专利名称：治疗用抗血管生成的组合物和方法
技术领域：
本申请涉及用于治疗与血管生成有关疾病(如依赖于血管生成癌)的新型血管生成抑制剂。本发明还涉及治疗依赖于血管生成癌的新型组合物和方法。此外，本发明还涉及用于内抑制素测定的诊断分析方法和试剂盒、定位内抑制素的组织化学试剂盒、检测内抑制素生物合成的分子探针、内抑制素特异性抗体、内抑制素受体的肽兴奋剂和拮抗剂的产生以及与内抑制素肽有关的细胞毒性剂。
背景技术：
几种直接证据已经表明血管生成对固体肿瘤生长和存在及它们的转移是十分重要的(Folkman，1989；Hori等，1991；Kim等，1993；Millauer等，1994)。为了刺激血管生成，肿瘤对各种血管生成因子(包括成纤维细胞生长因子(FGF和BFGF)(Kandel等，1991)、血管内皮细胞生长因子/血管透过性因子VEGF/VPF)的产生具有正调节作用。然而，许多恶性肿瘤也产生血管生成的抑制剂，包括血管抑制素和凝血酶致敏蛋白(Chen等，1995；Good等，1990；O′Reilly等，1994)。一般认为血管生成表型是这些新血管生成的正调节物和负调节物之间的净平衡所至(Good等，1990；O′Reilly等，1994；Parangi等，1996；Rastinejad等，1989)。已经鉴定了几种血管生成的其它内源抑制剂，尽管这些抑制剂不都与肿瘤的存在有关。这些抑制剂包括血小板因子4(Gupta等，1995；Maione等，1990)、干扰素-α、干扰素诱导的蛋白质10(Angiolillo等，1995；Strieter等，1995)，所说的蛋白质由白细胞介素-12和/或干扰素-γ(Voest等，1995)、gro-β(Cao等，1995)和促乳素的16kDa N-末端片段(Clapp等，1993)诱导。已知的唯一特异性地抑制内皮细胞增殖的血管生成抑制剂为血管抑制素(O′Reilly等，1994)。
血管抑制素是分子量大约为38千道尔顿(kDa)的内皮细胞增殖的特异性抑制剂。血管抑制素是纤溶酶原的内部片段，这种片段包含纤溶酶原的5个kringles中的至少三个。已经证明血管抑制素在某些肿瘤上能够减少肿瘤的重量，并抑制肿瘤的转移(O’Reilly等，1994)。下文所使用的术语＂血管抑制素＂是指上文描述的血管抑制素、具有抑制内皮细胞增殖能力的血管抑制素肽片段、与血管抑制素的氨基酸序列实质上具有同源性的血管抑制素类似物(这种类似物具有抑制内皮细胞增殖能力)。
发明概述本发明涉及新的蛋白质抑制剂和它的使用方法。此蛋白质是内皮增殖和血管生成的潜在的和特异性的抑制剂。使用此抑制剂进行全身治疗几乎可以完全抑制肿瘤诱导的血管生成，并且其显示出强大的抗肿瘤活性。
抑制蛋白的分子量大约为18,000-20,000道尔顿(18-20kDa)，并且在培养的细胞中能够抑制内皮细胞增殖。此蛋白的特征还在于其优选的N-末端氨基酸序列，这种蛋白质的头二十个氨基酸如下His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu1 2 3 4 5 6 7 8 9 10His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser11 12 13 14 15 16 17 18 19 20(SEQ ID NO1)本发明优选的内皮细胞增殖抑制剂是具有上述特征的蛋白质，这种蛋白质是从鼠血管内皮瘤细胞系EOMA中分离和纯化的。将这种抑制蛋白命名为内抑制素(endostatin)。
本发明提供了通过向患有不需要的血管生成类疾病的人或者动物以足以抑制血管生成的量施用包含实质上纯化的内抑制素或者内抑制素衍生物的组合物，来治疗由不需要的和无法控制的血管生成介导的疾病和过程的方法和组合物。本发明对治疗或抑制肿瘤的生长特别有用。向患有预先形成血管的转移性肿瘤的人或动物施用内抑制素可以抑制这些肿瘤的生长或扩展。
本发明也包括检测和测量生物液体和组织中的内抑制素的诊断方法和试剂盒、定位组织中内抑制素的试剂盒。所说的诊断方法和试剂盒可以是本领域普通技术人员公知的任何形式。本发明也包括内抑制素的特异性的抗体和抑制内抑制素特异性抗体结合的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。内抑制素特异性抗体可以用于诊断试剂盒以便检测内抑制素的存在和数量，这种内抑制素可以诊断或者预测由血管生成介导的癌症和其它疾病的发生和复发。也可以向人或动物施用内抑制素特异性的抗体以便使人或动物针对内抑制素进行被动免疫，从而降低血管生成的抑制作用。
本发明也包括用于检测抗体的存在和数量的诊断方法和试剂盒，所说的抗体在体液中与内抑制素结合。所说的诊断方法和试剂盒可以是本领域普通技术人员公知的任何形式。
本发明还包括用同位素或其它分子或蛋白质标记的内抑制素肽片段，所说的标记用分子或蛋白质在现有技术(包括但不限于正电子发射断层摄影术、放射自显影术、流动细胞计量术、放射受体结合测定和免疫组织化学)中用于检测和显示内抑制素结合位点。
这些内抑制素肽也可以作为内抑制素受体的兴奋剂和拮抗剂，由此促进或阻止内抑制素的生物活性。这些肽用于分离内抑制素受体。
本发明也包括内抑制素、内抑制素片段、内抑制素抗血清、或者与用于治疗和研究的细胞毒性剂有关的内抑制素受体兴奋剂和拮抗剂。
本发明包括与内抑制素的转录和翻译有关的核糖核酸与脱氧核糖核酸的分子探针。这些分子探针在组织和细胞中提供了检测和测量内抑制素生物合成的手段。
令人惊奇的发现是在各种形式的重组内抑制素蛋白施用给患有肿瘤的动物时，都可以持续释放抗血管生成的化合物。持续释放的化合物的优选形式是未折叠的重组产生的内抑制素。
另外，本发明包括核酸序列，这种核酸序列包含编码上述公开的氨基酸序列和编码内抑制素及其内皮细胞增殖抑制肽片段的核苷酸密码子。
本发明还涉及使用内抑制素蛋白质和肽片段、相应的核酸的序列、与抑制剂及其肽特异结合的和抗体诊断与内皮细胞有关的疾病和紊乱的方法。
本发明还包括鉴定内抑制素特异性受体的方法和由此鉴定和分离的受体分子。
本发明也涉及鉴定能够由XVIII型胶原释放内抑制素的新型酶的方法、包含内抑制素氨基酸序列的其它分子及其肽。这种产生内抑制素的酶也是本发明的一部分。
重要的医学方法是产生了一种避孕的新形式，其中向女性施用有效量的内抑制素以便抑制子宫内膜血管的形成，因此胚胎无法植入或继续生存。
本发明特别重要的方面是发现了治疗患者的与血管生成有关的疾病(特别是依赖于血管生成癌)的新型而有效的方法和治疗患者的依赖于血管生成癌的方法。出人意料地，本方法提供了抑制肿瘤生长和减少肿瘤量重要医疗结果。本方法还涉及共同使用本发明的内抑制素和另一种抗血管生成化合物(优选的是血管抑制素)。因此，本发明也包括包含内抑制素、可以包含也可以不包含血管抑制素的制剂，其量对于治疗依赖于血管生成的癌是有效的。
因此，本发明的目的是提供包含内抑制素蛋白质的组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗由血管生成介导的疾病和过程的方法。
本发明的另一个目的是提供用于检测体液或组织中内抑制素的存在和存在量的诊断或预测方法及试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于治疗由血管生成介导的疾病和过程的方法和组合物，这些疾病包括(但不限于)血管瘤、固形肿瘤、白血病、转移肿瘤、毛细管扩张性硬皮马勃属牛皮癣、生脓肉芽瘤、心肌血管生成、噬斑新血管生成、冠状(corornay)侧突、小脑侧突、动静脉畸形、局部缺血的分支血管生成、角膜疾病、潮红、新血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、特里氏综合征、风湿性关节炎、糖尿病性新血管生成、视网膜黄斑变性、创伤愈合、消化溃疡、骨折瘢痕瘤、血管生成、血细胞生成、排卵、月经和胎盘形成。
本发明的另一个目的是提供用于治疗或者抑制癌发展的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于检测和定量体液中存在的内抑制素特异性抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供包含对内抑制素分子的特异性区域具有选择性的内抑制素抗体的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于检测或预测癌的方法。
本发明的另一个目的是提供用于在体内和体外目测检验和定量内抑制素结合位点的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于检测和定量内抑制素生物合成的组合物。
本发明的另一个目的是提供具有最小副作用的癌症治疗方法。
本发明的另一个目的是提供用于治疗或抑制癌的生长的包含内抑制素或者与细胞毒性剂结合的内抑制素肽的组合物。
通过阅读下面公开的实施方案的详细描述和附加的权利要求后，本发明的这些目的和其它目的以及特性和优点就会变得明显了。
附图的简要描述
图1EOMA细胞的条件培养基对毛细管内皮细胞增殖的抑制作用。
将从铺满的EOMA细胞收集的条件培养基或基本培养基以1ng/mlbFGF用于牛毛细管内皮细胞上，进行72小时增殖测定。EOMA条件培养基抑制内皮细胞增殖。每一个条代表平均值±SEM。
图2从EOMA条件培养基纯化内皮增殖抑制剂。
将从铺满的EOMA细胞收集的条件培养基在肝素琼脂糖凝胶柱上分级分离。在大约0.8M NaCl下洗脱出内皮增殖抑制活性。
图3通过凝胶过滤纯化内皮增殖抑制剂。
将用肝素琼脂糖凝胶柱层析纯化的抑制剂加入到凝胶过滤柱中，并以单峰洗脱下来。
图4通过反相柱层析纯化内皮细胞增殖抑制剂。
把通过琼脂糖凝胶和凝胶过滤层析所纯化的抑制剂加入到反相柱中。在大约45％乙腈下从柱中以单带洗脱出所说的抑制剂。
图5内皮细胞增殖抑制剂的N-末端氨基酸序列。
图中显示了纯化的内皮细胞增殖抑制剂的N-末端氨基酸序列和相关的胶原类型18的示意图。公开的抑制剂的N-末端序列和XV型胶原II的大约20kDa C-末端片段(实线所示)具有等同性。空白方框代表XVIII型胶原的胶原酶区域。
图6.用重组小鼠内抑制素抑制剂处理路易士肺癌。
把在大肠杆菌中产生的重组抑制剂施用给用路易士肺癌接种的小鼠，得到大约150mm3大的肿瘤。以20mg/Kg/天施用抑制剂。在处理大约12天后，肿瘤物消退到不能检测的水平。
图7用重组内抑制素消退路易士肺癌初期肿瘤的全身治疗。
(A)在小鼠的背上皮下移植路易士肺癌细胞。当肿瘤大约有200mm3(体重的1％)时用重组鼠内抑制素以20mg/Kg/天进行全身治疗。用内抑制素抑制剂治疗的小鼠的肿瘤迅速消退，和用盐水治疗的对照相比，抑制达99％以上。每一点代表5只小鼠的平均值±SEM。重复进行实验，结果具有可比性。
(B)用内抑制素进行全身治疗11天后，治疗和未治疗的患有肿瘤的小鼠。盐水治疗的小鼠(右边)很快长出了表面溃烂的红色肿瘤。内抑制素治疗的小鼠(左边)只有小的白色残余的肿瘤(箭头)。
(C)用内抑制素治疗的小鼠的残余的肿瘤。在进行16天治疗后，五只用内抑制素治疗的小鼠中有三只死亡。尸体解剖显示在原来初期接种位置的小白色残余肿瘤(箭头)。
图8在大肠杆菌产生的重组鼠内抑制素治疗鼠T241纤维肉瘤。
用T241纤维肉瘤细胞接种小鼠。用盐水处理对照小鼠。用来源于大肠杆菌的重组鼠内抑制素以20mg/kg/天治疗试验小鼠。
图9用大肠杆菌产生的重组鼠内抑制素治疗鼠B16F10黑素瘤。
用鼠B16F10黑素瘤细胞接种小鼠。用盐水处理对照小鼠。用来源于大肠杆菌的重组鼠内抑制素以20mg/kg/天治疗试验小鼠。
图10用大肠杆菌产生的重组鼠内抑制素治疗EOMA血管内皮瘤。
用EOMA血管内皮瘤细胞接种小鼠。用盐水处理对照小鼠。用来源于大肠杆菌的重组鼠内抑制素以20mg/kg/天治疗试验小鼠。
图11用大肠杆菌培养的重组鼠或人内抑制素治疗路易士肺癌。
用路易士肺癌细胞接种小鼠。用盐水处理对照小鼠。用来源于鼠序列的重组内抑制素或者来源于人序列的重组内抑制素治疗试验小鼠，其中两种内抑制素都是在大肠杆菌中重组产生的。以20mg/kg/天或2.5mg/kg/天的量施用鼠内抑制素，以20mg/kg/天施用人内抑制素。
图12内抑制素产生血管生成抑制作用和增加路易士肺癌初期肿瘤的编程性细胞死亡。
将用盐水治疗和用内抑制素治疗的小鼠(已用路易士肺癌肿瘤接种)的肿瘤组织学切片进行增殖(PCNA)、编程性细胞死亡(TUNEL)、血管生成(vWF)等分析。治疗和未治疗的肿瘤相比，肿瘤细胞(A)增殖指数没有显著差异。相反，用内抑制素治疗的小鼠的肿瘤细胞(B)的编程性细胞死亡指数增加了8倍(P＜0.001)。通过用vWF抗体染色计算切片中高倍视野(HPF)中的毛细血管的数量来确定血管密度。在显微镜下用内抑制素治疗的小鼠残余肿瘤的血管生成几乎完全受到抑制(P＜0.001)。
图13用大肠杆菌产生的重组鼠内抑制素对路易士肺癌进行循环休眠治疗将路易士肺癌细胞皮下接种在小鼠背上。在肿瘤大约200mm3(体重的1％)时，开始以20mg/kg/天的剂量施用重组小鼠抑制剂(内抑制素)，进行全身治疗。治疗大约15天后，用内抑制素抑制剂治疗的小鼠的肿瘤迅速消退到实质上不能检测到的水平。当停止治疗时，肿瘤的量迅速增加，随后再用内抑制素抑制剂治疗，肿瘤又恢复的到原来的不能检测的水平。图中的峰和谷表明内抑制素抑制作用的循环效果。
图14用大肠杆菌产生的重组鼠血管抑制素和内抑制素的组合治疗。
将路易士肺癌细胞皮下接种在小鼠背上。在肿瘤大约300mm3时，开始用重组鼠内抑制素(20mg/kg/天)和鼠血管抑制素(20mg/kg/天)进行全身治疗。治疗大约15天后，用组合方法治疗的小鼠的肿瘤迅速消退到实质上不能检测到的水平。很重要的是消退的肿瘤还在背上，并且在治疗停止时大小或质量上不再增加。这是意想不到的具有重要医学价值的结果。
本发明的详细描述本申请申请人发现了一种新类型的蛋白质分子，当在体外将这种蛋白质分子加入到增殖的内皮细胞上时，其具有抑制增殖的能力。因此，将这些蛋白质分子在功能上定义为内抑制素。然而，应该理解这种功能性的定义无意于限制内抑制素在体外或体内对内皮细胞生长的抑制作用的生物学活性。内抑制素可能具有许多其它功能。
术语＂内抑制素＂是指一种优选的18kDa-20kDa(分别通过非还原和还原凝胶电泳测定的)的蛋白质。术语内抑制素也包括18kDa-20kDa蛋白质的前体形式。术语内抑制素也包括具有实质上与所说的蛋白质相同的氨基酸序列并且能够抑制内皮细胞增殖的18kDa-20kDa蛋白质的片段、修饰的蛋白质和肽。例如，氨基酸的沉默取代，其中所说的用结构上或化学上类似的氨基酸进行取代没有明显地改变蛋白质的结构、构象或活性，这是本领域公知的。这种沉默取代是在附加的权利要求的范围之内。
术语＂内抑制素＂包括截短的蛋白质或者肽，其中从内抑制素的一端或两端或蛋白质的内部区域除去一个或多个氨基酸，而产生的分子仍然保持抑制内皮增殖的活性，这一点也是可以理解的。术语＂内抑制素＂也包括加长了的蛋白质或者肽，其中在内抑制素蛋白质的一端或两端或中间位置加入一个或多个氨基酸，而产生的分子仍然保持抑制内皮增殖的活性。在分析测定中，将这样的分子(例如在开始的位置上加入酪氨酸的蛋白质)用作标记(例如用125I的放射性碘标记)对测定非常有用的。其它的放射性同位素标记在提供破坏靶细胞的分子工具方面是有用的。使用分子(如篦麻毒素)的其它标记可以提供用内抑制素受体破坏细胞的机制。
＂实质上的序列同源性＂是指在内抑制素类似物序列中的氨基酸残基序列和内抑制素序列中的氨基酸残基序列之间具有至少大约70％的同源性，优选的至少大约80％同源性，更优选的至少大约90％同源性。
内抑制素蛋白质、它的亚基和肽片段的修饰也包含在术语内抑制素的定义中。这样的修饰包括其它分子(包括(但不限于)天然和非天然存在的氨基酸)在特异性位点天然发生的氨基酸的取代。这样的取代可以改变内抑制素的生物活性和产生生物或者药理上的兴奋剂或者拮抗剂。术语内抑制素也包括内抑制素的N末端片段，其中所说的内抑制素包含在SEQ ID NO1和表1所示的头20个N末端氨基酸序列的序列。所说的头20个N末端氨基酸序列和新近鉴定的XVIII型胶原的C-末端片段相对应。
表1显示出三字母和单字母氨基酸名称的对应关系。
表1氨基酸 残基 缩写1 HISH2 THRT3 HISH4 GLNQ5 ASPD6 PHEF7 GLNQ8 PROP9 VALV10LEUL11HISH12LEUL13VALV14ALAA15LEUL16ASNN17THRT18PROP19LEUL20SERS内抑制素的N-末端氨基酸序列和在小鼠胶原α1类型XVIII中发现的开始于第1105氨基酸结束于第1124氨基酸的20个内部氨基酸的肽片段相对应。抑制剂的N-末端氨基酸序列和在人α1 XVIII型胶原中发现的开始于第1132氨基酸结束于第1151氨基酸的20个内部氨基酸的肽片段相对应。
可以从鼠血管内皮瘤EOMA中分离内抑制素。可以从重组来说、从植入到动物中的遗传上改变的细胞、肿瘤、细胞培养物和其它途径产生内抑制素。在神经系统的细胞中产生内抑制素是优选的。可以从体液(包括(但不限于)血清、尿和腹水)中分离内抑制素，或者通过化学或者生物合成方法(例如细胞培养、重组基因表达、肽合成和体外酶催化前体分子以产生具有活性的内抑制素)产生内抑制素。重组技术包括利用聚合酶链式反应(PCR)由DNA进行基因扩增和利用反转录酶/PCR的RNA基因扩增。
内抑制素能够特异地和可逆地抑制内皮细胞增殖。本发明的蛋白质分子抑制剂作为避孕药物、治疗与血管生成有关的疾病(特别是依赖于血管生成癌和肿瘤)是有用的。所说的蛋白质分子对治疗依赖于血管生成癌和肿瘤也是有用的。这些新型化合物治疗和治愈依赖于血管生成癌和肿瘤的意想不到的令人惊奇的能力回答了困扰医学界很长时间的问题，其给人类提供了非常大的益处。
本文所使用的重要术语定义如下。＂癌＂是指依赖于血管生成癌和肿瘤，即需要增加血管的数量和密度以从血液中获得营养来生长(在体积和/或质量上的扩展)的肿瘤。＂消退＂是指肿瘤质量和大小的的减少。
可以通过本领域技术人员公知的自动蛋白质合成方法产生本发明的内皮增殖抑制蛋白质。另外可以从较大的已知蛋白质(例如人类α1XVIII型胶原和鼠α1 XVIII型胶原、具有一般或类似N-末端氨基酸序列的蛋白质)分离本发明的内皮增殖抑制蛋白质或者内抑制素。其它具有相似的N-末端氨基酸序列的潜在的内抑制素源材料的例子包括牛胃酯酶、人α115型胶原、来源于Pseudomanas sp.依赖NAD的甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2)、牛腺病毒类型3的s11459六邻体蛋白质、CELF21D12 2 F21d12.3 Caenorhabditis elegans基因产物、来源于蕃茄金黄花叶病毒的VALl TGMV ALl蛋白质、来源于人腺病毒12和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的s01730六邻体蛋白质等。例如，可以从BOVMPE 1前胃酯酶(BOS TAURUS)基因序列相应的502-521氨基酸、人α115型胶原(起始于316氨基酸结束于335氨基酸)获得与内抑制素密切相关的肽。
使用生物活性测定分析方法(例如牛毛细管内皮细胞增殖测定)可以快速而且方便地检测来源于以上物质和其它来源的蛋白质和肽(包括手动或者自动蛋白质合成)的内皮增殖抑制活性。其它的抑制活性的生物测定方法包括鸡CAM测定、鼠角膜测定和施用分离的或合成的蛋白质对接种的肿瘤的作用。O′Reilly等在＂转移性生长的血管生成调节＂(细胞vol.79(2)，10月21日1994，pp.315-328)中描述的鸡CAM测定，本文一并参考。简言之，从鸡蛋中分离出3天大的完整的鸡胚，并放入培养血中。在包含将要检验蛋白质的甲基纤维素陪替氏培养皿中培养3天之后，将其加入单个胚的CAM。在培养48小时之后观察胚和CAM以确定内皮生长是否受到抑制。小鼠角膜测定包括将包含生长因子的小药丸以及另一个包含可能的内皮生长抑制剂的小药丸植入到小鼠角膜中，并观察在角膜中形成的毛细管的模式。
本发明也包括对应于(编码)本发明的抑制内皮增殖的蛋白质分子的核酸序列和编码与这种蛋白质分子特异结合的单克隆和多克隆抗体的核酸序列。在体内调节内皮过程、诊断和治疗与内皮细胞有关的疾病(例如基因治疗)方面，本发明的生物活性蛋白质分子、对应于此蛋白质的核酸序列、与此蛋白质特异结合的抗体是有用的。
可以根据已知的氨基酸序列、密码子(三个核酸碱基的序列)与氨基酸的对应关系知识制备对应于(编码)内抑制素和内抑制素类似物核酸序列。由于遗传密码的简并性，在密码子中的三个碱基发生变化仍可以编码同一氨基酸，对于任何特殊的蛋白质或者肽片段都可以得到多种不同的可能编码核酸的序列。
使用本领域公知的自动系统合成核酸序列。可以合成整个序列，或者合成一系列较短寡核苷酸，然后将这些寡核苷酸连接到一起产生全长序列。此外，可以使用以N-末端氨基酸序列为基础设计的寡核苷酸探针和公知的用于克隆基因物质的技术从基因库得到所说的核酸序列。
本发明也包括检测体液和组织中的内抑制素，以便诊断和预防和血管生成有关的疾病(例如癌症)。本发明也包括在细胞和组织中检测内抑制素结合位点和受体。本发明也包括治疗或者抑制血管生成疾病和过程的方法，包括(但不限于)通过刺激内抑制素的产生；和/或向患者施用实质上纯化的内抑制素、或者内抑制素兴奋剂或拮抗剂、和/或内抑制素抗血清或者直接针对于内抑制素抗血清的抗血清来治疗关节炎和肿瘤。另外的治疗方法包括施用内抑制素、内抑制素片段、内抑制素抗血清或与细胞毒性剂结合的内抑制素受体兴奋剂和拮抗剂。应该理解所说的内抑制素可以来源于动物或人。内抑制素可以是经化学反应或与表达系统结合的重组技术通过合成的方法产生的。也可以通过酶促切割不同的分子(包括包含内抑制素片段同源或者等同性序列的内抑制素前体，以便产生具有抗血管生成活性的肽)。
可以使用被动抗体疗法(使用与内抑制素特异结合的抗体)调节依赖于内皮的过程(如繁殖、发育、创伤愈合和组织修复)。此外，可以施用针对于内抑制素抗体Fab区的抗血清来阻断内源内抑制素抗血清与内抑制素结合的能力。
按照本领域公知的技术产生内抑制素和内抑制素类似物的特异抗体。所说的抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。在公知的免疫测定格式(如竞争和非竞争免疫测定，包括的ELISA、夹层免疫测定和放射免疫测定(RIAs))中使用所说的抗体以便确定体液中是否存在本发明的内皮增殖抑制剂。体液的例子(但不限于)包括血液、血清、腹膜液、胸膜液、脑脊液、子宫液、唾液和粘液。
本发明的蛋白质、核酸序列和抗体对诊断和治疗与内皮细胞有关的疾病和紊乱是有用的。特别重要的内皮细胞过程是血管生成(血管的形成)。可以使用本发明的内皮细胞增殖抑制蛋白质诊断和治疗与血管生成有关的疾病。与血管生成有关的疾病包括(但不限于)依赖于血管生成的癌(例如包括固形肿瘤、blood born肿瘤(如白血病)、肿瘤转移)；良性肿瘤(如血管瘤、神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、生脓肉芽瘤)；风湿性关节炎；牛皮癣；眼睛血管生成疾病(例如糖尿病性视网膜病、早熟视网膜病、视网膜黄斑变性、角膜移植排斥、新血管性青光眼、特里氏综合征、潮红)；Osler-Webber综合征；心肌血管生成；噬斑新血管生成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤和创伤肉芽。本发明的内皮细胞增殖抑制蛋白质在治疗内皮细胞过量或反常刺激的疾病是有用的。这些疾病包括(但不限于)肠粘连、粥样硬化、硬皮病和肥厚性疤痕(即瘢痕瘤)。它们在治疗以血管生成为病理后果的疾病(如猫抓疾病(Rochele minalia quifltosa)、溃疡(Helobacter pylori))方面也是有用的。
内皮细胞增殖抑制蛋白质也可以作为避孕剂，通过减少或者抑制胚胎植入所需要的子宫血管的形成而起作用。这样当将一定量的足以阻止胚胎植入的抑制蛋白质施用给女性，本发明提供了有效的避孕方法。在此避孕方法的一个方面，将一定量的足以阻止胚胎植入的抑制蛋白质在性交和受精前后使用，这样就提供了有效的避孕方法(即“早晨后”方法)。换句话说，也可以是子宫内膜血管形成的抑制作用干扰了囊胚泡的植入。同样输卵管粘膜血管形成的抑制作用也干扰囊胚泡的植入，结果阻止了输卵管妊娠的发生。给药方法包括(但不限于)丸剂、注射(静脉、皮下、肌内)、栓剂、阴道海绵物、阴道塞和宫内装置。一般认为内抑制素的使用将干扰胎盘正常血管的进一步形成，另外也干扰成功植入的囊胚泡、发育胚和胎儿血管的发育。
相反，用充当受体拮抗剂的内抑制素类似物阻塞内抑制素受体能促进内皮形成和血管形成。这样作用在子宫内膜血管形成不足、与不育有关的情况、创伤修复、切口愈合、治疗糖尿病的血管问题(尤其是视网膜和外周血管)、促进移植组织(包括肌肉和皮肤)的血管形成、促进心肌的血管形成(尤其是在心脏或心脏组织移植后及搭桥(bypass)手术后)、促进固形和相对流动的肿瘤的血管形成结果提高了细胞毒素的运输、提高了神经系统(包括但不限于脑部皮质与脊髓)的血流量。
意外的发现是未折叠的和不可溶的重组内抑制素也是有力的抗血管生成化合物，这种化合物当施用给患者时可以作为持续的释放源。
本发明也使用内抑制素、内抑制素的内皮细胞增殖抑制肽片段、对应于内抑制素及其活性肽片段的核酸序列、与内抑制素及其肽特异结合的抗体来诊断与内皮细胞有关的疾病和紊乱。
本发明还包括鉴定内抑制素特异受体的方法，及由此所确定和分离的受体分子。
本发明也提供了内抑制素受体的定量方法。
本发明的特别重要的方面是发现了一种新型、有效的治疗患者的依赖于血管生成癌的方法。意外地发现了以足以抑制肿瘤生长并使肿瘤的大小减退到只有在显微镜下才能见到的大小的量配合施用内抑制素和血管抑制素能够治疗依赖于血管生成癌。因此，本发明也包括有效处理(或治疗)依赖于血管生成癌和肿瘤的制剂.
更特别的是，来源于昆虫细胞或者大肠杆菌的重组小鼠内抑制素能够强烈地抑制血管生成及转移的和初级肿瘤的生长。在一种新型持续释放的方法中，以非折叠的悬液和足以抑制血管生成的量施用来源于大肠杆菌的重组内抑制素可以抑制肿瘤的生长。当以足以造成肿瘤消退的量施用重组内抑制素时，能够减少肿瘤的大小。当使用内抑制素进行治疗时，最初占体重1-2％的肿瘤的大小可以减少150倍以上，成为在显微镜下可见的休眠损伤。休眠肿瘤的免疫组织化学分析表明伴随封锁性血管生成的肿瘤细胞高速增殖与肿瘤细胞的高速编程性细胞死亡抵消(balance)。没有发现任何内抑制素处理的小鼠发生毒性反应。
作为本发明的一部分，内抑制素可以从体液(患者的血液或者尿)中分离，或者通过本领域普通技术人员公知的重组DNA方法或者合成肽化学方法产生所说的内抑制素。蛋白质纯化方法是本领域公知的，在下文的实施例中给出了纯化内抑制素及分析其抑制活性的方法的特定例子。使用相似的技术分离人内源性内抑制素。
一个使用重组DNA技术产生内抑制素的方法的例子必需包括下列步骤(1)如上所述及下文的详细描述鉴定和纯化内抑制素，(2)测定纯化的抑制剂的N-末端氨基酸序列，(3)合成相当于N-末端氨基酸序列的DNA寡核苷酸探针，(4)产生人或者其它哺乳动物的DNA基因库，(5)用DNA寡核苷酸探针检测基因库，(6)选择与寡核苷酸杂交的克隆，(7)从此克隆中分离抑制剂基因，(8)将此基因插入到适当的载体(如表达载体)中，(9)将包含基因的载体插入到能够表达抑制剂基因的微生物或其它表达系统中，(10)分离重组产生的抑制剂。实验室手册(如“分子克隆实验室手册”Sambrook等编辑，第二版，冷泉港出版社，1989)中充分描述了上述的技术。
可以通过以下步骤从表达高水平内抑制素的细胞或者组织中分离内抑制素的基因(1)从组织中分离信使RNA，(2)使用逆转录酶产生相应的DNA序列和(3)使用适当的引物通过PCR扩增编码活性内抑制素氨基酸序列的DNA序列。
产生内抑制素或者它地生物活性片段的另一种的方法是通过肽合成。一旦使用下面详细描述的测定系统发现内抑制素生物活性片段，就可以通过，例如自动肽测序方法对它进行测序。另外，一旦通过，例如以上描述的方法分离出编码内抑制素的基因或者DNA序列，就可以测定DNA序列，然后可以提供了有关氨基酸序列的信息。因此，如果通过特定的方法(例如胰蛋白酶消化)产生具有生物活性的片段，或者如果这种片段是N-末端序列，可以通过相应的DNA序列确定余下的氨基酸序列。
一旦了解了肽的氨基酸序列(例如N-末端的20个氨基酸)，可以通过本领域熟知的技术合成这个片段，例如通过E.Atherton和R.C.Sheppard在“固相肽合成一种切实可行的方法”(IRL出版社，牛津大学，英国)中的描述进行。同样地，可以合成多个片段，这些片段最好连接到一起以便形成更大的片段。可以用在特定位置的氨基酸取代，进行这些肽片段的合成以便体外和体内检测刺激和拮抗活性。可以使用与组织具有高度亲和性的肽片段在亲和性柱上分离内抑制素受体。对于阐明内抑制素活性机理，内抑制素受体的分离和纯化是根本步骤。这种方法有利于产生调节内抑制素受体活性的药物，最终产生生物活性。这种受体的分离使得可以构建使用原位和溶液杂交技术监测受体位置及合成的核苷酸探针。
内抑制素在治疗血管生成介导的或与血管生成有关的疾病和过程中是有效的。本发明包括以有效的量的内抑制素或内抑制素兴奋剂和拮抗剂治疗血管生成介导的疾病的方法。血管生成介导的疾病包括(但不限于)固形肿瘤；血生性(blood born)肿瘤(如白血病)；肿瘤转移；良性肿瘤(如血管瘤、神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、生脓肉芽瘤)；风湿性关节炎；牛皮癣；眼睛血管生成疾病(例如糖尿病性视网膜病、早熟视网膜病、视网膜黄斑变性、角膜移植排斥、新血管性青光眼、特里氏综合征、潮红)；Osler-Webber综合征；心肌血管生成；噬斑新血管生成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤和创伤肉芽。本发明的内皮细胞增殖抑制蛋白质在治疗内皮细胞过量或反常刺激的疾病是有用的。这些疾病包括(但不限于)肠粘连、粥样硬化、硬皮病和肥厚性疤痕(即瘢痕瘤)。通过抑制囊胚泡植入和胎盘、囊胚泡、胚、胎儿的发育所需的血管形成，内抑制素可以作为避孕剂。
内抑制素的合成肽片段具有多种功能。将与内抑制素受体以高度特异性和亲合力结合的肽进行放射性标记，并可用于通过放射自显影和膜结合技术显现和定量结合位点。本申请提供了重要诊断和研究工具。内抑制素受体结合特性的知识有利于研究与受体相关的转导机制。
此外，用短的活性同位素标记这些肽可以通过使用正电子发射断层摄影术和其它现代放射自显影技术体内显示受体结合位点以便定位带有内抑制素结合位点的肿瘤。
在这些合成的肽中进行氨基酸的系统取代产生与内抑制素受体具有高亲和性的肽兴奋剂和拮抗剂，它们可以促进或减弱内抑制素受体的结合。这些兴奋剂可用来抑制小的转移性肿瘤的生长，因此限制了癌症的扩散。内抑制素的拮抗剂可以用于定位小量的血管形成以便抑制血管抑制素的抑制作用并可能促进血管生成。这种处理可能具有治疗作用，促进糖尿病患者的创伤愈合。
内抑制素肽可以用于开发亲和性柱以便从培养的肿瘤细胞分离内抑制素受体。内抑制素受体分离和纯化后进行氨基酸测序。接下来合成核苷酸探针以便插入到表达此受体的载体中。这些技术对本领域技术人员来说是公知的。将这些内抑制素受体转染到肿瘤细胞中能够提高这些细胞对内源或外源内抑制素的反应，因此降低了转移性肿瘤的生长速率。
细胞毒性剂(如蓖麻毒蛋白)与内抑制素和高亲和性的内抑制素肽片段结合，因此能够提供了破坏与内抑制素结合的细胞的工具。可以在许多位置发现这些细胞，这些位置包括(但不限于)小的转移性肿瘤和初期肿瘤。以能够将这些肽最大限度地输送到所需位置的方式注入与细胞毒性剂结合的肽。例如，把与蓖麻毒蛋白结合的高亲和性内抑制素片段通过插输送到提供了靶位点的血管中或者直接输送到靶上。也可以以可控的方式通过与注入插管结合的渗透泵输送这些试剂。可以将内抑制素拮抗剂和血管生成的刺激物组合使用来增加组织的血管形成。这种治疗方法提供了一种破坏转移性癌的有效手段。
按照本发明，内抑制素可以与其它治疗疾病的组合物及方法组合使用。例如，肿瘤可以通过外科手术、放射或化疗与内抑制素结合来进行常规治疗，然后向患者施用内抑制素以便延长小的转移性肿瘤的休眠并且稳定任何剩余的初期肿瘤。
本发明的内抑制素也可以用来产生抑制剂特异的抗体。所说的抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。这些与所说的内抑制素特异结合的抗体可以用于本领域普通技术人员公知的检测或定量体液或者组织中的内抑制素的诊断方法和试剂盒中。这些实验的结果可以用于诊断或预测癌及其它血管生成介导的疾病的发生或者复发。
所说的内抑制素也可以用于检测和定量能够与内抑制素结合的抗体的诊断方法和试剂盒。这些试剂盒可以检测循环的内抑制素抗体，这些抗体在原位上表明在初期肿瘤分泌的内抑制素存在下微转移肿瘤的扩散，具有这种循环抗内抑制素抗体的患者很有可能发展成肿瘤和癌，并且在治疗或消退期后癌很有可能复发。这些抗内抑制素抗体的Fab片段可以用作抗原以便产生抗内抑制素Fab-片段抗血清，这种抗血清可以用于抵消由抗内抑制素抗体除去的循环对内抑制素。
本发明的另一个方面是抑制过量内源内抑制素活性的方法。这可以通过由系统中不需要的内抑制素的特异抗体对人或动物进行被动免疫而完成。在治疗反常排卵、月经和胎盘形成、血管发生方面这种处理是重要的。这种方法提供了一种有用的检测转移过程中内抑制素消除效果的工具。内抑制素抗体的Fab片段包含内抑制素的结合位点。使用本领域技术人员公知的技术从内抑制素抗体中分离此片段。内抑制素抗血清的Fab片段用作抗原以便产生抗Fab片段血清。注入抗内抑制素的Fab片段的抗血清能够抑制内抑制素与内抑制素抗体的结合。通过阻止内抑制素与抗内抑制素的Fab片段结合而抵消内源抗内抑制素抗体，从而可以达到治疗目的。这种治疗的最终效果有利于增加内源循环内抑制素到达靶细胞的能力，因此减少了肿瘤的扩散。
应该理解本发明包括具有内皮抑制活性的内抑制素的任何衍生物。本发明包括完整的内抑制素蛋白质、所说的内抑制素蛋白的衍生物和内抑制素蛋白的生物活性片段。这些蛋白质包括具有内抑制素活性且发生氨基酸取代或包含与氨基酸功能基团结合的糖或者其它分子的蛋白质。本发明也包括编码内抑制素和内抑制素受体的基因，和由这些基因表达的蛋白质。
可以在药学上可接受的制剂(使用本领域普通技术人员公知的方法配制)中以分离的或实质上纯化的蛋白质和蛋白质片段提供了上述具有内抑制素活性的蛋白质和蛋白质片段。可以将这些制剂通过标准途径施用。一般来说，组合使用局部、经皮肤、腹膜内、颅内、脑室内、大脑内、阴道内、宫内、口服、直肠、或肠胃外(例如静脉内、脊柱内、皮下或者肌内)途径给药。此外，内抑制素可以与生物降解聚合物组合使用，这种聚合物可以使内抑制素持续释放，所说的聚合物植入到需要药物运输的附近(例如肿瘤位点)或者植入聚合物以便内抑制素在全身进行慢慢释放。渗透微型泵也可以用来控制高浓度内抑制素，通过插管达到兴趣位点的运输，例如直接运输到生长的转移肿瘤内或向此肿瘤供血的血管中。例如，Brem等(神经外科杂志74441-446(1991))详细描述了生物降解的聚合物和它们的用途，其全部内容本文一并参考。
本发明内抑制素的剂量取决于疾病状态、或治疗状态、其它临床因素(如人或动物体重和状态)和给药途径。对于治疗人或动物，可以施用大约0.5mg/Kg-500mg/Kg的内抑制素。更优选地范围是1mg/Kg-100mg/Kg，最优选的范围是2mg/Kg-50mg/Kg。根据内抑制素在特定动物或人中的半衰期，可以一天几次到一周一次施用所说的内抑制素。应该理解本发明的申请包括人和兽医用途两部分。本发明的方法考虑到单一或多种途径给药，这些给药方法同时进行或在一段时间内。
所说的内抑制素制剂包括适于口服、直肠、眼睛(包括脉络膜内或者眼房内)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、宫内、阴道或胃肠外(包括皮下、腹膜内、肌内、静脉内、真皮内、颅内、气管内、硬膜外)给药的内抑制素。所说的内抑制素制剂可以以方便的单位剂量的形式存在，并且可以通过常规的药物技术制备。这些技术包括将活性成分与药物载体或者赋形剂(可以有几种)组合到一起的步骤。一般来说，通过将所说的活性成分与液体载体或充分分散的固体载体或者二者均一地且密切地组合到一起而制备所说的制剂，然后如果需要将产品作成一定的形状。
适于肠胃外施用的制剂包括含水和不含水的无菌注射液(包括抗氧化剂、缓冲液、制菌剂和能够使此制剂与将要治疗的患者的血液达到等渗的溶质)；含水和不含水的无菌悬液(包含延缓剂和增厚剂)。此制剂可以存放在单位剂量或者多剂量的容器(如安瓿和药水瓶)中，并贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前加入无菌液体载体(如注射用水)。可以从上文描述的无菌粉沫、颗粒剂和丸剂制备临时使用的注射液和悬液。
如上所述优选的单位剂量制剂是包含日使用剂量或单位(每次使用的剂量)的制剂，或者是施用成分的合适部分。应该理解除了上文特别提到的成分外，本发明的制剂可以包括其它的与讨论的制剂类型有关的常规试剂。
可以合成完整的内抑制素分子的不同肽片段用于其它几种用途，所说的用途包括但不限于作为产生特异抗血清的抗原；在内抑制素结合位点作为活性兴奋剂和拮抗剂；作为与细胞毒性剂结合的肽，以便定向杀死与内抑制素结合的细胞。以这些肽在该分子外部区的位置为基础选择包含这些肽的氨基酸序列，这些氨基酸序列可以于抗血清结合。内抑制素的氨基与羧基末端分子的中部区分别存在于将要合成的片段中。内抑制素第20个氨基酸的氨基末端和羧基末端可以包含(或者通过调节使之包含)酪氨酸和赖氨酸残基，并用许多技术标记所说的氨基末端和羧基末端。将酪氨酸或者赖氨酸加入到不含这些残基的片段中，以便有利于此肽中反应氨基和羟基基团的标记。使用序列数据库将这些肽序列于已知序列比较以便测定潜在的序列同源性。这些信息有利于除去与其它分子具有高度序列同源性的序列，因此在产生内抑制素的抗血清、兴奋剂和拮抗剂时提高了高特异性的潜力。
可以用标准的微量化学设备，以HPLC和质谱检测的纯度合成肽。通常肽合成、HPLC纯化和质谱方法对这些领域的技术人员是公知的。
也可以在下文描述的重组大肠杆菌、或者昆虫或酵母表达系统中产生肽和内抑制素，并用柱层析进行纯化。
可以使用标准方法将内抑制素和内抑制素衍生肽与其它分子结合。内抑制素的第20个氨基酸远端和羧基末端都可以包含酪氨酸和赖氨酸残基，并通过许多技术进行同位素和非同位素标记，例如使用常规技术进行放射性标记(酪氨酸残基-氯胺T，生碘，乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)。这些结合技术对本领域技术人员是公知的。基于可以存在于氨基酸上的功能基团(氨基、巯基、羧基，酰胺、苯酚、咪唑)选择所说的结合技术。其它的对这些结合有效的各种试剂包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。
将内抑制素肽与同位素、酶、载体蛋白质、细胞毒性剂、荧光分子和其它具有多种用途的化合物通过化学方法结合。通过使用特定反应的合适的技术测定结合反应的有效性。例如，通过使用氯胺T和高特异性活性的Na125I用125I对内抑制素肽或者蛋白质进行放射性标记。用偏亚硫酸氢钠终止反应，在一次性柱上对混合物脱盐。从柱中洗脱标记的肽，并收集组分。从每个组分中取出等分试样，在γ计数器中测量放射活性。在这种情况下，从标记的内抑制素肽中分离未反应的Na125I。贮存具有最高特异放射活性的肽组分，以便使用(例如用于结合内抑制素抗血清的能力的分析)。
肽缀合物的另一个的应用是产生多克隆抗血清。例如，使用戊二醛将包含赖氨酸残基的内抑制素肽连接到纯化的牛血清白蛋白上。通过测量加入的放射性标记肽来确定此反应的效率。通过透析分离未反应的戊二醛和肽。贮存缀合物以便使用。
可以产生抗内抑制素的抗血清。在合成和纯化肽之后，使用本领域技术人员公知的现有技术培养单克隆和多克隆抗血清。例如，可以在兔、山羊、绵羊或者其它动物上培养多克隆抗血清。将连接到载体分子(例如牛血清白蛋白或者内抑制素本身)上的内抑制素肽与佐剂混合物结合，将其乳化，并在多个部位(背、颈、胁腹、有时可以在脚趾(footpads)上)进行皮下注射。在一定的间隔内进行加强注射，例如每2-4周注射一次。在每次注射后大约7-10天通过静脉穿刺术获得血液样品(例如在扩张后，由耳边缘静脉获得血液样品)。4℃下使血液样品过夜凝块，并且4℃下在大约2400Xg下离心30分钟。除去血清，将样品分成等分试样，如立即使用则贮存在4℃；如用于以后分析则贮存在-20℃至-90℃。
对多克隆抗血清产生的所有血清样品或者单克隆抗血清产生的培养基样品进行滴度测定分析。通过几种方法(例如点印迹和密度分析)进行滴度测定，也可以使用蛋白质A、次级抗血清、冷乙醇或者炭-葡聚糖沉淀放射标记的肽-抗体复合物，然后用微克计数器测量活性。在市售的亲和性柱上纯化最高滴度的抗血清。在亲和性柱上将内抑制素肽于凝胶结合。将抗血清样品通过柱，抗内抑制素抗体仍然与柱结合。然后洗脱、收集这些抗体，并且评价滴度测定和特异性测定。
检验最高滴度的内抑制素抗血清以便确定下列各项a)与所说的抗原具有最高特异性结合和最低非特异性结合的最佳抗血清稀释度，b)在标准位移曲线中与数量不断增加的内抑制素肽结合的能力，c)与有关的肽和蛋白质(包括相关种类的内抑制素)潜在的交叉反应，d)检测血浆、尿、组织和细胞培养基提取物的内抑制素肽的能力。
测量内抑制素的试剂盒也是本发明的一部分。还检测了具有最高滴度、特异性和能够检测血浆、尿、组织和细胞培养基提取物的内抑制素肽的抗血清，以建立容易使用的、快速、可靠、灵敏和特异地测量和定位血管抑制素的试剂盒。这些测定试剂盒包括但不限于下面的技术竞争性和非竞争性分析、放射免疫分析、生物发光和化学发光分析、荧光分析、夹层分析、免疫放射分析、点印迹、酶联分析(包括ELISA)、微量滴定板、抗体包衣的带或者用于快速检测尿或血液的量油计、免疫细胞化学。对于每种试剂盒，都确定了分析范围、敏感性、精确度、可靠性、特异性和重复性。在标准的位移或化学曲线中以20％、50％和80％点确定了分析内和分析间的变量。
通常在研究和临床中使用的测定试剂盒的一个例子是放射免疫测定(RLA)试剂盒。下文具体描述了内抑制素RIA。在对内抑制素或者内抑制素肽进行成功放射性碘化和纯化后，将最高滴度的抗血清以不同的稀释浓度加入到于合适的缓冲系统中包含相对连续量的放射性(如10,000cpm)的试管中。其它的试管包含缓冲液或预免疫的血清以便测定非特异性结合。4℃下温育24小时后，加入蛋白质A，将试管进行涡旋，室温下温育90分钟，4℃下在大约2000-2500Xg离心以便沉淀于标记的抗原结合的抗体复合物。通过抽吸除去上清液，并在γ计数器上计算沉淀中的放射性。减去非特异性结合后，进一步确定与大约10-40％标记的肽结合的抗血清稀释浓度。
接下来，通过向包含放射性标记肽和抗血清的试管中加入已知量的所说的肽来评价用于产生抗血清的内抑制素肽的稀释范围(大约0.1pg-10ng)。另外培养一段时间(24-48小时)后，加入蛋白质A，将试管离心，除去上清液，并计算沉淀中的放射性。放射标记的内抑制素肽的结合与未标记的内抑制素肽(标准)的位移给出标准曲线。将几种不同浓度的其它内抑制素肽片段、纤溶酶原、其它物种的内抑制素、和同源肽加入到分析试管中以便确定内抑制素抗血清的特异性。
使用已经成功地用于提取内抑制素的提取技术制备各种组织的提取物，所说的组织包括(但不限于)原始和次级肿瘤、路易士肺癌、产生内抑制素的细胞培养物、胎盘、子宫和其它组织(如脑、肝和肠)。将组织提取物进行冻干或者快速真空干燥加入分析缓冲液，并将不同的等分试样加入到RIA管中，已知产生内抑制素细胞的提取物产生了与标准曲线平行的位移曲线，而不产生内抑制素的组织提取物没有从内抑制素抗血清转移放射标记的内抑制素。此外，将患有路易士肺癌动物的尿、血浆和脑脊液提取物以不断增加的量加入到分析试管中。平行位移曲线表明可以利用内抑制素测定来测量组织和体液中的内抑制素。
通过将等分试样进行反相HPLC分析，来另外定性包含内抑制素的组织提取物。收集洗脱的组分，在快速真空干燥中干燥，在RIA缓冲液中重建，并用内抑制素RIA进行分析。在相当于内抑制素洗脱位置的组分中，确定了最大量的内抑制素免疫反应性。
测定试剂盒提供了包括说明、抗血清内抑制素或者内抑制素肽、用于沉淀结合的内抑制素-内抑制素抗体复合物的可能进行放射性标记的内抑制素和/或试剂。此试剂盒对于测量患有和未患有肿瘤的动物和人的生物液体和组织提取物中的内抑制素是有用的。
另一种试剂盒用于定位组织和细胞中的血管抑制素，这种内抑制素免疫组织化学试剂盒包括说明书、内抑制素抗血清、可能的封阻血清、与荧光分子(如荧光素异硫氰酸盐)或一些其它用于显示一级抗血清的试剂结合的次级抗血清。免疫组织化学技术对本领域技术人员是公知的。这种内抑制素免疫组织化学试剂盒使得可以使用光学和电子显微镜都可以定位组织切片和培养的细胞中的内抑制素。这种试剂盒可以用于研究和临床目的。例如，对肿瘤进行活组织检查或者收集，用切片机获得组织切片以便检查内抑制素的产生位点。在检测和治疗癌症时，这些信息对诊断是有用的，对治疗也可能是有用的。
另外，下列实施例具体说明了本发明，这些实施例决不是用来限制本发明的范围。相反，很清楚可以采取这些实施例的其它的实施方案、改进的方案和等同的方案，在阅读完此说明书后，本领域技术人员将明白这些变化没有离开本发明的宗旨和/或所附权利要求的范围。
实施例1来源于血管内皮瘤细胞的毛细管内皮细胞增殖抑制剂的鉴定评价了鼠血管内皮瘤细胞系EOMA(0beso等，1990)产生内皮细胞增殖抑制剂的情况。许多已知内源的血管生成抑制剂在体外抑制内皮细胞的增殖。
条件培养基的收集37℃下于10％CO2的培养箱中将鼠血管内皮瘤细胞系EOMA的细胞保存在添加了10％牛血清(BCS)和1％谷氨酰胺-青霉素-链霉素(GPS)的DMEM中。将EOMA细胞的条件培养基(即生长EOMA细胞的培养基)加入到牛毛细管内皮细胞中，并用bFGF刺激，进行72小时的增殖测定。和对照相比，条件培养基可逆地抑制毛细管内皮细胞的增殖。抑制作用的模式与内皮细胞增殖抑制和刺激活性的存在一致(图1)。
实施例2内皮细胞增殖抑制活性与血管抑制素无关为了测定由EOMA细胞产生的毛细管内皮细胞增殖抑制剂是否是血管抑制素，把混合的条件培养基加入到赖氨酸柱(与琼脂糖凝胶TM结合的层析珠上的赖氨酸)中。赖氨酸琼脂糖凝胶和血管抑制素结合，并用于它的纯化(O’Reilly等，1996)。只在流出物组分中发现内皮细胞抑制活性，而在结合的组分中尚未发现(数据未列出)。结合赖氨酸琼脂糖凝胶的抑制活性的缺乏表明新的内皮细胞增殖抑制剂不是血管抑制素。
实施例3来源于EOMA细胞条件培养基的特异地抑制内皮细胞增殖的20kDa蛋白质的纯化由于一些血管生成抑制剂具有与肝素的亲和性，我们将赖氨酸琼脂糖凝胶柱的流出物加入到肝素琼脂糖凝胶柱中，抑制活性物以相对高的亲和性和肝素结合，然后用溶解在10mM Tris(pH7.4)中的0.6-0.8M NaCl洗脱(如图2所示)。为了进一步纯化抑制活性物，将样品浓缩，并加入到凝胶过滤(Bio-Rad Bio-Gel P-100精制凝胶或Pharmacia聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR凝胶)柱中(见图3)，然后用C4柱进行几次循环的反相HPLC。用溶解在0.1％三氟乙酸中的40-45％乙腈从C4柱中洗脱抑制活性物(如图4所示)。在经过最后的C4柱后，所说的抑制活性物和分子量大约为18kDa(非还原)-20kDa(还原)的蛋白质(通过SDS-PAGE纯化至表观均一性)相结合。
在实施例2和3中的赖氨酸琼脂糖凝胶、肝素琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR凝胶(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、Bio-GelP-100精制聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad实验室，Richmond，CA)和SynChropak RP-4(100x4.6mm)C4反相柱(Synchrom公司，Lafayette，IN)是按照厂商推荐的方法制备的。用50mM NaCl 10mM Tris-HCl(pH7.4)平衡肝素-琼脂糖凝胶柱(50X2.5cm)。将混合的条件培养基加入到柱中，并用平衡缓冲液洗涤此柱。用溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中的连续梯度50mM-2M NaCl(总体积为200ml)洗脱此柱，然后用溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中的100ml 2M NaCl洗脱。收集组分，并将每一个等份试样加入到毛细管内皮细胞中。将抑制毛细管内皮细胞增殖的组分用PBS透析(MWCO＝6,000-8,000)，并且用4000 MWCO Nanospin浓缩器浓缩(Gelman科学，Ann Arbor，Mi)。
用PBS平衡Bio-Gel P-100柱和聚丙烯酰胺葡聚糖SR-200 HR柱(75X1.5cm)。将来源于肝素琼脂糖凝胶层析柱的样品加入到柱中，并且用平衡缓冲液洗脱此柱。收集组分，并将每一个等份试样加入到毛细管内皮细胞中。按照以上的方法将抑制毛细管内皮细胞增殖的组分进行浓缩和透析。
用水/0.1％三氟乙酸(TFA)平衡SynChropak RPG(100X4.6mm)柱。使用HPLC-等级试剂(Pierce，Rockford，IL)。将凝胶过滤层析的样品加入到柱中，将此柱用1％TFA的乙腈梯度溶液以0.5ml/分钟洗脱并收集组分。将每个等份试样通过真空离心蒸发，并且悬浮在PBS中，然后加入到毛细管内皮细胞中。SynChropak C4柱上通过至少两次连续循环来纯化抑制活性物以达到表观均一。
为了进一步鉴定20kDa的抑制剂，我们在一些内皮和非内皮起源的细胞系中进行检验。在BCE测定中，得到了牛毛细管内皮细胞，并如以前所述的方法(Folknan等，1979)进行培养。在增殖测定中，用PBS洗涤细胞，并将细胞分散在0.05％的胰蛋白酶溶液中。用DMEM+10％BCS+1％GPS制备细胞悬液(25000细胞/ml)，然后加入到在明胶化的24孔培养皿(0.5mewed)并培养24小时(37℃，10％CO2)。用0.25ml的DMEM+5％BCS+1％GPS代替原来的培养基并加入检验样品。在培养20分钟后，加入培养基和bFGF以使最终体积为0.5ml的DMEM+5％BCS+1％GPS+1ng/ml bFGF。在72小时后，将细胞分散在胰蛋白中，然后悬浮在Hematall(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中，并通过Coulter计数器计数。
非内皮细胞增殖测定在37℃下，将牛主动脉平滑肌(SMC)、牛视黄醛色素上皮(RPE)、貂肺上皮(MLE)、路易士肺癌(LLC)、EOMA细胞和3T3成纤维细胞保存在10％CO2的培养箱中。为了进行增殖测定，用PBS洗涤，并将细胞分散在0.05％的胰蛋白酶溶液中。对于每一种不同的细胞类型建立了细胞增殖测定的最佳条件。将胎牛血清(FCS)用于RPE、MLE和LLC细胞，将BCS用于其它类型的细胞。用DMEM+10％牛血清+1％GPS制成细胞悬液(SMC、RPE、MLE为20,000细胞/ml；3T3为15,000细胞/ml；LLC和EOMA为10,000细胞/ml)，并且加入到在24孔的培养皿(0.5m/孔)上，然后培养24小时(37℃，10％CO2)。用0.5ml的DMEM+5％牛血清+1％GPS代替原来的培养基并加入检验的样品。在72小时后，将细胞分散在胰蛋白中，然后悬浮在Hematall(FisherScientific，Pittsburgh，PA)中，并通过Coulter计数器计数。
如表2所示，只有内皮细胞被明显地抑制了。
表2内抑制素对内皮和非内皮细胞增殖的作用
在剂量为100ng/ml时首先观察到了抑制作用；在剂量为600ng/ml或者更大时观察到了最大抑制作用。对于非内皮起源的细胞，在所使用的剂量(1 log单位)高于抑制毛细管内皮细胞增殖所使用的剂量时，仍没有观察到明显的抑制作用(数据未列出)。
实施例420kDa蛋白质的微量测序分析表明与胶原XVIII的片段具有同源性如以上实施例所述，将来源于条件培养基的20kDa毛细管内皮细胞增殖的抑制剂纯化至均一。经SDS-PAGE分离，并电印迹到PVDF(Bio-Rad，Richmond，CA)上，然后通过Ponceau S染色检测，将其从膜中切除。通过气相三氟乙酸的输送来操作PE/ABD Model 470A蛋白质测序仪(Foster City，CA)将自动Edman降解来确定N-末端序列。
与组合的GenBank、Brookhaven蛋白质、SWISS-PROT和PIR数据库进行序列文库研究和比较。研究是在国家生物技术信息中心通过使用Blast网络进行的。
20kDa蛋白质的微量测序分析表明与胶原XVIII的片段具有同源性。分子克隆和胶原XVIII的序列最早是由Olsen和他的同事以及Rehn和Pihlajaniemi(Oh等，1994；Rehn和Pihlajaniemi，1994)描述的。胶原XVIII是由具有3个剪接变体(Muragaki等，1995；Rehn和Pihlajaniemi，1995)、一系列具有中断的类似胶原的区域、35 kDa C-末端非胶原(NCL)区域构成的新型胶原。经纯化的内皮细胞增殖抑制剂的18个氨基酸的N-末端微量测序分析确认了所说的抑制剂和这个NC1区C-末端片段具有同一性(图5)。我们将此胶原XVIII命名为＂内抑制素＂，并且此片段包含在具有内抑制素活性的分子集合中。
实施例5重组鼠内抑制素(杆状病毒或者大肠杆菌)体外抑制内皮细胞增殖和体内抑制血管生成可以在任何用来表达蛋白质的系统中重组表达本发明的内皮细胞增殖抑制剂。这样的表达系统的非限制例子包括细菌表达系统、酵母表达系统和昆虫病毒表达系统。
使用BacPAK杆状病毒表达系统(CLONTECH实验室)按照厂商的方案表达重组鼠内抑制素。简言之，把编码信号序列和小鼠胶原XVIII的C-末端部分(内抑制素区)的cDNA片段插入到pBacPAK8转移载体中。然后将BacPAK6病毒的DNA(表达载体)和pBacPAK8内抑制素克隆的质粒DNA(改良的转移载体)共转染到昆虫Sf21细胞中，并收集包含表达的鼠内抑制素的培养基。首先用BSU36酶消化BacPAK6以使它不能独立复制。将包含表达的小鼠内抑制素培养基加入到用50mM NaCl的10mMTris(pH7.4)溶液平衡的1.5×40cm肝素琼脂糖凝胶柱中。用平衡缓冲液洗涤此柱，然后依次用0.2M NaCl、0.4M NaCl、0.6M NaCl和1M NaCl的10mM Tris(pH7.4)溶液洗脱。所有的层析都是在4℃下进行的。用PBS将0.6M NaCl洗脱物(在72小时增殖测定中，其抑制牛毛细管内皮细胞)透析(6-8000 MWCO)，然后再加入到肝素琼脂糖凝胶柱中。用溶解在10mM Tris(pH7.4)中的50mM NaCl-1.2M NaCl的梯度洗脱此柱。如上所述将每个组分的等份试样加入到牛毛细管内皮细胞中，收集抑制毛细管内皮细胞增殖的组分，用PBS透析，并用NanospinPlus(Gelman科学)离心浓缩器(MWCO＝10,000)浓缩。浓缩样品的SDS-PAGE表明20kDa的表观Mγ为不连续带。
大肠杆菌的重组鼠内抑制素的表达和纯化将胶原XVIII的cDNA的C-末端部分用来扩增已克隆到pETKH1载体(pET11d的衍生物)(Studier等，1990)上的鼠内抑制素的cDNA。通过诱导产生了携带氨基酸序列MARRASVGTD(RRAS-蛋白激酶A识别序列)和在N-末端有6个组氨酸残基的融合蛋白，然后产生了鼠内抑制素序列(pTB01#8)。将pTB01#8质粒转化到BL21DE3中，并如QiaExpressionist手册(Qiagen)所述在Ni2+-NTA-珠上纯化融合蛋白。简言之，将大肠杆菌培养到OD600值为0.8-0.9，然后用1mM IPTG诱导3小时以表达所说的融合蛋白。将细菌沉淀并悬浮在包含10mM咪唑的8M尿素、10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中，并在室温下培养1小时。在20,000g下将悬液离心15分钟，然后在室温下将上清液与Ni2+-NTA-珠温育1小时。将悬液转移到柱中，并用10mM咪唑的8M尿素、0.1M磷酸钠、10mM Tris-HCl(pH6.25)溶液洗涤此柱。用包含250mM咪唑的同一缓冲液洗脱此柱。另外用PBS透析包含内抑制素的组分。在透析期间内抑制素发生沉淀。将沉淀的内抑制素悬浮在PBS中，并将蛋白质浓度调整到2-4mg/ml，使用前将内抑制素贮存在-20℃。将用于小鼠研究的内抑制素转化为悬液(在PBS中)。为了进行鸡绒毛尿囊膜测定，将内抑制素用水进一步透析，然后冻干。
在杆状病毒和大肠杆菌表达系统中产生重组鼠内抑制素。使用顺序肝素琼脂糖凝胶层析在昆虫细胞培养基中把重组鼠内抑制素纯化至表观均一性。使用Ni2+NTA琼脂糖纯化源于大肠杆菌的鼠内抑制素。
SDS-PAGE显示出分别来源于杆状病毒和大肠杆菌的大约20kD或大约22kDa(还原凝胶测定的)的纯化至表观均一的重组内抑制素的不连续的带(数据未列出)。在使用前用PBS将二者透析。透析后把来源于大肠杆菌系统的物质沉淀，并转化为悬液以用于以后的体内研究。来源于杆状病毒的重组内抑制素特异地抑制牛毛细管内皮细胞的增殖(使用量取决于所用的方式)。在100ng/ml的剂量时，观察到有抑制作用发生，剂量超过600ng/ml发生最大的抑制作用。对于非内皮起源的细胞或EOMA细胞，当试验的内抑制素剂量(1 log单位)高于抑制内皮细胞增殖所使用的剂量时，仍没有观察到明显的增殖抑制作用。
不能在体外检测沉淀的物质(未折叠形式)，因为这种物质不能溶解。然而，在透析期间有少量的这种物质能溶于PBS中，可将这些组分用于内皮细胞测定。此外，在重新折叠后所说的物质是可溶性的，并且能够抑制内皮细胞增殖(数据未列出)。当将这种可溶的物质加入到内皮细胞时，发现这种物质在相当于天然的和来源于杆状病毒的内抑制素的浓度时都具有抑制作用。
为了检验重组鼠内抑制素在体内抑制血管生成的能力，我们使用了鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定(Folkman，1985；Nguyen等，1994，本文一并参考)。简言之，把三天大的受精白来亨鸡鸡卵(Spafas，Norwich，CT)打碎，把具有完整蛋黄的胚放置在100×20mM的培养皿(Follanan，1985)中。培养(37℃和3％CO2)3天后，将一块包含内抑制素的甲基纤维素(Fisher Scientific，Fair Lawn，N.J.)加入到单个胚的CAM上。此块甲基纤维素是在特氟隆棒上将内抑制素在10μl的0.45％的甲基纤维素(在水中)中干燥制成的。培养48小时后，通过立体显微镜观察胚和CAM。
用10-20μg/10μl剂量的圆盘，在所有检验的CAM(n＝5/组)中，来源于杆状病毒和大肠杆菌的内抑制素在体内对血管生成具有较强的抑制作用。来源于大肠杆菌的沉淀物溶解5天以上，对接种的CAM产生连续的抗血管生成作用。而来源于杆状病毒的可溶的内抑制素在24小时之内溶解，并在48小时之内表现出最大的抗血管生成作用。在所检验的任一个鸡胚中都没有发现毒性。
使用相同的方式重组产生了人内抑制素。
实施例6重组小鼠内抑制素抑制转移性肿瘤的生长因为肿瘤的生长依赖于血管生成，我们使用杆状病毒系统中表达的重组小鼠内抑制素来对路易士肺癌转移性肿瘤进行全身性治疗。将具有600-1200mm3的路易士肺癌的动物杀死后，用betadine和乙醇清洗带有肿瘤的皮肤。在层状通风橱中，在无菌条件下切除肿瘤组织。使用筛，然后使用一些小的直径为22-30规格(gauge)的皮下注射针头通过活肿瘤细胞来制备0.9％的生理盐水的肿瘤细胞悬液。将最终浓度调节到1X107细胞/ml，并将悬液置于冰上。在将鼠背用乙醇清洗后，在鼠背接近中线处皮下注射1X106细胞(溶于0.1ml的盐水中)。
在接种大约14天后，肿瘤达到1500mm3时，对小鼠进行手术以切除肿瘤。用简单的中断缝线缝合切口。从手术开始的那天起，将小鼠每天腹膜内注射重组(由杆状病毒系统产生)鼠内抑制素或盐水。通过皮下给小鼠每天注射(0.3mg/kg/天)一次内抑制素。当对照小鼠因转移性肿瘤而发病(即在处理13天后)，将所有的小鼠杀死，并进行尸体解剖。通过立体显微镜(4x)计算肺表面转移性肿瘤的大小。
通过以0.3mg/kg/天的剂量由皮下全身施用内抑制素几乎完全抑制了路易士肺癌转移性肿瘤的生长(7±3转移性肿瘤/鼠，n＝4，p＜0.001)。而用盐水处理的小鼠在切除路易士肺癌初期肿瘤后，肺转移性肿瘤生长迅速(77±7转移性肿瘤/鼠)。用内抑制素处理的小鼠的肺脏重量(这反映了肿瘤量)240±25mg，而对照小鼠的肺脏重量760±30mg(p＜0.001)。此外，用内抑制素处理的小鼠中没有一个体重减少或表现出毒性。
实施例7重组鼠内抑制素抑制初期肿瘤的生长由杆状病毒系统产生的内抑制素的量(1-2mg/升)比由大肠杆菌系统产生的量(30-40mg/升)低。因此我们使用来源于大肠杆菌的内抑制素来研究内抑制素对初期肿瘤生长的效应。我们由大肠杆菌产生了足够量的重组鼠内抑制素来治疗路易士肺癌初期肿瘤。以沉淀的纯化蛋白质的悬液的形式将内抑制素施用到患有至少100-200mm3路易士肺癌肿瘤的小鼠。通过常规的方法纯化所说的蛋白质，但是在将其施用给小鼠前没有进行再折叠。注射到体内的沉淀物缓慢地吸收需要24-48小时以上。
对于在动物中使用未折叠的重组蛋白来进行持续释放的方法的注射部位，我们无先例可寻。然而，内抑制素在体内是被逐渐吸收的，并已经证明其具有较强的抗血管生成活性，延长了内抑制素抗肿瘤和抗血管生成的活性。因此，这些实据表明了一种控制释放重组蛋白的新的普通方法。基于这些原理，我们同样成功地施用了来源于大肠杆菌的未折叠重组内抑制素。
因此，本发明的一方面是以未折叠的形式施用重组内抑制素或者内抑制素类似物，以便提供内皮细胞增殖抑制蛋白质持续释放的部位，依据患者和要治疗的疾病不同，释放时间至少8小时以上，优选的至少12小时，更优选的至少24小时或至少48小时。也可以以同样的方式施用未折叠的重组血管抑制素，以便提供能持续释放蛋白质的部位，依据患者和要治疗的疾病不同，使血管抑制素蛋白质释放时间至少8小时以上，优选的至少12小时，更优选的至少24小时或至少48小时。
使用双卡尺测量如上所述的用路易士肺癌接种小鼠的肿瘤，使用公式宽度2X长度X0.52来计算肿瘤的体积，测量了最后测量点处理和对照肿瘤比(T/C)。在3-7天内，在肿瘤达到100-200mm3(体重的0.5-1％)后，把小鼠随机分成两组。一组以悬液(在PBS中)的形式在非肿瘤部位每天一次皮下注射重组鼠内抑制素(来源于大肠杆菌)。另一组小鼠作为对照只注射载体。当对照小鼠开始死亡时停止实验，并杀死小鼠进行尸体解剖。
通过使用内抑制素的全身治疗有效地抑制了路易士肺癌初期肿瘤的生长。增加内抑制素的剂量后效果也随之提高(数据未列出)。和只用载体的对照小鼠相比，在10mg/kg的剂量时对肿瘤生长的抑制达97％。在2个独立的实验中，以20mg/kg的剂量每日施用一次时，几乎全部已有的初期肿瘤都消退了(抑制达99％，P＜0.001)。这些惊奇和意想不到的结果列于图6和7。
图8、9、10和11表明重组鼠内抑制素对各种不同的肿瘤生长抑制的效果。也显示来源于人的内抑制素抑制肿瘤生长的作用。
残余的少量肿瘤的免疫组织化学分析(图12)表明在内抑制素处理的肿瘤中，血管生成受到了较强的抑制。此外，两个组中用内抑制素和盐水处理的小鼠，其肿瘤增殖指数都处于同样的水平，而用内抑制素处理后编程性细胞死亡指数增加了8倍。因此，内抑制素治疗与以前我们描述(Holmgren等，1995；O′Reilly等，1996)的血管抑制素产生了相似的肿瘤休眠模式。而且，在任一个治疗的小鼠中没有表现出与药物相关的毒性。
在中断内抑制素治疗后，5-14天内在初期肿瘤的位置上又产生了肿瘤，血管形成并最后使小鼠致死(数据未列出)。值得注意的是来源于大肠杆菌的具有C-末端多组氨酸尾的重组鼠内抑制素(和如上所述的N-末端尾产物相似的方式表达、纯化和使用)在CAM测定中不能抑制血管生成，对路易士肺癌的生长没有作用(数据未列出)。这些数据明显表明重组内抑制素的抗肿瘤和抗血管生成活性是由于内抑制素的特异结构而不是由于样品中的杂质所致。
图13显示用源于大肠杆菌的重组鼠内抑制素循环治疗路易士肺癌的结果。这些结果清楚地表明继发性的依赖于内抑制素消退的肿瘤量，在停止内抑制素治疗后肿瘤继续生长。
这些结果表明鼠血管内皮瘤在体外产生一种新的特异性的20kDa的内皮细胞增殖抑制剂，这种抑制剂是体内血管生成和肿瘤生长的强烈抑制剂。内抑制素这种抑制剂的N-末端序列和胶原XVIII的C-末端片段具有同一性。全身施用重组内抑制素能够较强地抑制血管生成、控制转移肿瘤(在显微镜水平上)以及使初期肿瘤的消退到小于1mm3(减少到原来的150多倍)。只要是用内抑制素治疗的小鼠，它的肿瘤就没有再生长，也没有表现出抗药性和毒性。令人感兴趣的是比内抑制素长的XVIII型胶原的C-末端区域的一些片段不能抑制细胞增殖(数据未列出)。
通过使用与发现血管抑制素(0′Reilly等，1994)的相同方案发现了内抑制素，即从肿瘤分离得到。因为肿瘤应该是血管生成抑制剂的来源的说法是反直观的，本文所报道的结果看起来证实了这种方法。
这就会使人们提出为什么血管生成抑制剂应该存在于血管生成的肿瘤中，一种可能性是抑制剂在通过肿瘤细胞打开血管生成表型的开关而产生负调节后可能会“过剩”。这似乎与Li-Fraumeni细胞(细胞中第二等位基因p53发生突变或缺失(Dameron等，1994))产生的血小板反应蛋白的情况相同。
第二种可能性是和肿瘤生长相伴随的分解蛋白活性物，这种物质是毛细血管生长的重要组分，也可以由前体物(并不是抑制物本身)蛋白固定循环血管生成抑制剂。例如，血管抑制素抑制血管生成和内皮细胞增殖，而纤溶酶原却不能(O’Reilly等，1996；O’Reilly等，1994)。内抑制素也表现出相同的模式。
在用内抑制素治疗后消退的肿瘤的组织学结构表现出肿瘤细胞的周围血管成套，肿瘤细胞周围的一个或多个微血管的血管生成受到了抑制。肿瘤细胞由于高编程性细胞死亡抵消了高增殖性，最终肿瘤大小没有增加。这些数据和最近提出(Holmgren等，1995)的新型肿瘤休眠的方式相同。此外，内抑制素在体外抑制内皮细胞增殖，但对路易士肺癌细胞或其它细胞类型(包括平滑肌、上皮、成纤维细胞、由EOMA纯化的EOMA细胞系)没有作用。
内皮细胞增殖的特异性抑制剂可以将肿瘤消退至显微镜水平，并能抑制肿瘤使之处于休眠状态(尽管肿瘤细胞从开始就对抑制剂予以抵抗)，这种情况表明内皮细胞可以进行强有力的生长调节控制而战胜肿瘤细胞。
内抑制素的检验结果支持了用于治疗目的的理论(Folkman，1996)，根据两个明显的细胞群考虑肿瘤是富有成效的肿瘤细胞群和内皮细胞群，其中每一种都可以刺激其它的细胞生长。每一种细胞群的生长都可以首先受到选择性或特异性针对某一细胞类型的试剂的抑制，即细胞毒性化疗和抗血管生成疗法。此外，将两种细胞群组合在一起进行治疗可以比只用一种细胞群单独治疗效果好。
为了检验这一理论，把用路易士肺癌细胞接种并且肿瘤长至大约300mm3大小的小鼠用血管抑制素和内抑制素组合治疗25天，每个剂量均为20mg/kg/天。通过大约10天的治疗肿瘤消退至显微镜水平。即使所有的治疗都停止，完全意想不到的结果是肿瘤保持消退和休眠大约三个月(如图4所示)。持续时间更长的实验表明将血管抑制素和内抑制素组合在一起进行的的初始治疗产生了一个时间较长的休眠，此时，实际的休眠时间还不知道。
本领域技术人员认为这样长的休眠期即为治愈。例如，确定治愈癌症的治疗是有效的NIH指标为肿瘤保持休眠(例如在大小上不增加)的时间为正常增殖一倍所需时间的10倍。使用血管抑制素和内抑制素的组合治疗达到的休眠时间远远超过这个标准。
因此，本发明的一个重要的方面是提供了一种包含组合在一起的血管抑制素和内抑制素(或内抑制素类似物)的组合物，将所说的组合物以足以产生依赖于血管生成的癌的长时间休眠或治愈的量施用给患有依赖于血管生成癌的患者，使用可以是全身性的，例如注射，病例中使用的剂量取决于患者和具体的癌，但是一般至少为0.2mg/kg/天，优选的至少2.0mg/kg/天，更优选的至少20mg/kg/天。一般地，如果每天施用组合物，至少需要施用10天，优选的为至少20天，更优选的为至少25天。另外可以选择的全身治疗方法包括口服(其中将组合物制备成，例如包衣的药丸以保护蛋白质防止其在消化性的环境中失活)、经皮肤和经泵施用。
另外，如果对依赖于血管生成的部位(例如肿瘤)局部施用组合物，可以使用不同的剂量和治疗期。这种施用方法可以是在，例如在肿瘤附近手术植入或者局部注射。
实施例8内抑制素的推定的受体的分离内抑制素和血管抑制素可以认为是内皮细胞增殖的特异性地抑制剂。因此，内抑制素很可能和在内皮细胞表面专门表达的特定结构结合。我们对于是否存任何其它的内皮细胞增殖的的抑制剂还不了解。
通过本领域公知的方法来确定和分离特异结合内抑制素的蛋白质，例如亲和层析和表达克隆。
亲和层析.用[35S]-甲硫氨酸放射标记牛毛细管内皮细胞(BCE)来制备总细胞和膜的提取物，并且加入到用内抑制素制备的亲和柱中。以相同的方式分离成纤维细胞蛋白提取物作为阴性对照。使用NaCl梯度从柱中洗脱结合蛋白，并使用标准的SDS-PAGE和放射自显影术分析不同的组分。这种方法产生了紧密结合到内抑制素柱且只存在于内皮细胞组分中的蛋白质。比较两种细胞类型的凝胶电泳模型表明，表达的蛋白质只存在于BCE细胞中。其后测定蛋白质序列和相应的克隆基因。制备了牛毛细管内皮细胞的cDNA文库，并用基于变性的寡核苷酸的PCR技术来筛选以定位特异结合蛋白质的内抑制素的cDNA。也使用了变性的寡核苷酸和相应的cDNA进行杂交来确定结合蛋白的内抑制素基因。另一种方法是通过使用以前详细描述的方法和免疫筛选同一文库来培养肽序列的抗体。
表达克隆.制备BCE细胞的cDNA文库。从增殖已受到内抑制素抑制的BCE细胞中分离Poly-A mRNA，这些细胞表达与蛋白结合的内抑制素。将相应的cDNA文库转染到允许各种cDNAS高度表达的细胞中。把内抑制素和在细胞表面上表达受体蛋白质的细胞结合的活性作为这些细胞的阳性选择标记。为了选择这些细胞，用生物素标记纯化的内抑制素，其后使用偶联磁性珠的链霉抗生物素蛋白或者FAGS分拣来进行检测。另外在筛选时可以使用内抑制素的抗体。在选择了阳性细胞后，分离、纯化相应的质粒，并转染到高度表达的细胞中。在进行几轮阳性选择后，使用核酸内切酶消化和PCR分析质粒的同一插入物。使用这些数据，用Blast网络程序形成、测序和分析互补组。除计算机分析之外，把单个的cDNAs再次转染到高度表达的细胞中，并在不同的条件(例如，与未标记的内抑制素竞争、结合的时间、Scatchard分析等，换句话说，使用本领域技术人员熟知的“传统”的受体鉴定方法)下检验内抑制素结合活性。
实施例9鼠内抑制素蛋白的抗血管生成活性的最小区域的确定设计了不同的PCR引物，将相应的cDNA克隆到大肠杆菌表达系统中，并将不同的内抑制素片段纯化至均一。从N-末端和C-末端切下全长的cDNA。使用毛细管内皮增殖测定和鸡胚测定作为第一次筛选以测定剩余活性(和全长片段相比)。
实施例10可以从胶原XVIII释放内抑制素的推定的酶的测定胶原XVIII属于非原纤维胶原类型成员，可以在编码具有1315、1527和1774个氨基酸残基的三个不同的剪接变体中发现胶原XVIII(Rehn，PNAS 914234，1994)。这种差别是由基因N-末端部分的改变引起的，因此所有三个剪接变体都可以成为内抑制素(本身就是非胶原区域11(NC11)的片段)潜在的来源。胶原XVIII的功能尚不清楚，但是，因为它的信息实质上是在高度形成血管的组织中表达出来，因此有人(Oh等，基因组学，19494，1994)提出它在周围血管基质装配和/或结构中的作用。关于胶原XVIII的功能第一条线索来自于作为内皮细胞增殖有效抑制剂的内抑制素的纯化。
从原始数据和我们最初的观察，我们从血管内皮瘤(EOMA)的条件培养基中纯化内抑制素，我们提出是否可以确定从胶原XVIII释放内抑制素的酶？在大肠杆菌和昆虫细胞杆状病毒系统表达了编码NC11区域的325个氨基酸残基。把纯化的蛋白质用作为底物来确定克隆胶原XVIII此区域的酶。通过PCR将编码NCll区域的cDNA片段克隆到大肠杆菌表达载体(pET系列)中，此载体使得在IPTG诱导后使靶蛋白质高度表达。另外，使用了合适的昆虫细胞表达载体。所说的蛋白质用HIS6-Tag加尾，所说的尾端位于C-末端，用于经Ni2+-NTA-珠的纯化。通过Western印迹使用Ni2+-NTA-碱性磷酸酶缀合物可以检测C-末端。构建了另一个构建体，此构建体不仅具有C-末端的HIS6-Tag，而且也编码血凝素(N-末端的HA-Tag)。这可以通过Western印迹用HA-特异的单克隆抗体来检测。在使用EOMA上清液和不同的金属蛋白酶提取物温育之后，检测所说的蛋白质的N-末端和C-末端。
由SDS-PAGE分析或者Western印迹检测切割产物发现，使用Ni2+-NTA-珠再次纯化所说的蛋白质，用咪唑洗脱，用PBS透析，并且在各种体内和体外的测定(例如内皮细胞增殖、鸡胚和小鼠角膜测定)中检测抑制剂活性。如果切割产物显示出抑制活性物，对N-末端氨酸进行测序并将它与从EOMA上清液获得的内抑制素的原来起始序列相比较。因此，切割方法可以按比例放大，以纯化用于患有肿瘤小鼠的实验中的足够量的蛋白质。并将这种活性和全长NC11区域的活性相比较。
参考文献下列参考文献的全部内容本文一并参考。
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序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名儿童医学中心公司(B)街道300 Longwood大街(C)城市波士顿(D)州Massachusetts(E)国家美国(F)邮编代码(ZIP)02115(G)电话(617)735-7050(H)电传(617)232-7485(ii)发明名称治疗血管生成的组合物和方法(iii)序列数目1(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0. Version #1.30
(2)SEQ ID No1信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假设结构没有(iv)反义链没有(vi)最初来源(A)有机体鼠(F)组织类型胶原(xi)序列描述SEQ ID No1His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser5 10 15 20(2)SEQ ID No1信息(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假设结构没有(iv)反义链没有(vi)最初来源(A)有机体鼠(F)组织类型胶原(xi)序列描述SEQ ID No1His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser5 10 15 20
权利要求
1.分离的内抑制素。
2.权利要求1的分离的内抑制素，这种内抑制素包括分子量为18kDa(通过非还原凝胶电泳测定的，如果通过还原凝胶电泳测定则为20kDa)的分离的蛋白质，其中所说的蛋白质可以从鼠的血管内皮瘤EOMA细胞系中分离，并且所说的蛋白质还具有特异性地抑制培养的内皮细胞增殖的能力的特征。
3.权利要求1的内抑制素，其中所说的蛋白质的N-末端氨基酸序列与Seq ID No1的序列实质上具有同源性。
4.权利要求1的内抑制素，其中所说的蛋白质的序列与XVIII型胶原的C-末端肽片段的序列实质上具有同源性。
5.权利要求1的内抑制素，这种内抑制素是通过下面的方法产生的在重组表达系统中重组产生权利要求1的蛋白质，并以未折叠的形式分离重组产生的蛋白质。
6.权利要求5的内抑制素，其中所说的重组表达系统是大肠杆菌或者杆状病毒。
7.一种化合物，这种化合物包含编码内抑制素蛋白质的分离的核酸序列。
8.权利要求7的化合物，其中所说的内抑制素蛋白质的分子量为18kDa(通过非还原凝胶电泳测定的，如果通过还原凝胶电泳测定则为20kDa)，其中所说的蛋白质可以从鼠的血管内皮瘤EOMA中分离，并且所说的蛋白质还具有特异性地抑制培养的内皮细胞增殖的能力的特征。
9.权利要求7的化合物，其中所说的蛋白质的N-末端氨基酸序列和Seq ID No1的序列实质上具有同源性。
10.权利要求7的化合物，其中所说的蛋白质的序列与XVIII型胶原的C-末端肽片段的序列实质上具有同源性。
11.一种化合物，这种化合物包含能够特异性地结合内抑制素蛋白质的分离的抗体。
12.权利要求11的化合物，其中所说的内抑制素蛋白质的分子量为18kDa(通过非还原凝胶电泳测定的，如果通过还原凝胶电泳测定则为20kDa)，其中所说的蛋白质可以从鼠的血管内皮瘤EOMA中分离，并且所说的蛋白质还具有特异性地抑制培养的内皮细胞增殖的能力的特征。
13.权利要求11的化合物，其中所说的抗体是单克隆抗体。
14.权利要求11的化合物，其中所说内抑制素蛋白质的N-末端氨基酸序列实质上和Seq ID No1的序列具有同源性。
15.权利要求11的化合物，其中所说的蛋白质的序列与XVIII型胶原的C-末端肽片段序列实质上具有同源性。
16.一种分离的内抑制素，其是通过包含以下步骤的方法制备的a.收集用于培育鼠血管内皮瘤细胞系EOMA的培养基；和b.用肝素柱层析分级分离所得的培养基，其中所说的分离的内抑制素是分子量为18kDa(通过非还原凝胶电泳测定的，如果通过还原凝胶电泳测定则为20kDa)的蛋白质，并且所说的蛋白质还具有特异性地抑制培养的内皮细胞增殖的能力的特征。
17.一种治疗与血管生成有关的疾病的方法，这种方法包括在需要使用权利要求1的内抑制素进行治疗时，以足以抑制血管生成的量向患者施用权利要求1的内抑制素。
18.权利要求17的方法，其中所说的内抑制素是重组产生的蛋白质，并且以未折叠的形式施用所说的重组产生的蛋白质。
19.权利要求18的方法，其中所说的重组产生的内抑制素在至少8小时内能够持续释放此蛋白质。
20.权利要求17的方法，其中所说的与血管生成有关的疾病选自由依赖于血管生成的癌、良性肿瘤、风湿性关节炎、牛皮癣、眼睛血管生成疾病、Osler-Webber综合征、心肌血管生成、噬斑新血管生成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、创伤肉芽、肠粘连、粥样硬化、硬皮病、肥厚性疤痕、猫抓疾病和Helobacter pylori溃疡组成的组。
21.权利要求20的方法，其中与血管生成有关的疾病是依赖于血管生成的癌。
22.一种治疗与血管生成有关的肿瘤的方法，这种方法包括在需要使用权利要求1的内抑制素进行治疗时，以足以引起肿瘤消退的量向患者施用权利要求1的内抑制素。
23.权利要求22的方法，其中所说的内抑制素是重组产生的蛋白质，并且以未折叠的形式施用所说的重组产生的蛋白质。
24.权利要求23的方法，其中所说的重组产生的蛋白质在至少8小时内能够持续释放此蛋白质。
25.一种治疗患有依赖于血管生成癌的患者的方法，这种方法包括在需要治疗依赖于血管生成癌时，以能够治疗此疾病的量向患者施用一种组合物，所说的组合物包含与权利要求1的内抑制素组合使用的血管抑制素，所说的血管抑制素和内抑制素的使用量足以使所说的组合物能够有效地抑制依赖于血管生成癌的血管生成(当将此组合物施用给患有依赖于血管生成癌的患者时)。
26.权利要求25的方法，其中所说的血管抑制素和内抑制素至少一种是重组产生的蛋白质，并且以未折叠的形式施用所说的重组产生的蛋白质。
27.权利要求25的方法，其中所说的重组产生的蛋白质在至少8小时内能够持续释放此蛋白质。
28.一种避孕的方法，这种方法包括以足以抑制胚胎植入的量向女性施用权利要求1的内抑制素。
29.权利要求28的方法，其中内抑制素是重组产生的蛋白质，并且以未折叠的形式施用所说的重组产生的蛋白质。
30.权利要求25的方法，其中所说的重组产生的蛋白质在至少8小时内能够持续释放此蛋白质。
31.一种组合物，这种组合物包含与权利要求1的内抑制素组合使用的血管抑制素，所说的血管抑制素和内抑制素的使用量足以使所说的组合物能够有效地消退依赖于血管生成的肿瘤的量(当将此组合物施用给患有依赖于血管生成肿瘤的患者)。
32.一种产生内抑制素蛋白的方法，这种方法包括重组表达一种分子量为18kDa(通过非还原凝胶电泳测定的，如果通过还原凝胶电泳测定则为20kDa)的蛋白质，这种蛋白质实质上具有与内抑制素同源的序列，其还具有特异性地抑制培养的内皮细胞增殖的能力的特征。
33.权利要求32的方法，其中所说的内抑制素蛋白是在细菌表达系统、酵母表达系统和昆虫表达系统之一中产生的。
全文摘要
本发明涉及一种能够抑制血管生成和引起肿瘤消退的内皮细胞增殖抑制剂(所说的抑制剂大约为20kDa,并且相当于XⅧ型胶原的C－末端片段)及治疗与血管生成有关的疾病的方法。
文档编号C12N7/00GK1202932SQ96198480
公开日1998年12月23日 申请日期1996年10月23日 优先权日1995年10月23日
发明者M·S·奥莱利, M·J·佛克曼 申请人:儿童医学中心公司