设计使检验工作可以长期不依赖化验室和交流电源，在采样现场就地完成操作和结果判读。例如滤膜衬垫单份封装于塑料袋中用γ-射线辐照灭菌，培养液分装于塑料安瓿中，不需吸管、滴管，加液量容易控制，滤筒、滤床和培养皿都是金属材料可用酒精棉球火焰灭菌，一套器材可以反复循环使用。袖珍紫外灯用干电池为电源，365nm的紫外光经灯管和滤光片双重滤光，在此光源下假单胞菌的黄绿色荧光色素与大肠菌分解底物生成4-Mu蓝绿色荧光荧点可以明显区分开来，结果计数准确。
5 采用传统方法需将现场采样后的检样在冷藏条件下专程迅速送达化验室检验，这不仅耗费样品输送时间和劳务费用，而且样品在送检过程中因微生物性质和数量的变化使检验结果“失真”，采用膜荧光现场检测系统不仅可以节省运输和劳务费用提高工作效率，而且检验结果反映监测点的真实情况，便于及时发现问题采取对策。
实施例例一水样中大肠菌群膜荧光法现场检测操作实例1 水样杯，滤器及平皿灭菌先用卫生纸将水样杯、滤器、平皿等擦去水份，用75％酒精擦拭滤筒、滤床，■再点燃酒精棉球以火焰对上述物品灭菌。
2 用75％酒精棉球擦拭剪刀和滤膜衬垫袋，小心剪去封口，用镊子(经火焰灭菌)将两张衬垫夹出放置在平皿中，将滤膜置滤床上，糙面向上，膜边缘与滤床边缘等距离，装上滤筒，接好吸球。
3 以75％酒精棉球擦拭塑料安瓿和剪刀，小心剪去封口，用安瓿中的培养液使平皿中的衬垫完全湿润，吸去过多培养液。
4 以无菌操作采集水样于水样杯中，若水样中含氯消毒剂可按每100ml加0.1ml量的脱氯剂(1.8％Na2S2O3)。根据水的种类倾注100ml或适量水样于滤筒中，利用吸球手动负压抽滤。在倾注水样及抽滤的初期可用左手将滤筒略向下按紧，开始向下滤水后即可松开左手，若水样量小于10ml则滤前先加20ml左右灭菌水，再加水样。
5 水样滤干后保持负压5秒钟，根据水样种类用灭菌稀释水20-30ml冲洗滤器抽干，必要时再洗一次。
6 拔下吸球使压力平衡，用镊子将滤膜放入平皿衬垫上，菌面向上，要求膜与衬垫之间无气泡(放膜时辊压式及放后略加转动)。
7 将平皿放置在培养箱中培养12-15小时，测总大肠菌群培养箱温度37℃，粪大肠菌群培养温度44-44.5℃。
8 将平皿置365nm■紫外分析器中观察滤膜上的蓝绿色荧光斑点数，计数即为滤过水样中的大肠菌群数。若滤膜正面其它细菌生较多，也可将膜揭下从膜的反面及衬垫上的特点斑点数来核对正面计数的结果。
例二 餐茶具及公共用品用其上大肠菌群检测用棉签(灭菌)按常规取样后，于滤筒中加灭菌生理盐水，清洗棉签滤过，余同水样检测。
权利要求
1.一种大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统，其特征是1.以半乳糖和4-甲基伞形酮为主要原料，采用三步亲核取代反应，合成4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(MUGAL)获白色针状结晶纯品，其具体程序如下 步骤(1)于三颈瓶中加入乙酐和高氯酸，在搅拌下加入半乳糖，在冰水浴冷却下加入PBr3，加毕，在搅拌下加入水，放置2h后加入氯仿萃取，萃取液用水和NaHCO3溶液分别洗涤，用CaCl2干燥后减压蒸去氯仿，残余物用乙醚和石油醚混合液处理得到溴代乙醚半乳糖(I)，收率72.7％；(2)取(I)及4-甲基伞形酮溶解于丙酮中，在搅拌下加入1mol/L的NaOH溶液，放置，减压蒸去丙酮，残余物用氯仿萃取，萃取液用5％NaOH及水分别洗涤后减压蒸去氯仿，用乙醇溶液重结晶，得白色晶体为乙酰化MOGAL(II)mp163℃，收率65％；(3)于反应瓶中加入(II)及甲醇搅拌成悬浊液，然后加入1mol/L甲醇钠溶液，放置。过滤，固体用水洗后干燥，用混合溶剂重结晶，得白色针状结晶，即为MUGAL，mp233℃，收率90％；通过正交试验获得含MUGAL最传的培养液配方培养液成分如下K2HPO41％；NaNH4HPO40.35％；MgSO4·7H2O0.02％；NaCl0.02％；枸橼酸钠0.05％；Mn++，Zn++微量(0.5ug/L)；蛋白胨0.15％；牛肉膏0.03％；乳糖0.35％；十二烷基硫酸钠0.02％；去氧胆酸钠0.01％；MUGAL0.0075％；异丙基硫状半乳糖苷0.1％；将酶-底物荧光反应与微孔膜技术相结合采用孔径为0.45um的微孔膜及手动滤过装置，使具有lacZ基因的大肠菌群阻留在滤膜上，再用浸润有底物的培养液支持，大肠菌群的β-GAD酶使底物水解形成色泽、形态、出现时间具有特征性的荧光斑点，以此来定量检测大肠菌群。
2根据权利要求1所述的大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统，其特征是膜荧光法检测系统的携带式培养箱加热元件采用发热陶瓷(PTC)。
3根据权利要求1所述的大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统，其特征是袖珍紫外灯365nm■的紫外光经灯管和滤光片双重滤光。
全文摘要
本发明提供了一种吸取4-甲基伞形基-β-D-葡糖醛酸苷(MUG)中水解后发荧光的4-甲基伞形酮部分和邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)中能被β-GAD酶水解的半乳糖苷部分，将两者合成4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(MUGAL)，以MUGAL为底物，在37℃下若被水解产荧光显示检样中存在总大肠菌群；在44.5℃下水解产荧光则显示存在粪大肠菌群，再结合微孔膜技术的应用和相应的配套器材，发展和完善现场快速定量检测系统。
文档编号C12Q1/10GK1141344SQ9511113
公开日1997年1月29日 申请日期1995年7月27日 优先权日1995年7月27日
发明者林大榕 申请人:南京铁道医学院