重组卤代脂族脱卤素酶的制作方法

专利名称：重组卤代脂族脱卤素酶的制作方法
制备大量的短链卤代脂族烃(HAHs)用作有机溶剂、脱脂剂、杀虫剂、各种其它有机化合物合成的中间体以及用作制造塑料中的成分。这些卤化化合物在工业过程中的广泛使用对能够改良和/或再利用低廉副产品的新技术产生了大量的机遇。
在化工生产过程中作为副产品而产生的过多HAHs可被燃烧产热并且在有些情况下可被再利用成低廉的起始物质，从而从废产品或过多的副产品中得到一定的回收。在复杂的微生物环境(天然、水处理植物等)中，HAH降解通过微生物生物降解而发生。当卤素为氯化物时，HAHs的生物降解导致二氧化碳、水、和盐酸的形成。
HAHs由选择性微生物生物降解成二氧化碳、水和盐酸公开于美国专利Nos.4,853,334和4,877,736中。用于分解氯代脂族烃而没有指出涉及微生物的方法公开于美国专利No.4,749,491中。此外，在《应用环境微生物学》.，52383-384(1986)中，Nelson等已报道不动杆菌(Acinetobacter spp)对三氯乙烯的有氧代谢。Vogel等在《环境科学技术》，21722-736(1987)中给出了卤化脂族化合物在环境中降解的概述。美国专利No.5,372,944公开了产生将HAHs转化为卤代醇的脱卤素酶的一些红球菌属(Rhodoccocus)的种类。然而，这些文献主要依赖于细胞系统并且没有利用可在持续加料过程中使用固定化的修饰活性酶而得到好处的优势。最为相关的是，美国专利No.5,372,944依赖包括野生型或突变细胞的红球菌培养物。然而，其中讲述的突变技术没有利用重组DNA方法的优势且因此未能利用这些方法对该脱卤素酶活性改进和表达而带来的好处。
不是依赖由细胞培养物对HAHs的生物降解，而是具有改良的，可容易适应于持续加料方法的重组酶将是优越的，这里，HAHs可有效地转化为用于制备其它有用产品的有用的中间体，如制备聚醚以形成聚氨基甲酸酯中的中间体或制备乙二醇和聚乙二醇以形成润滑剂、表面活性剂、乳化剂等的中间体。
本发明涉及包括基本上与图2中残基1-292的氨基酸序列同源的氨基酸序列且能够将HAHs转化为邻位卤代醇的重组酶。本发明的另一目的是提供编码包括这样酶多肽的DNA序列，更为具体地包括与图2中碱基37-912核苷酸序列基本上同源多核苷酸的DNA序列。
本发明的另一目的是提供含有该DNA序列的载体和用于制备此多肽的方法，包括将该载体置于宿主细胞中和在能使此转化子产生脱卤素酶的条件下培养该宿主细胞。
本发明的进一步目的是提供固定化形式的酶于固相支持物上以及用于将HAH转化为醇或卤代醇的方法，包括将此HAH与固定化酶接触。附图简述

图1显示载体pEXPROK的质粒图谱。质粒pEXPROK源自商业上可得到的pPROK-1质粒(Clontech，Mountain View，CA)，含有Ptac启动子和5S、T1T2终止子序列。在该图中，T1T2区域表示为“Term”。此质粒通过以一对导入限制性位点Nco I、Hind III、Xho I、Nhe I和Not I于接头中的寡核苷酸代替pPROK-1多克隆位点而构建。Nco I位点的“ATG”序列代表有功能的符合读框的起始位点。Nhe I位点后接EXFLAG接头序列。EXFLAG接头序列相应于图2中的核苷酸919-975并且编码图2中所示RDhl蛋白序列中的氨基酸295-315。
图2(即图2A和2B)列出编码推导的紫红红球菌TDTM003卤代链烷脱卤素酶的核苷酸序列和源自此核苷酸序列的氨基酸序列。氨基酸残基1-292相应于红球菌脱卤素酶(RDhl)结构基因并且由核苷酸37-912所编码。氨基酸残基-12到-1(核苷酸1-36)代表含有多组氨酸的氨基末端尾部，其中的残基-12和-11同时参与翻译起始位点和Nco I克隆位点的形成。氨基酸残基293-294(核苷酸913-918)由Nhe I克隆位点所编码并且其后接氨基酸295-305，其在此又称为EXFLAG肽。EXFLAG接头(核苷酸919-975)编码EXFLAG肽和2个翻译终止位点(每个由星号表示)。
图3显示载体pEXPROK-RDhl的质粒图谱。
图4(即图4A和4B)列出了推断的紫红红球菌TDTM003卤代链烷脱卤素酶、自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)GJ 10脱卤素酶、Renilla reniformis萤光素单加氧酶和假单胞菌类(Pseudomonas spp)LinB基因产物(四氯环己双烯水解酶)氨基酸序列的比较图。
图5显示包括在IPTG-可诱导的Ptac转录启动子控制下推断的紫红红球菌TDTM003卤代链烷脱卤素酶基因的载体pRDhl-KO2.3-EXPROK的质粒图谱。
图6显示包括在T7转录启动子控制下推断的紫红红球菌TDTM003卤代链烷脱卤素酶基因的高水平表达载体pRSET-RDhl的质粒图谱。
图7显示包括在trc转录启动子控制下推断的紫红红球菌TDTM003卤代链烷脱卤素酶基因的高水平表达载体pTrcHis-RDhl的质粒图谱。
图8显示高水平表达载体pTrixFus-RDhl的质粒图谱，该质粒包括融合到编码大肠杆菌硫氧环蛋白基因上的推断的紫红红球菌TDTM003卤代链烷脱卤素酶基因的修饰体，此连接的融合基因在PL转录启动子的控制之下。
图9显示与部分纯化的rRDhl酶比较的表达pEXPROK-RDhl克隆细胞裂解液样品的SDS-PAGE凝胶图。
图10显示与图9中相同的SDS-PAGE凝胶的抗-FLAG抗体免疫印迹图。
图11显示表达pRSET-RDhl细胞的无细胞提取物的SDS-PAGE凝胶图。
图12显示与图11中相同的SDS-PAGE凝胶的抗-FLAG抗体免疫印迹图。
图13显示来自表达pTrcHis-RDhl细胞的无细胞提取物的SDS-PAGE凝胶图。
图14显示与图13相同的SDS-PAGE凝胶的抗-FLAG抗体免疫印迹图。
图15显示表达pTrxFus-RDhl细胞的无细胞提取物的SDS-PAGE凝胶图。
图16显示作用于底物1，2，3-三氯丙烷的固定化酶生物反应器的产率图。
图17显示EPPCR-突变的紫红红球菌卤代链烷脱卤素酶活性的柱状图。
图18显示EPPCR-突变的紫红红球菌卤代链烷脱卤素酶活性的柱状图。
图19显示带有羧基末端S-Tag多肽尾部的RDhl酶和带有羧基末端EXFLAG多肽尾部的RDhl酶的酶活性数据图。
本发明源于下面的深入研究，包括从红球菌属微生物中获取编码具有卤代脂族脱卤素酶活性的多肽的DNA序列、通过将该DNA序列本身或其修饰形式整合入载体中而制备重组DNA序列，和以该重组载体转化微生物。筛选具有脱卤素酶活性水平的转化子并且从具有增高活性的转化子中分离脱卤素酶。然后评估各种固体支持物固定系统以鉴定出其中的酶可有效地将卤化的脂族烃转化为醇或卤代醇的酶-支持物组合。
用固定化脱卤素酶转化的卤化脂族烃(HAHs)包括C2-C10脂族烃分子和其有2个或更多个附着卤素原子的基因，其中的至少2个卤素原子位于相邻的碳原子上。优选的HAHs为饱和的烃，其中至少一个卤素原子占据该分子或基团的伯位；更为优选的是其中不止1个卤素占据相同碳原子的那些HAHs。特别优选的HAHs包括1，2-二卤代基团的饱和烃，其实例有1，2-二卤代乙烷、1，2-二卤代丙烷、1，2-二卤代丁烷和1，2，3-三卤代丙烷分子和基团。这些种类包括，例如，1，2-二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷、1，2，3-三氯丙烷和1，2-二溴-3-氯丙烷分子和基团。
如这里所使用的，术语“卤素”意为氯、溴或碘。优选的卤素为溴和氯。最为优选的卤素为氯且在最为优选的HAHs中有易挥发的氯代脂族烃(VCAH)分子和基团；尤其优选的VCAHs包括1，2-二氯丙烷和1，2，3-三氯丙烷分子和基团。
如这里所使用的，术语“卤代醇”意为邻位卤代醇，即除了羧酸以外的在分子的相邻碳原子上同时具有羟基取代基和卤素取代基的任何脂族有机化合物。α，β-卤代醇为最为优选的邻位卤代醇。
术语“免疫印迹(immunoblot)”和“免疫印迹(immunoblotting)”在此使用是指下面的过程1)从电泳凝胶，如用于PAGE中的聚丙烯酰胺凝胶中将蛋白转移到结合蛋白的膜上；且然后2)用对可能包括转移到此膜上那些蛋白的蛋白组分特异性的抗体检测该膜；并且然后3)用本领域众所周知的各种生色方法中的任何一种，如用直接或间接连接到此抗体上的可着色标记显色而检测该抗体的位置。免疫印迹方法的实例为Western印迹。
术语“透化(permeablize)”、“透化的(permeablizing)”和“透化(permeablization)”在此使用表示使有些物质可通透的方法，如使细胞壁可通透、术语“超声处理”在此使用表示用超声波迅速振荡试管或其它容器中的内容物以将其彻底混合。术语“旋涡振荡”在此使用表示沿其底部机械旋转试管而同时手工按住试管的顶部不动以将其内容物混合的操作。
这里使用的词语“可筛选”意为“能够被选择”。例如，术语“可选择标记”或“显性可选择标记”表示遗传特征，如编码抗生素抗性酶的基因，其存在使该基因的宿主细胞在相应的选择培养基如，含有该抗生素的培养基中增殖。与没有接受或含有该质粒的那些细胞相反，当此遗传特征掺入到含有编码RDhl酶基因的质粒中，且然后处理这些细胞从而接受该质粒时，在选择培养基中培养这些细胞使实际上接受该质粒的细胞选择性生长，这允许容易地鉴定含有RDhl基因的细胞。
如这里所使用的，术语“表达构建体”指本领域中已知的质粒、病毒、病毒颗粒、类病毒、转座因子、柯斯构建体、结合DNA链的可转染运载体(如，DNA包被的“基因枪”团粒(pellet)或DNA包被的天然或合成的组蛋白样粒子)或其它本领域中已知的DNA-到-细胞的运载系统。
如这里所使用的，在描述氨基酸序列的上下文中，应用了下面的单字符命名。
A，a丙氨酸(Ala) M，m甲硫氨酸(Met)C，c半胱氨酸(Cys) N，n天冬酰胺(Asn)D，d天冬氨酸(Asp) P，p脯氨酸(Pro)E，e谷氨酸(Glu) Q，q谷氨酰胺(Gln)F，f苯丙氨酸(Phe) R，r精氨酸(Arg)G，g甘氨酸(Gly) S，s丝氨酸(Ser)H，h组氨酸(His) T，t苏氨酸(Thr)I，i异亮氨酸(Ile) V，v缬氨酸(Val)K，k赖氨酸(Lys) W，w色氨酸(Trp)L，l亮氨酸(Leu) Y，y酪氨酸(Tyr)
如这里所使用的，在描述DNA序列的上下文中，应用了下面的单字符定义A腺嘌呤G鸟嘌呤 N A，C，G或TC胞嘧啶T胸腺嘧啶R A或GY C或T这里使用了下面的缩略语和定义@ 在，如@37℃为“在37℃”并且@60分钟为“在60分钟”埃(一埃为1×10-10米)A 吸光度，如，A280为“在280nm处测得的吸光度”aa氨基酸Amp 氨苄青霉素2-AMP 2-氨基丙醇AMPSO 3-〔(1，1-二甲基-2-羟乙基)氨基〕-2-羟基-丙磺酸ATCC 美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD，美国)碱基为多核苷酸一部分的核苷酸bp碱基对CAPSO 3-(环己氨)-2-羟-1-丙磺酸CD压缩盘CHES 2-(N-环己氨)乙磺酸CM羧甲基CnBr 溴化氰Δ变化或差异，如A为“吸光度变化”dATP 脱氧腺苷三磷酸DCB 1，4-二氯丁烷DCH 2，3-二氯-1-丙醇dCTP 脱氧胞苷三磷酸DEAE 二乙氨乙基dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dTTP 脱氧胸苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐EPPCR易错聚合酶链式反应GC 气相色谱GIA 戊二醛gm 革兰氏(Grams)hr 小时Hz 赫兹(以每秒循环单位数对频率的计量)ID 内径Ig 免疫球蛋白，如IgG为“免疫球蛋白G”IPTG 异丙基硫代半乳糖基吡喃糖苷IUB 国际生化联盟kbp 千碱基对kD 千道尔顿(一道尔顿重为12O原子的1/12)Ki 抑制常数LB Luria培养基μg 微克μL 微升μM 微摩尔浓度μmole 微摩尔M(体积)摩尔的(每升溶液中溶质的摩尔数)mg 毫克min 分钟mL 毫升mm 毫米mM 毫摩尔MW 分子量N当量的(每升溶液中化学活性溶质基团的摩尔数，如，H2SO4具有2个酸性的氢且因此1M H2SO4为2N的溶液)nm 纳米ng 纳克
NP-40Nonoxynol；p-(n-C9H19)-C6H4-(OCH2CH2)nOH；也称为壬基苯氧基聚乙二醇(一种非离子型去污剂表面活性剂)OD 光密度，如OD600“在600nm处测得的光密度”oligo寡核苷酸P- 质粒，如pRSET，pTrcHis，pTrxFus，或pUCPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR 聚合酶链式反应PEI 聚乙烯亚胺pfu 蚀斑形成单位phage噬菌体QAE 四乙铵(一种阴离子交换基)RDhl 红球菌卤代链烷脱卤素酶残基 为多肽一部分的氨基酸rpm 每分钟转数rRDhl重组的红球菌卤代链烷脱卤素酶SDS 十二烷基磺酸钠spp. 种类TCP 1，2，3-三氯丙烷TM 商标Tris 三(羟甲基)氨基甲烷tRNA 转运RNAU单位Vmax 最大酶促速度％w/v每体积的百分重量，即每100mL溶液的溶质克数，也写作“％(w/v)”％w/w每重量的百分重量，即，每100克含有物质的混合物中该物质的克数；也写作“％(w/w)”～ 大约为了获得酶和固定化酶，达到本发明的目的，进行下面的步骤。用本领域中技术人员已知的技术进行这些步骤(1)分离和部分测定脱卤素酶的氨基酸序列；(2)根据此部分的序列测定而构建寡核苷酸探针；(3)用该寡核苷酸探针分离编码脱卤素酶的DNA片段，然后扩增此DNA；(4)将该片段连接到具有适当复制起点和编码显性选择标记基因的克隆载体中；(5)转化并筛选含有该重组质粒的微生物；(6)将该DNA序列转移到适当的表达载体中并用该重组载体转化宿主细胞；(7)由该转化子制备重组脱卤素酶；和(8)纯化该脱卤素酶；然后(9)将该脱卤素酶固定到各种固相支持物上；(10)在将HAHs转化为醇或卤代醇的过程中使用固定化的脱卤素酶；和(11)筛选有效的脱卤素酶支持系统。
令人惊奇的是，在进行上述研究的过程中，获得了新的重组脱卤素酶，其较野生型的脱卤素酶具有更为优越的功能特征，由此而获得了该重组酶。此外，还鉴定了有效的固定化脱卤素酶支持系统。
用于本发明的脱卤素酶优选来源于红球菌种类ATCC 55388并且能够将HAH转化成卤代醇或醇，优选为卤代醇。优选的重组酶包括具有野生型脱卤素酶最少功能部分的具有酶活性的多肽，即，在适当的折叠后维持卤代链烷脱卤素酶活性的其最小可能的片段。优选地，此多肽基本上与图2中残基1-292的氨基酸序列同源。更为优选地，此多肽与其有至少约90％的同源，更为优选地至少有约95％的同源且再进一步更为优选地至少有约99％的同源。尤其优选的是具有残基1-292或图2中残基氨基酸序列的具有酶活性的多肽。
该优选的重组酶也可包括一种或更多种其它的单元，如各种大小的标记、标签、尾部、接头、固相支持物、螯合剂，其它酶等它们与该酶的活性多肽一起制备或者在其形成后连接到其上。在其适当折叠和/或固定化于固相支持物上后这样的单元可从该酶中切除。在优选的实施方案中，制备带有或连接到基本上亲水尾部的酶。此尾部可以为表达为该酶一部分的亲水寡肽或者可以为，例如，在其表达后由宿主细胞附着到核心酶上的寡糖部分。该尾部必需有足够的长度和亲水性从而使核心酶以悬液形式维持于水溶性培养基中。优选的尾部为表达为该酶一部分的基本上亲水的寡肽。更为优选地，该酶被表达具有高度亲水性的寡肽尾部。最为优选地，此寡肽尾部表达于该酶的羧基末端。最优选的寡肽尾部为富含组氨酸和/或天冬氨酸残基的亲水羧基末端尾部，尤其是约5到25个氨基酸长度且含有至少约25％组氨酸或天冬氨酸残基，更为优选含有至少约50％这种残基的尾部。此重组酶优选由含有具有图2中碱基37-912核苷酸序列至少一部分多核苷酸的宿主细胞制备。
本发明也涉及能够表达本发明酶的重组DNA序列。这些DNA序列包括能够通过不遵循或不完全遵循标准DNA密码的密码子-到-氨基酸对应模式的翻译系统表达新的卤代链烷脱卤素酶的那些序列。这样的系统包括其中的某些密码子相对于标准的DNA密码受到“抑制”的那些系统。在其中的一种“抑制”表达系统中，大约20种氨基酸特异性的氨酰-tRNA(“aa-tRNA”)分子中至少有一种含有至少一种具有此类反密码子并连接到“错误”氨基酸上的tRNA分子从而预先决定该翻译系统产生对标准DNA密码子的“践踏”(violation)(即，通过在延伸多肽链中至少一个位置导致插入这样的氨基酸，即不是与支配该位置的mRNA密码子正常所见到的氨基酸)。在这样系统的另一种变异中，氨酰-tRNA分子库含有其反密码子互补于正常翻译信号起始或终止的mRNA密码子因而抑制该信号的aa-tRNA。这些系统可能，例如，由于在一种或更多种tRNA分子或aa-tRNA合成酶中的突变而存在，或者由于非突变aa-tRNA合成酶的错误，或由于人类的干涉而迫使氨基酸与tRNA的非标准连接而存在。
在这样的翻译系统中，本发明的DNA序列将仍然产生新的卤代链烷脱卤素酶，或者是因为“错误”氨基酸的插入没有导致酶缺失活性或者是因为此DNA序列在“不正确”氨基酸将要被插入的位置含有这样的密码子，即其“预期”到该翻译系统中的变化从而使在其中或者插入“正确”的氨基酸或者使mRNA密码子“正确”起始信号。优选的DNA序列包括基本上与图2中碱基37-912的核苷酸序列同源的多核苷酸。更为优选地，此多核苷酸与其至少约90％同源，更为优选至少约95％同源，进而，更为优选至少约99％同源。尤其优选的为具有图2中碱基37-912氨基酸序列的多核苷酸。
如这里所使用的，术语“基本上同源”表示主题序列-即主题核苷酸序列(寡核苷酸-或多核苷酸或DNA链)或主题氨基酸序列(寡肽-或多肽或蛋白)与有关的参照核苷酸或氨基酸序列间的相似性程度。此术语定义为当将这些序列进行“比较”时主题与参照序列间至少约75％的“对应”(即，相同成分-核苷酸或氨基酸平行排列的状态)。在本文中，当主题和/或参照序列中插入了最少数目的“无义”部分从而使二者序列间存在的对应部分数目最大时称(序列)“比较”存在。“无义”部分不是主题与参照序列的部分；同样，插入主题序列中“无义”部分的最少数目可能与插入参照序列中最少数目不同。可表示为，如，“90％同源”的给定序列的增加的同源性程度同样也是参照它们与参照序列间的序列一致性程度而定义的。
在该定义中，在以下情况中认为参照序列与主题序列“相关”1)两种核苷酸序列均编码可鉴定为相同IUB亚类的蛋白或蛋白的一部分或2)无论鉴定是根据功能特性、序列同源性或母本来源，两种氨基酸序列构成可鉴定为相同IUB亚类的蛋白或蛋白的一部分。“母本来源”指这样的事实，即一种给定的酶由于其已认识到的主要或次要功能而可能在起始被划分为一IUB亚类，但在编码该酶的DNA序列积累一种或更多种突变时，此编码的酶可能显示出不同IUB亚类的功能活性-无论其还同时维持其最初功能性与否；此“不同的IUB亚类”可能位于相同或不同的IUB主类。有关“蛋白的一部分”指根据鉴定为其一个功能域的亚类也认为双功能和多功能酶-包括融合蛋白属于给定的IUB亚类。
在本发明优选的实施方案中，卤代链烷脱卤素酶至少在母本上属于IUB亚类3.8.1。已发现本发明的酶具有较红球菌中发现的野生型卤代链烷脱卤素酶，如，美国专利No.5,372,944中使用的脱卤素酶出人意料的优越特性。一般地，除了其在反应条件下的稳定性外，一种给定酶的二种特征将决定其在商业中的用途其对产物的亲和力以及其对底物的亲和力。当酶对产物分子的亲和力相对较高时，其将对该产物的反馈抑制极其敏感。这种酶在其中常需要显著产品浓度存在下才能工作的商业过程中用处较少。酶对产物相对亲和力的方便指标是在90％抑制时测得的抑制常数(“Ki(90)”)，即酶仅维持其10％Vmax时产物的浓度，Vmax在产物浓度为0时测得的。至于本发明，野生型卤代链烷脱卤素酶具有20mM测得的Ki(90)，而本发明的重组酶(见图2)具有50mM测得的Ki(90)。换句话说，此重组酶对产物的反馈抑制要不敏感得多并且可因此在将会基本上完全抑制野生型酶的产物浓度存在下起作用。
本发明的酶可单独表达或沿着其氨基和/或羧基末端共价附着一种或更多种多肽尾部。该尾部可由与编码该酶的外显子分离的外显子所编码或由为编码该酶外显子的一部分的DNA序列所编码。当此编码尾部的DNA为编码该酶外显子的一部分时，此编码尾部的DNA可通过以下任一方式附着或“融合”到该酶基因的3′和/或5′末端，如或者1)在通过将编码此尾部的核苷酸序列包括进寡核苷酸引物中而进行的酶基因扩增过程中或2)在通过将编码尾部的DNA直接连接到含有该酶基因的质粒中而进行质粒构建过程中(无论该酶基因是在编码尾部DNA的插入之前或之后插入此质粒中)。
在适当的遗传控制元件-即增强子、启动子、转录和翻译起始与终止序列等的影响下-此种DNA(或mRNA)融合基因的表达导致产生在一个或两个末端具有多肽尾部的脱卤素酶。优选的没有尾部酶的实例为具有图2中残基1-292氨基酸序列的酶。一些优选多肽尾部的实例包括多组氨酸序列、多酸(如，多-天冬氨酸和/或多谷氨酸)序列、纤维素结合区域和c-myc、S-Tag和FLAG肽。结合这些典型尾部的抗体和亲和柱在商业上是可得到的并且可容易地用于纯化或固定此表达的融合蛋白。然而，也可使用许多其它的尾部而同时维持有功能的脱卤素酶。无论编码尾部的序列包括进此表达基因中与否，该基因必需在该酶基因或该酶-尾部融合基因以外的位置包括翻译起始位点，优选为ATG，且将也优选包括内切核酸酶限制位点。
在一个优选的实施方案中，单个外显子的开放阅读框编码在氨基和/或羧基末端具有达大约30个氨基酸残基尾部的有功能的脱卤素酶。在此实施方案中，当两个末端均具有尾部时，两个尾部可以是大约相同的长度。在另一个优选的实施方案中，该酶表达为同时具有氨基末端和羧基末端尾部，但羧基末端尾部显著长于氨基末端的尾部。在该实施方案中，优选此氨基末端尾部达到大约25个氨基酸的长度而羧基末端尾部为大约2到150个氨基酸长度。在这些实施方案中的任一方案中，优选地，该氨基和/或羧基末端尾部将含有一段至少5个相邻的组氨酸残基。在其它实施方案中，氨基末端尾部大约10-150个氨基酸长度且优选含有或其本身为多组氨酸序列。在该实施方案中，该酶可通过与以螯合的二价金属离子，如，Mg2+或Ni2+包被的表面接触而被可逆地固定或可逆的失活。在此实施方案中，含有多组氨酸的氨基末端尾部可以是如此之长从而部分或完全封闭进入该酶的活性位点。在此实施方案的其它版本中，该尾部可设计成含有将尾部的构型从多组氨酸序列中见到的情形变为弯曲、反转或弹性连接的构型的一个或更多个氨基酸残基从而增加达到该酶的活性位点。
在更为优选的实施方案中，此开放阅读框编码具有约1到25个氨基酸氨基末端尾部和具有多组氨酸序列，FLAG肽序列(可获自柯达成像系统/VWR，Rochester，NY)和/或S-Tag肽序列的羧基末端延伸的有功能脱卤素酶。在特别优选的实施方案中，此开放阅读框编码有功能的脱卤素酶1)达到大约10个氨基酸的氨基末端尾部和多组氨酸序列和2)包括(即，含有)FLAG(见图2)或S-Tag肽序列的羧基末端尾部。
该酶和/或上述脱卤素酶的尾部可用定向进化技术加以修饰从而提高其产率、稳定性和/或抑制图形。一种直接进化技术使用美国专利No.5,605,793中由Stemmer等公开的基因改组(gene Shuffling)方法，其中的众多类似DNA序列被片段化并以随机的方式重新装配从而产生高度多样性的可筛选具有目的特征酶的文库。该技术的另一种形式包括使用易错基因扩增技术。定向进化的第三种形式利用这两种方法的组合。定向进化的第四种方式为由Zhao等在《自然生物技术》(1988)(目前待出版)文献中公开的所谓“摇摆延伸”(staggered extension)方法。在优选的实施方案中，易错基因扩增用于以每基因扩增反应每基因拷贝大约1-6个点突变的速率导入半随机突变至脱卤素酶基因(如，图2，残基1-292)中，然后将此突变文库导入细菌中，诱导表达蛋白并且优选在空间上可标记的网状形式(如96孔或384孔板)中筛选活性。
有效使用定向进化以改进一种酶或酶家族需要最优化的诱变策略以及表达系统和有效检测到该酶所需表现特征的筛选策略与筛选条件。对于(非-随机)的引物依赖性诱变方法(如，易错基因扩增和限定的基于引物的重组)，特异性的蛋白亚域可容易地选定为通过引物设计和定位的诱变。在优选的实施方案中，使用这样的引物，即与其在表达构建体内部出现的一样能够诱变整个转录和翻译区域。优选地，这些引物只涉及表达构建体的蛋白编码区域靶DNA(包括尾部)。在更为优选的实施方案中，以这样的方式设计引物，如定向诱变脱卤素酶基因而同时保留该尾部序列。例如，对于图2，当易错基因扩增技术同时使用互补于紧接着核苷酸36前面的核苷酸的引物和互补于紧接着核苷酸912后面核苷酸的引物时，此脱卤素酶基因可以为唯一的诱变靶序列。同样，当这些引物与核苷酸1-951区域的外部退火时整个图2编码区为诱变靶序列；当这些引物与核苷酸1-36或913-951区域的外部退火时图2氨基尾部或羧基尾部分别为靶序列。
编码本发明酶或融合蛋白的DNA序列将优选插入表达载体中，然后将该载体转染入宿主细胞且在表达该酶的条件下培养此宿主细胞。已知有很多种重组的用于原核细胞的宿主载体表达系统并可用于本发明中。例如，商业上可得到的载体如pKK233-2、pKK388-1、pSE380、pTrcHis(A、B和C)、pRSET(A、B和C)、pProEX-1和噬菌体λ(gt11)、T3和T7均能够指导异源蛋白在大肠杆菌和其它革兰氏阴性原核细胞中表达。在这些表达形式中，也可使用多种菌株适宜的可诱导的启动子。此外，其它原核生物(如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属、放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或红球菌属生物)、真核微生物(如酵母和真菌，如毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、或曲霉属(Aspergillus)的微生物，如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或啤酒糖酵母)、其它真核细胞和细胞系(如以杆状病毒来源载体感染的Sf 21细胞)及甚至藻类细胞能够产生活性形式的原核来源的异源蛋白；在这些其它细胞用于本发明中的事件中，将选择适当的表达载体用于其中。而众多的原核表达载体可公开得到并可用于本发明中，在此用商业上可得到的载体pTrcHis、pRSET和pTrxFus系列(可获自美国加州圣地亚哥的Invitrogen)与大肠杆菌宿主细胞举例说明该新酶的表达。
当使用定向进化技术，如易错基因扩增(如，易错PCR或“EPPCR”)时，将由此产生的突变基因集合的DNA用适当的限制酶(即，在突变靶序列之外具有限制位点的那些内切核酸酶)消化；其次，纯化这些突变基因并连接到原核表达载体中以形成质粒文库。然后用该质粒文库转化感受态宿主细胞，如，优选为大肠杆菌细胞并培养于适当的培养基中在大肠杆菌情况，将细胞铺板于含有选择培养基的琼脂上。然后将这些细胞稀释以形成单菌落，或者在原核生物如大肠杆菌情况时，它们可经过起始的生长期，然后单个地挑出细胞菌落并转移到分离的容器中，如96孔板小孔中从而每孔含有单克隆转化细胞。根据此克隆文库，可扩增单个克隆、诱导表达目的蛋白并筛选目的活性。
优选通过检测在底物分子当碳-卤共价键水解时释放的质子或卤化离子而完成对新酶卤代脂族脱卤素酶活性的筛选。在优选的实施方案中，伴随质子释放的pH改变用作酶活性的量度；此pH改变优选用荧光或在靶酶功能pH范围中经过可检测到颜色改变的可见pH指示剂加以测定。在其它的方法中，可利用多种平行的pH探针。
在活性筛选测定中，该测定混合物将含有1)完整的细胞、透化的细胞、细胞裂解液或获自表达突变脱卤素酶细胞，优选获自细菌细胞的纯化酶；2)底物；和3)低浓度缓冲液(一般＜10mM)。当需要使用透化细胞时，可用化学去污剂(如，脱氧胆酸钠)或物理冻/融方法使细菌细胞通透。底物将优选包括一种或更多种上述的卤化脂族烃。该缓冲液可选自任何已知有效或该酶在其中维持活性的pH范围中发现有效的缓冲液。在有些情况，将见到细胞残渣本身提供足够的缓冲能力从而能够准确地定量活性。只要使用增加的缓冲液，其将优选具有约6到10范围的pKa，虽然可使用其它缓冲液。优选缓冲液的实例包括甘氨酸、2-AMP、CAPSO、乙醇胺、CHES、硼酸盐、丝氨酸和AMPSO；尤其优选的为CAPSO且甚至更为优选的为约5mM CAPSO的浓度。
活性筛选测定也将需要用测定方法。在优选的实施方案中，检测pH改变。优选地，pH指示剂将包括进该测定混合物中。可以使用该酶在其中具有活性的pH范围内具有颜色变化的任何pH指示剂。优选地，该pH指示剂在大约pH 6到pH 10的范围内，更为优选在大约pH 7到pH 9的范围内将经历颜色变化。优选可见pH指示剂的实例包括m-甲酚紫、甲酚红、酚红、溴百里酚蓝和百里酚蓝；优选荧光pH指示剂的实例包括α-萘酚磺酸、1，4-萘酚磺酸、香豆酸、3，6-二氧基邻苯二甲酸二氰和orcinaurine。在别的实施方案中，可用pH探测器检测pH变化。尤其优选的是用可见的pH指示器，m-甲酚紫，且甚至更为优选的是大约50μM m-甲酚紫的浓度。
在另一优选的实施方案中，通过以下的方式检测底物中卤化离子的释放而完成检测1)在测定的混合物中包括卤化物敏感的荧光染料，如硝酸双-N-甲基吖啶(Iucigenin)(可获自Molecular Probes ofEugene，OR，美国)当与卤化离子接触时，硝酸双-N-甲基吖啶被猝灭且因此在其中测得的荧光下降；或2)使用卤化离子反应性检测装置，如卤化物-反应性电极。
在第三优选的实施方案中，用偶联的酶系统完成酶活性的检测。例如，偶联酶系统可用于检测产物分子的产生卤代链烷的脱卤化作用导致醇产生，并且许多醇为一种或更多种商业上可得到的醇脱氢酶(其活性由NADH的消失加以测定)的底物。通过偶联到NADH且需要脱氢酶对醇的检测在本领域中是众所周知的。
本发明的酶可固定到一种或更多种固相支持物上。酶固定技术最方便地分为共价和非共价方法。共价方法利用一些氨基酸侧链上存在的反应性基团而直接或通过用双功能的交联剂结合到聚合物或无机支持物上。该方法的主要优势为连接的坚固性。非-共价固定方法更多并且范围从直接和间接(如，螯合-或螯合剂-介导的)离子、吸附或生物亲和支持物连接(如，生物素-亲和素)到凝胶-包载或微囊化作用。
用于商业酶方法的特定固定化技术的挑选基于多种因素。其中主要因素是支持基质的价格及其生物相容性连接或偶联化学。其次是固定时活性的恢复和反应条件下固定支持物的坚固性。不幸的是，由于每种酶都是独特的，寻找最佳系统的方法是经验性的。然而，有关本发明的酶，优选的固定方法包括通过反应性基团如环氧化物、活化的亲核物质、异尿素(isourea)等将此酶共价连接到支持物上。这些反应性基团可存在于支持材料的自然表面或者该支持材料可修饰成带有含这些基团的连接体。优选的连接体包括含有二醛、二酸、二氨基、二异氰酸酯、氰酸酯和二酰亚胺基团；如果二氨基没有与碳二酰亚胺联合使用，也可使用包括至少一个碳二酰亚胺基团的连接体，在优选的固相支持物中有基于氧化铝的支持物和基于硅的支持物；更为优选的为基于聚乙烯亚胺浸渗的氧化铝或硅支持物。固定的优选方法包括用戊二醛预处理该固相支持物且然后将此支持物与酶接触。
一旦被固定，该酶可方便地用于转化其底物/反应物成为产品。此反应可在基本上不影响脱卤素酶活性的任何合适介质中完成。优选地，该酶促转化在含有缓冲系统或一种或更多种pH控制装置的水溶性介质中完成。
虽然在有些情况中，也可使用超饱和的底物混合物、底物乳浊液或纯底物制品，但卤化烃底物通常加入反应介质中至底物饱和点。如果大多数卤化烃底物达到饱和点，所用的卤化烃浓度将一般为约0.005％到0.5％(w/v)的范围、优选地，卤化烃的浓度从约0.005％到约0.25％。更为优选的为卤化烃在介质中的浓度为从约0.005％到约0.2％。起初可以批量的方法将底物加入到反应溶液中，或者加入到持续加料方法中的液体流中。在此持续加料方法中，该液体流可起初含有底物或者此底物可首先加入其中因为液体流为进入反应器中的途中。在这两者中的任一情况中，更多的底物可直接加入到反应器的液体流中从而确保高浓度的底物在整个反应器中呈递给酶。在该方法中，此液体流可以不同水平的底物重新饱和从而能够以高于此底物溶解极限的浓度积累产物。批量方法反应通常用振荡或搅拌来完成。尽管反应时间或反应器滞留时间可随反应条件如底物浓度或酶量而变化，但优选选择这样的反应条件从而使反应在最多120小时内完成。
通过考虑下面的实施例，本发明将得以进一步澄清，这些实施例意在彻底例证本发明。如果没有特别指明，所有的百分数均为百分重量。常规实验材料与培养基所有的寡核苷酸均由Genosys Biotechnologies公司(Woodland，TX)、Life Teehnologies公司(Rookville，MD)或Integrated DNATechnologies公司(Coralville，IA)合成与纯化。限制酶和DNA修饰酶购自Gibco-Bethesda Research Laboratories(Gaithersburg，MD)、New England Biolab公司(Beverly，MA)或StratageneCloning System(La Jolla，CA)并且按照制造商的方法使用。感受态大肠杆菌AG1细胞购自Stratagene Cloning Systems，感受态大肠杆菌JM109和TOP 10F′细胞购自Invitrogen公司(圣地亚哥，加州)。小规模质粒DNA分离用Rapid Pure Miniprep(RPMTM)系统(BIO101，公司.，La Jolla，CA)完成。DNA连接用预先测试的购自Stratagene Cloning System的试剂盒完成。DNA片段的纯化用QIAquick凝胶提取试剂盒和QIA quick PCR纯化试剂盒，两者均购自Qiagen公司(Chatsworth，CA)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶和相关的缓冲液与染料以及电印迹转移缓冲液来自Integrated SeparationSystem(ISS，Natick，MA)。抗体、抗FLAGTM单克隆抗体M2以及羊抗-小鼠IgG1分别获自International Biotechnology公司(IBI，New Haven，CT)和Southern Biotechnology Associate(Birmingham，AL)。细菌培养于使用购自Gibco-Bethesda ResearchLaboratories(G-BRL；Gaithersburg，MD)预混合的试剂的Luria-培养基(“LB”)中。试剂1，4-二氯丁烷、60％高氯酸、硝酸铁及硫氰酸汞来自Aldrich。无水乙醇来自Quantum/USI(Tuscola IL，美国)。1，2，3-三氯丙烷由Dow Chemical Company’s Allylics Group(Freeport，TX，美国)惠赠。磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、咪唑、盐酸胍、EDTA二钠、硫酸铵、及无Tris碱来自Fisher Biotech Grade。硫酸来自Fisher(ACS级)。支持材料Tresyl-Toyopearl层析支持物来自TosoHaas(Lot#65TRM72R)。交联葡聚糖G-25预包装柱来自发玛西亚。Celite R-648来自Manville。聚乙烯亚胺，50,000 MW和PEI-二氧化硅来自Sigma。同样来自Sigma的1级(Grade 1)25％戊二醛水溶液贮存于-20℃直至使用前。用于固定中的其它样品包括Davison Low SA氧化铝、Norton SA 6176氧化铝、Calcicat C型氧化铝、Calcicat s-88-473A型二氧化硅、Shell 5980-F二氧化硅、Davison 952-08-5X二氧化硅、Borecker亚单位碳和AmCy 5701-Sn碳。方法PCR反应用Perkin-Elmer-Cetus(Nutley，NJ)提供的标准聚合酶链式反应缓冲液进行DNA扩增。一般地，50μL的反应包括1×浓度的制造商供应的缓冲液、1.5mM的MgCl2、125μM dATP、125μM dCTP、125μM dGTP、125μM dTTP、0.1-1.0μM的正向及反向引物、5单位Ampli Taq DNA聚合酶及＜1ng的靶DNA。除非特别说明，否则DNA扩增的加热方式为94℃，5分钟；55℃，1分钟；72℃，1分钟的35轮循环加热方式。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白的检测将可溶性蛋白与增溶缓冲液(Tris/SDS/β-巯基乙醇)1∶1混合并且在上样于10-20％凝胶(Daiichi，Natick，MA)中之前煮沸5分钟并用Tris-甘氨酸缓冲液(ISS)进行电泳。凝胶用Pro-BlueTM(ISS)染色。标准的氯化物检测分析以测定酶活性单位当用1，4-二氯丁烷(Aldrich)作为底物时，将100mM pH 9的甘氨酸钠加入到每个9mL加盖的小瓶中至6mL的终体积。当用1，2，3-三氯丙烷作为底物时，使用10mM的Tris硫酸盐/1mM EDTA(pH7.0)。然后加入6μL底物并旋涡振荡内容物。将小瓶于30℃孵育搅拌1小时。通过在5个时间点取出1mL混合物并将其置于含有5.25MHClO4中100μL 0.375M Fe3-(NO3)3的Eppendorf管中而进行取样。旋涡振荡Eppendorf管。当收集完所有样品时，将乙醇中饱和的100μL硫氰酸汞(II)加入到每支管中。再一次将样品旋涡振荡，然后离心3分钟。在460nm处读数光密度。测定代表一定时间吸收改变的斜率(ΔA/分钟)并除以1.52(用ΔA/μmole Cl-为单位以NaCl作为标准在460nm处的消光系数)以得到μmole Cl-/分钟。一个单位的酶活性定义为在指定的条件下需要脱卤素1.0μmole底物/分钟所需要的酶量。易错PCR诱变的方法在该定向进化方法中，将RDhl酶基因或RDhl融合蛋白基因提供为EPPCR诱变的靶基因，如，通过用适当的限制酶消化含有此靶DNA序列的质粒。在大多情况中，通过凝胶电泳纯化靶DNA，然后凝胶提取此靶DNA。除了标准的PCR缓冲液补充以足够的氯化镁和氯化锰从而达到7mM氯化镁和0.15mM氯化锰的反应混合物以外，EPPCR包括用适当寡核苷酸引物对靶基因进行标准的PCR基因扩增。此方法可对一种或更多种EPPCR产物进行重复以在其中导入进一步的突变。
将得到的EPPCR产物连接到表达载体(如，pTrcHis、pTrxFus)中且然后用这些载体转化合适的感受态宿主细胞，如大肠杆菌AG1或JM109细胞而用于酶表达和酶活性分析。通过在LB/Amp琼脂板上选择性培养而鉴定含有质粒的克隆。用牙签将单菌落转移到含有选择培养基的96孔平板的小孔中并于37℃孵育～8-12小时进行培养。在最初的培养期后，复制平板并扩增，且按下面部分所述测定其单个克隆的脱卤素酶活性。通过检测pH变化而测定RDhl酶活性的方法通过测定由于此酶在对底物脱卤素中作用而导致的pH变化测定RDhl酶的活性。在加入pH指示剂、缓冲液和底物之前将表达该酶的原核宿主细胞培养于培养基中、定量并且透化。
96孔微量培养板的每孔中加入200μL补充了约50-100μg/ml氨苄青霉素(“SOB/Amp”)的SOB培养基(获自Difco，Detroit，MI，美国)。将来自产生酶大肠杆菌克隆的单菌落的细胞接种到该平板的一个孔中。当检测rRDhl酶或rRDHL融合蛋白文库时，每孔接种来自不同大肠杆菌克隆的细胞。6个孔没有加入细胞而用作阴性对照并且6个其它孔接种产生野生RDhl酶的大肠杆菌克隆作为阳性对照。接种物在Psycrotherm炉中于37℃孵育过夜同时以250rpm振荡。
孵育后，通过加入IPTG至1mM的终浓度，然后再在Psycrotherm炉中于37℃孵育5小时并同时以150rpm振荡而诱导培养物。孵育5小时后，用1.573 Vmax/Kinetic微平板计数器(Molecular Derices，Sunnyvale，CA，美国)而测定每个培养物的细胞密度。然后将每种诱导培养物的20μL等份加入到新鲜96孔板的小孔中并且将2.2μL pH8.0的10×透化缓冲液(10mM脱氧胆酸钠，1％NP-40，50mMTris和50mM EDTA)加入到每等份中去，然后以适中的振荡速度振荡3-5分钟。然后每个细胞培养物等份中加入200μL含有5mMCAPSO和100μM甲酚紫的DCB-饱和的pH 9.2-9.5的缓冲液(＞1μLDCB/mL缓冲系统)。用Spectro Max Plus微量培养板计数器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，美国)测定指示剂形成的颜色变化并且绘制颜色变化的斜率以外推起始酶的活性。实施例1脱卤素酶从红球菌中的分离按美国专利No.5,372,944中所述培养红球菌种类ATCC 55388。按美国专利No.5,373,944中大致所述通过以下方法从该培养物中制备酶提取物，包括采用25％-75％硫酸铵截流，2个离子交换层析步骤(1.DEAE-交联葡聚糖；2.DEAE-聚丙烯酰胺葡聚糖)，(其中的盐浓度以梯度的形式在0-400毫摩尔硫酸钠范围内变化)，用交联葡聚糖G-75的凝胶过滤层析且然后通过超滤浓缩以获得通过SDS-聚丙烯酰胺分析而含有大于65％脱卤素酶的酶制品。
将(～25mg)的纯化酶进行溴化氰消化。以0-80％乙腈/含有0.1％三氟乙酸的水梯度用RP-8 Macrosphere(Altech)混合方式的阳离柱分离肽片段。
用自动的Edman降解将三种纯化蛋白和纯化的溴化氰(CnBr)片段进行测序。测定N-末端和三个CnBr片段的序列。其中一个CnBr片段与该N-末端序列相同。其它两个相应于独特的内部脱卤素酶序列。所有肽的序列显示于表1中。
表1纯化红球菌脱氢酶的N-末端和蛋白水解片段的序列
DNA引物设计设计引物RDhl 5.4和RDhl 3.12从而使扩增并克隆编码红球菌脱卤素酶(RDhl)基因的开放阅读框到表达系统pEXPROK中。RDhl5.4的序列来自该蛋白的N-末端序列而RDhl 3.12是基于实际的DNA序列而设计。设计引物RDhl 5.7和RDhl 3.13从而产生RDhl基因于表达系统pRSET和TrcHis中。设计引物Trx2++和Trx-以产生RDhl基因于表达系统pTrxFus中。这些寡核苷酸引物的序列如下表2用于克隆红球菌脱卤素酶中的寡核苷酸引物的序列和方向<
Bio＝生物素；N＝A，C，G或T；()＝在给定位置一定的碱基半余，下划线序列相应于欲向扩增的DNA产物中导入与欲克隆载体(pEXPROK)相容的限制位点的5′序列。部分的红球菌脱卤素酶基因的克隆按下述通过从基因组DNA文库中的扩增而完成红球菌脱卤素酶基因的克隆。用P.J.Asturias和K.Timmis的方法(细菌学杂志1754631-4640(1993))从红球菌ATCC菌株5538中分离基因组DNA。将纯化的基因组DNA(100μg)机械打断成＜10kbp的平均大小。将这些片段连接到BamHI接头上，然而用BamHI消化并连接入BamHI消化的噬菌体λ-ZAP ExpressTMDNA(获自Stratagene公司，LaJolla，CA，美国)的制品中。商业制备含有基因组红球菌DNA片段的文库(Stratagene公司，LaJolla，CA)并且以1×104pfu/μL(蚀斑形成单位/微升)供应。用固相亚磷酰胺化学合成相应于N-末端序列氨基酸6-13密码子的半余DNA引物(RDhl 5.4)并通过HPLC纯化(表2)。
将RDhl 5.4引物与识别T3噬菌体启动子序列(并且位于λZAPExprexxTM载体内部)的商业上可得到引物联合使用从而从单个扩增的基因组DNA噬菌体文库中扩增脱卤素酶基因。用含有1μM RDhl 5.4引物、100nm生物素化的T3 Pro引物(New England Biolabs)，10×Amplitaq反应缓冲液(Perkin-Elmer-Cetus)、1.5mM MgCl2、5U rAmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer-Cetus)和4μL噬菌体文库(完整噬菌体)的聚合酶链式反应(50μL)完成扩增。用下面的加热方式进行35轮扩增94℃ 1分钟；55℃ 2分钟；72℃ 2分钟。通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并且鉴定1.3kb的分离带，从凝胶中切下(条带)并且用QiaQnick凝胶纯化试剂盒(Qiagen公司)分离。确定此DNA也能够由其它红球菌脱卤素酶特异性引物扩增后，用限制酶NcoI和PstI消化此片段并连接入NcoI/PstI消化的pGEM52f(+)(ProMega，Madison，WI)。对该克隆片段的3′-非翻译区的测序使得能够鉴定推断的终止密码子和随后用引物RDhl 5.4和RDhl 3.12对该编码区的扩增。
序列和限制酶分析根据前面的测序结果而对每连续轮设计的生物素化引物(表3)通过连续多轮的双脱氧方法对脱卤素酶基因进行双链测序。条带于5.5-6.0％聚丙烯酰胺尿素测序胶中分离，并通过毛细转移将DNA转移到硝酸纤维素滤膜上并用众所周知的链亲和素-碱性磷酸酶显色方法再联合化学发光底物进行观察。表3用于测序红球菌脱卤素酶基因中寡核苷酸引物的序列与方向
*Bio＝生物素；N＝A，C，G或T；()＝给定位置一定的碱基半余。不包括已在表2中描述过的同时用于测定该基因序列的生物素化引物。也使用了T3、T7和SP6启动子特异性的商业上可得到的(New England Biolads)生物素化引物但没有在此列出。
载体pEXPROK(图1)为商业上可得到的pPROK-1载体(Clontech公司，Mountain View，CA)的衍生物。而pEXPROK具有pPROK载体的功能元件(包括氨苄青霉素抗性标记、Ptac转录启动子和多接头后部的成对的(paired)转录终止信号)，pEXPROK载体用延伸的称为EXFLAG的合成多接头代替pPROK-1的EcoRI-到-HindIII多接头。设计EXFLAG接头从而在NcoI位点与NheI位点之间插入开放阅读框。具有六-核苷酸NheI位点的框内为11氨基酸肽，其中的最后八肽相应于众所周知的FLAG肽(柯达成像系统，Rochester，纽约)，针对其抗体和亲和试剂在商业上是可得到的。EXFLAG接头的序列与特征如下EcoR INco IHind IIIXba IXho I Nhe I I-----EXFLAG
用引物RDhl 5.4和RDhl 3.12从pGEM5构建体中PCR扩增RDhl5.4/T3 Pro基因，然后由NcoI和NheI消化从而将红球菌脱卤素酶基因连接入适当消化的表达载体中。此方法用于将RDhl基因插入pEXPROK中。pEXPROK和pEXPROK-RDhl的质粒图谱分别示于图1和3中。然后通过自动DNA测序证实pEXPROK-RDhl构建体的DNA序列。
序列分析脱卤素酶基因的完整DNA和得到的蛋白序列示于图2中。DNA序列数据显示出876bp的开放阅读框，得到292个氨基酸的推导的蛋白序列和33kD的预期分子量。这类似于报道的众多其它水解脱卤素酶的分子量。
为了测定是否该分离的基因有可能编码脱卤素酶，用MacVectorv.4.5.2(柯达公司)序列分析软件包比较该得到的蛋白序列与Entrez序列数据库(该数据库由美国国家生物技术信息中心维持)中含有的其它已知蛋白的序列。RDhl多肽显示出与包括数种卤代链烷和卤代酸水解酶家族脱卤素酶、环氧化物水解酶的所谓α/β具有多种不同催化功能酶成员间最大的相似性。Dow红球菌脱卤素酶与两种其它脱卤素酶和非-脱卤素酶(萤光素单加氧酶)的序列比较示于图4中。包括在图中的酶及其公开文献如下自养黄色杆菌卤代链烷脱卤素酶D.B.Janssen，等.，细菌学杂志1716791-6799(1989)；四氯环己二烯水解酶(TCCH或LinB)-Y.Nagata，等.，细菌学杂志175(20)6403-6410(1993)；Renilla reniformis萤光素单加氧酶-W.W.Lorenz，等.，美国自然科学院院报88(10)4438-4442(1992)。Entrez数据库最新发布的词条也显示出Dow RDhl蛋白与2种未知功能的假定的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)蛋白(由K.Badcock和C.M.Churcher等分别于7-22-96和7-23-96提交的Entrez数据库许可号1449324和1478233)以及紫红红球菌中分离的卤代链烷脱卤素酶(由A.N.Kulakova等于2-15-96提交的Entrez数据库许可号1196824)之间显著的相似性。
在图4中比较的序列中，仅仅黄色杆菌脱卤素酶在结构与机理水平上进行了充分的特征分析。显然，已知直接参与黄色杆菌催化循环的三个残基中的2个(2个最为重要的残基，Asp-124和His-289)在红球菌序列中是保守的。这些相似性及图中所示的相似性表明在该家族蛋白成员间高度的结构与机理保守性。脱卤素酶蛋白表达为了证实上述克隆的脱卤素酶的特性，我们力求在大肠杆菌中表达此全长蛋白。为了完成此操作，从pRDhIKO 2.1-pGEM5构建体中切下含有RDhl基因的1300bp的NcoI/SpeI限制片段并且与NcoI/NheI-消化的pEXPROK载体连接。因为SpeI和NheI产生与连接相容性的限制性片段，这样导致产生含有在IPTG可诱导的Ptac启动子转录控制下及内源性RDhl 3′非翻译区终止控制下的完整推断RDhl基因的表达构建体(图5)。
将以该得到质粒(pRDhIKO 2.3-EXPROK)转化的菌落于2mL微培养瓶(miniculture)中培养过夜，然后沉淀，清洗并超声处理1mL的每种培养物。然后测定提取物在加入RDhl底物，1-氯丁烷后催化氯化物释放的能力。在不含该克隆基因的培养物中缺失氯化物释放活性；具有该克隆基因的培养物显示出氯化物释放活性，当该基因的转录活性通过添加IPTG而增加时该活性增加。因此，在含有pRDhIKO2.3-pEXPROK构建体的重组大肠杆菌过夜培养物中可诱导脱卤素酶活性。实施例2编码此脱卤素酶的基因已被分离并克隆入细菌大肠杆菌中。DNA序列分析显示此分离的基因编码与其它已知脱卤素酶具有高度序列相似性的蛋白。为了增加生物合成水平至商业上有意义的水平(即“表达”)，检测了众多报道能够在大肠杆菌中高水平制备异源蛋白的系统。
为了构建表达载体pEXPROK-RDhl，用限制酶NcoI/NheI消化质粒pEXPROK且然后用QIAqmick凝胶提取试剂盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)加以纯化。用引物RDHL 5.4作为正向引物(含有NcoI位点以指导翻译起始)并且用引物RDHL作为反向引物(且含有NheI位点)扩增RDhl开放阅读框。用NcoI和NheI消化扩增的DNA后，将该基因连接入pEXPROK载体中。然后将新的构建体转化入大肠杆菌AG1感受态细胞并挑取氨苄青霉素抗性的菌落。通过分析性的限制酶消化鉴定含有RDhl基因的质粒并称为pEXPROK-RDhl构建体。pEXPROK-RDhl质粒图谱示于图3中。pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl表达载体的构建为了构建pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl表达载体，用寡核苷酸引物RDhl 5.4和RDhl 3.13以标准的PCR条件从pEXPROK-Rdhl中扩增RDhl基因。扩增产物于琼脂糖凝胶上分离并用标准的方法加以纯化。
pRSET和pTrcHis载体均为来自克隆载体pUC18和19系列的IPTG可诱导的表达载体。它们均购自Invitrogen公司(圣地亚哥，加州)并含有下面的特征(a)两者均设计用于高水平蛋白表达并且均具有氨苄青霉素抗性基因。
(b)两者均含有编码六个组氨酸残基N-末端融合肽的序列。这些残基作为金属结合区而起作用并且可允许以后通过亲和层析而纯化重组蛋白。
(c)这些载体编码位于脱卤素酶编码区域下游的肠激酶切割识别序列(FLAG和/或EXFLAG肽)，它们使其能够通过抗-FLAG抗体加以检测和固定。
pRSET载体的高水平表达特性是由于在该异源基因的上游存在T7启动子。由于大肠杆菌不含有T7聚合酶，然而，需要含有T7 RNA聚合酶基因的M13噬菌体用于蛋白表达。实际上，通过以含有T7 RNA聚合酶的T7噬菌体感染重组大肠杆菌而引入含有在T7启动子控制下异源基因的细菌来制备该异源蛋白。作为选择，商业上可得到的稳定表达T7 RNA聚合酶(即，BL21)的大肠杆菌可用pRSET构建体加以转化。
通过用限制性酶NcoI/HindIII消化质粒pRSET且然后掺入在5′端含有NcoI位点且在3′端含有HindIII位点的RDhl基因片段而构建pRSET-RDhl表达载体。然后将此新构建体转染入大肠杆菌JM109感受态细胞并挑取氨苄青霉素抗性的菌落。通过分析性的限制酶消化鉴定含有RDhl基因的质粒并称为pRSET-RDhl构建体。pRSET-RDhl表达构建体示于图6中。将一个这样的克隆(克隆16-4)用于对用该pRSET系统的蛋白表达进行特征分析。
pTrcHis载体含有另一种高水平转录启动子-trc启动子，为详细分析过trp启动子与lac启动子的融合。pTrcHis载体也含有位于此异源基因上游的小顺反子(mini-cistron)，这使得多克隆位点中克隆蛋白高度有效而反复地起始翻译。
用类似的方法，我们将RDhl基因片段克隆入pTrcHis载体从而构建pTrcHis-RDhl表达载体。为了表达研究，将大肠杆菌TOP 10′感受态细胞用pTrcHis新构建体转化。pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl表达载体均含有位于NheI位点下游的11氨基酸EXFLAG肽。
EXFLAG肽序列与此克隆蛋白的开放阅读框一致并对于分析检测和亲和纯化是有用的。图7显示完整pTrcHis-RDhl表达构建体的图谱。其中一个这样的克隆(克隆18-3)被鉴定为高表达克隆并用于对TrcHis表达系统的进一步特征分析。pTrxFus-RDhl表达载体的构建Thio FusionTM表达系统( Invitrogen公司，圣地亚哥，加州)通过将编码这样蛋白的基因融合到编码大肠杆菌蛋白，硫氧环蛋白的基因上而提供在pTrxFus表达载体中表达大量异源蛋白的方法。此硫氧环蛋白部分可赋予其融合部分的溶解性及热稳定性，因而开启了用于通过渗透在休克或加热处理而纯化的方法。该表达载体，pTrxFus允许外源基因插入其多克隆位点中。其利用噬菌体λ的PL启动子驱动表达以及同样来自噬菌体λ的cl阻遏子控制转录的水平。cl阻遏子基因的表达在trp启动子及阻遏子蛋白的控制下。通过加入色氨酸至培养基中而切断cl阻遏子的合成并且允许从PL启动子的转录而诱导外源基因的表达。
设计引物Trx2++和Trx-(见DNA引物设计)以修饰具有TrxFus多克隆位点独有的酶限制位点的RDhl基因片段。将质粒pEXPROK-RDhl用作模板并且通过用在5′端加入BamHI位点和3′端加入PstI位点的引物Trx2++和Trx-进行PCR产生基因片段。用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化此片段。将pTrxFus载体和基因片段进行酶消化、琼脂糖凝胶纯化并连接。将新构建体，pTrxFus-RDhl(图8)掺入根据制造商说明制备的GL174电感受态细胞(Invitrogen公司)。表达分析细胞培养物的培养与诱导-为了表达研究，将鉴定为含有适当DNA构建体的克隆培养于15mL圆底聚丙烯培养管中含有50μg/mL氨苄青霉素的3mL Luria培养基(LB)或SOB培养基(Difco，Detroit，MI，美国)中。将这些培养管于37℃振荡(于旋转摇瓶机中200转/分钟)孵育过夜或培养至OD600为0.6。之后，加入2mL具有IPTG的新鲜培养基中(至1mM的IPTG终浓度)并将培养管于37℃再次恒定振荡4-5小时进行孵育。为了重组克隆pRSET，在IPTG诱导1小时后将细胞培养物用预先滴定的M13/T7噬菌体感染并按前述继续诱导。
至于pTrxFus的克隆，将含有RDhl基因的克隆培养于具有100μg/mL氨苄青霉素的1mL RM培养基中并且于37℃振荡(于旋转摇瓶机中200转/分钟)孵育过夜。第二天，加入9mL新鲜诱导培养基并于30℃继续培养至OD550为0.5。然后，用色氨酸诱导细胞培养物(至100μg/mL的终浓度)并转入37℃的培养箱中且再以200rpm振荡2到4小时。
无细胞提取物的制备为了蛋白分析，通过于4℃离心(在SorvallSS-34转头中5000rpm10分钟)而沉淀诱导的过夜细胞培养物。在含有1mM EDTA二钠的冷的10mM Tris硫酸盐缓冲液(pH 7.5)中清洗细胞沉淀且然后再次离心。对于pEXPROK、pRSET和pTrcHis克隆，最终的悬液用小尖端超声处理探测器(small-tip sonicatingprobe)(Soniprep 150，MSE公司.，Crawley，Sussex)以14Hz在冰上经过20秒“开”，30秒“关”的3次重复进行超声处理。通过以10,000rpm离心10分钟去除不溶性残渣。然后将无细胞上清液转移至干净的聚丙烯管中并进行适当的分析。将pTrxFus克隆的最终细胞悬液超声处理3次10-秒喷射(brust)且然后于干燥的冰/乙醇浴中快速冰冻。冰冻后不久，于37℃快速融化细胞裂解物并且再进行2次快速的超声处理-冻-融循环。最后一次融化后，继续上述去除细胞及不溶性残渣的步骤。pEXPROK-RDhl的表达与纯化图9的左侧(2-5道)显示pEXPROK-RDhl克隆12-4细胞裂解样品的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝胶并且于右侧(8-11道)显示部分纯化的rRDhl酶的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝胶。1道含有分子量标准且6道和7道含有单个60ng和180ng 55kD分子量的FLAG-肽蛋白条带。2-5道显示来自无细胞提取物的所有可溶性蛋白。由于rRDhl酶不是提取物中的主要蛋白，对相同凝胶进行免疫印迹以确证此重组酶的存在。图10显示在每个样品道中由抗-FLAG抗体在预计分子量～35kD所识别的该重组酶条带。图10中的6道和7道分别为20ng和60ng的FLAG-肽蛋白。在Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝胶和免疫印迹膜上分析亲和纯化的重组酶。将四种亲和-纯化rRDhl酶的连续馏份在图10中所示的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝胶中8-11道走胶。除了位于～35kD分子量的明显条带外，该凝胶上其它蛋白条带也是可见的。然而，部分纯化酶(图10，8-11道)的免疫印迹证实在～35kD的重组酶是唯一用抗-FLAG抗体染色的蛋白并且因此似乎为正确翻译的rRDhl蛋白。此数据表明rRDhl酶在大肠杆菌胞内环境中及整个纯化过程中均可染色。pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl的表达分析获自pRSET重组酶表达系统和pTrcHis重组酶表达系统克隆的无细胞提取物中重组RDhl蛋白的存在。签定到含有正确大小NcoI/HindIII DNA片段的5个克隆，培养过夜、裂解并通过SDS-PAGE凝胶分析rRDhl的表达(图11)。1道显示分子量标准且7和8道含有单个60ng及180ng 55kD分子量的FLAG-肽蛋白条带。2-6道显示此5个克隆的1μL无细胞提取物样品且9-12道显示0.1μL的无细胞提取物样品。当抗-FLAG抗体用于染色此免疫印迹(图12)时，这些提取物的免疫印迹显示出2条带(35kD和38kD)。这可能表明在pRSET-RDhl系统中有2个起始密码子。第一个起始密码子最初设计位于pRSET载体系统中实际克隆位点之前的大约41个氨基酸(123bp)，这使得从6个组氨酸后的Met ATG密码子开始翻译。第二个起始密码子可能位于NcoI克隆位点本身上，其被设计位于RDhl基因片段最初的5′端引物中。然而，抗-FLAG抗体反应条带的存在证实了rRDhl酶的存在。
图13显示来自pTrcHis系统无细胞提取物的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝胶并且图14显示相同SDS-PAGE凝胶的免疫印迹。pTrcHis系统的所有克隆在～35kD分子量处显示出过载的抗-FLAG反应的条带，其证实该提取物中rRDhl酶的存在。由于最初培养物的体积和无-细胞提取物制品在所有三个系统中是相同的，所以这些过载的条带显示在pTrcHis系统中有更高的酶产量。pTrxFus-RDhl的表达用还原性SDS-PAGE检测pTrxFus系统的细胞提取物可溶性蛋白。图15显示以Pro-BlueTM染色的凝胶。12道显示分子量标准且11道显示单个150ng的55kD分子量和FLAG-肽蛋白。在1道至9道中于47kD分子量处清晰可见硫氧环蛋白融合条带的主要蛋白。此大小相应于12kD的硫氧环蛋白和35kD的rRDhl酶。相反，10道具有来自细胞裂解不溶性物质的样品，这显示不存在高水平表达的硫氧环融合蛋白。这证实所有的融合蛋白均为可溶性状态。来自其它实验的数据显示此融合蛋白条带在免疫印迹膜中相同的分子量处可由抗-FLAG抗体所识别(数据未显示)。水解脱卤素活性的分析为了定量该重组酶的水解脱氯化反应活性，使用了460nm处的氯化物释放比色分析。
通过加入适当量的无细胞提取物(按上述制备)至玻璃瓶中6.0mL的反应缓冲液中而测定重组蛋白的活性。100mM甘氨酸钠缓冲液(pH9.0)用于测定对1，4-二氯丁烷(DCB)(Aldrich化学公司)的活性并且100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.0)用于测定对1，2，3-三氯丙烷(TCP)的活性。加入卤化的底物(6μL)和微搅拌棒并封闭小瓶。将封口的小瓶于30℃水浴中搅拌孵育。
每间隔一定时间取出1.0mL样品并用于自由氯化物的测定。加入试剂1，5-25N高氯酸中0.375M硝酸铁(10％v/v)以终止水解反应并且加入试剂2，乙醇中的饱和硫氰酸汞(10％v/v)以显色。于460nm处在Perkin-Elmer 552A UV/VIS分光光度计计数最终样品。在校正对空白的非酶性水解后测定比率(rates)重组红球菌脱卤素酶的脱卤素活性尽管前面的数据表明与野生型红球菌相比，该重组脱卤素酶可以高得多的水平在大肠杆菌中合成，但它们没有说明此表达蛋白的活性。的确，增强脱卤素酶的产量是本工作的关键目的。签于此原因，我们测定了上述每种构建体代表性克隆中脱卤素酶活性的相对水平。活性通过自由氯化物释放分析加以测定并与图13-15中记录的蛋白表达作比较。蛋白表达通过高分辨率扫描光密度仪在SDS-PAGE凝胶上加以定量并且测得的rRDhl的量以总可溶性蛋白％来表示。下表显示在所有四种表达系统中的总可溶性蛋白中脱卤素活性与rRDhl酶百分数之间的关系。<
>*DCB单位测定为该酶脱卤素1，4-二氯丁烷时指示剂颜色改变的程度(ΔOD/min)。
该数据显示rRDhl蛋白表达与观察到的脱卤素酶活性间强烈的相互关系。
在此实施例中，红球菌卤代链烷脱卤素酶可以高水平在检测的大肠杆菌4种系统中的3种中表达。重组的红球菌脱卤素酶在所有4种系统中稳定表达并且在预期的分子量处由抗-FLAG抗体所识别。此重组酶显示出与野生型脱卤素酶类似的活性水平以及与异源蛋白表达成比例的活性水平。实施例3多孔氧化铝支持物的制备将代表22TCP活性单位的蛋白(385mg)于4℃在温和搅拌下固定于2.0g自由挥发的氧化铝(美国，IL，DesPlaines UOP的lot#1587k-4氧化铝)上。方法按照GIA-活化的UOP标准实践，包括聚乙烯亚胺包被，水清洗和酶的加入。轻轻倒掉浸泡液并用2mM Tris/1mMEDTA，(pH 7.5)清洗支持物5次。用于固定的酶纯化及制品用pTrcHis表达系统在大肠杆菌中制备重组红球菌脱卤素酶。用于所有固定研究的酶制品首先用4℃ 45％到70％饱和度的硫酸铵沉淀部分纯化，然后于10mM Tris硫酸盐，1mM EDTA(pH 7.5)中透析和澄清.此碱性缓冲液用于整个纯化步骤中。通过280nm处吸光度测得这些制品从裂解液中常规被纯化4-5倍，并且通过SDS-PAGE估计为30-35％纯度的脱卤素酶蛋白。通过用0-400mM硫酸铵梯度洗脱的再一次DEAE-琼脂糖层析步骤得到更为高度纯化的酶制品。这样得到了具有85-90％酶活性大约从裂解液中10倍的纯化。该步骤后用更窄的0-120mM硫酸铵梯度进行QAE-琼脂糖(Sepharose)FF层析，得到从裂解液约12-倍的纯化，并进行SDS-PAGE以证明酶的均一性。从TrcHis RDhl表达系统中纯化的RDhl一般在此称为“rRDhl”、支持物的制备将所有阴离子交换支持物根据制造商说明彻底水合(如果必要)，然后彻底冲洗以去除乙醇并通过以10mM Tris硫酸盐1mM EDTA连续冲洗而转变为硫酸盐形式。整个过程使用此相同的起始缓冲液以上样酶制品。
根据已很好建立的方法(美国专利No.4,268,410和Mosbach，固定化酶，于44酶学方法(1976)(学术出版社，纽约))用聚乙烯亚胺和戊二醛修饰无机支持物。秤量干燥的支持物样品并分散于12mL的加盖小瓶中。加入2.5％聚乙烯亚胺水溶液至总的每克支持物10mL。将瓶封闭且然后于室温在摇动的摇瓶机上轻轻搅动1小时。将样品转移至轻轻真空去除液体的小的布氏漏斗中。将支持物转移至玻璃皿中并让其于室温空气干燥过夜(约18个小时)。将样品转移至其中以每克(gm)支持物20mL的比例加入新鲜融化的25％戊二醛水溶液的新小瓶中。将混合物封闭且然后于布兜(hood)中不停振荡1小时。轻轻倒去戊二醛并用水彻底冲洗直到品红试验没有检测到醛为止。在酶固定之前，轻轻倒出支持物但不让其干燥。酶的固定所有的酶固定于冷的4℃室温用摇动的摇瓶机进行以提供缓慢的搅动。用于酶制品结合到支持物上的时间为从用于离子-交换支持物的1小时到用于以PEI-GIA修饰无机支持物实验的最大为4天的范围。缓冲液更换仅仅用于Celite R648结合能力研究，其中的Tris缓冲液在预装的交联葡聚糖(Sephadex)G-25柱上更换以10mM磷酸钾，1mM EDTA(pH 7.0)缓冲液。酶从离子交换支持物上的脱落将2套250μL等份的树脂悬浮液(slurry)与酶11.1 DCB U(Toyopearl)或6.63 DCB U(PEI Cellulose)结合过夜。小心去除结合上清液并加以分析。将树脂于6,000rpm离心8分钟。去除其它的上清液并用100mM甘氨酸钠缓冲液(pH 9)清洗树脂2次。将每套中的一管用0.5M(NH4)2SO4处理1小时从而使酶从支持物上脱落。再次用缓冲液冲洗这些树脂。用DCB作为底物分析树脂和上清液的活性。离子交换支持物阴离子交换层析已广泛用于野生型和重组脱卤素酶的纯化及特征分析。该酶在中性pH(在其中进行脱卤素反应)时为阴离子性的并且阴离子交换支持物经常在固定此类蛋白中发挥良好功能。因为此方法可允许对酶进行同时纯化与固定，故其也是具有吸引力的，为了证实此潜在的用途，我们在广泛的pH范围内检测了rRDhl蛋白在阴离子与阳离子交换树脂上的结合与洗脱。图2显示在5个pH单位范围中脱卤素酶在DEAE琼脂糖离子交换树脂上几乎定量的滞留。相反，CM-琼脂糖在高于pH 5时迅速丧失其结合能力。固定检测众多支持材料固定rRDhl的效率。在这些研究中，使用脱卤素酶40-70％硫酸铵截流的部分。制备固定于13种离子交换支持物中每种支持物上的两套酶。立即用氯化物释放分析测定每套酶中的其中一种酶的脱卤素活性。将第二种酶用TCP-饱和的10mM Tris缓冲液(pH7.5)于45℃处理1小时。此处理后，去除上清液并也通过标准的氯化物方法测定该套酶。表4总结了这些测定的结果。表4在底物存在下于45℃孵育1小时后在13种离子交换支持上对TrcHis RDhl的筛选支持物 供应商 Lot/批号# TCP处理后的活性％硅胶PE1-Silica Sigma 24H0810 0DEAE交联葡聚糖A-50 Sigma 24H0485 19PE1纤维素(med.mesh)Sigma 94H7200 54Glass，氨丙基 Sigma 34H8260 43ToyopearlSuper Q-650M TosoHaas65QAM02RM 79DEAETrisacryl Plus-M Sigma 92H0861 21Spectra/凝胶离子交换1×8 Spectrum16865 14Dowex1×8-200离子交换树脂 Aldrich 12627-85-954*DE52 Whatman 1152032 50季铵纤维素 Whatman 9852032 2DEAE琼脂糖 Sigma 53H0177 30AG3×4 100-200 Bio-Rad 52594A18AG4×4 100-200 Bio-Rad 47426A9*于37C孵育这些结果显示这些基质作为脱卤素酶支持物的效率具有显著的差异性。类似的差异性也将见于催化类似反应的类似的脱卤素酶。
筛选出四种最佳候选支持物在TCP存在下一定时间后仍具稳定性。它们为PEI纤维素、ToyopearlSuper Q-650M，GlassAminopropyl和DEAE Sepharose。制备2套，其中一套用于最初的氯化物检测分析，另一套用于在暴露至TCP后的测定。表5显示4个当中的3个在头24小时中丢失显著的活性但在起始的(活性)丢失后维持稳定的活性达至少7天。Toyopearl经历了类似但延迟的丢失(于48-120小时)并且然后似乎稳定。表5于室温中TCP存在于4种离子交换支持物上TrcHis RDHL的稳定性研究支持物 经过一定时间后的活性％24hr48hr120hr192hrPE1 Cellulose(med.mesh)Sigma 83 79 78 78Glass，Aminopropyl Sigma 78 87 75 66ToyopearlSuper Q-650M TosoHaas 100 100 78 82DEAE Sepharose Sigma 76 79 73 62所有四种树脂似乎均为固定脱卤素酶的良好候选材料并且似乎提供用于延长酶活性的合适表面。共价偶联至Tresyl-活化的聚丙烯聚合物上为了测定经突出氨基将rRDh1共价偶联至任何支持物上的可行性，对Tresyl-Toyopearl进行了评估。此活化的树脂提供了与该酶间稳定的伯氨基键
用于这些研究的rRDhl制品已用抗-FLAG抗体柱从大肠杆菌裂解液中得到亲和纯化并且通过SDS-PAGE估计约有20％的纯度。在制造商描述的条件下将0.35单位的酶(1.96mg总蛋白)偶联到40mgTresyl-Toyopearl上。3小时后，通过A280处观察到(吸收)的下降测得93％的蛋白已被偶联。再加入10mg树脂并继续偶联1小时以结合＞98％的蛋白。重新测定清洗凝胶的脱卤素酶活性显示回收0.11单位的活性(31％)。用2.6单位相同酶制品和1.0gm活化树脂的再次试验证实有37％活性的回收。根据制造商的说明，从偶联至该支持物酶的活性回收通常在40-60％的范围，故31-37％代表合情合理的回收并且足以通过其氨基将该酶偶联至固定支持材料而用于小规模或工业反应器变成商业实践。
亲水树脂的这种共价附着也是固定脱卤素酶的有效方法。与戊二醛交联的聚乙烯亚胺浸渗的无机支持物由于容易得到、价格低廉、高的上样能力、再生与再利用的易行性以及广泛的孔径大小，故无机支持物也在工业酶领域中发现有广泛的用途。多孔的氧化铝、二氧化硅和Celite(硅藻土)作为固定化酶的支持物已发现了广泛的应用，其中基于钛和碳的支持物应用较为有限。
可通过三种机制将酶固定于无机支持物上。该酶可经离子相互作用与无机支持物结合或可经离子-交换机制结合到已浸渗入无机支持物中的离子聚合物上，或者可用双功能化学接头交联至离子聚合物上。第一种方法未见有广泛的应用因为微弱的离子相互作用频繁导致酶的冲洗掉。聚乙烯亚胺(PEI)由于其低廉的价格而成为浸渗的最佳聚合物。这些氨基要用到广泛的交联化学。戊二醛是研究得最多并且是所用的廉价交联剂。对rRDhl的研究完全集中于此偶联化学。
使用已确立的用于制备PEI-浸渗的多孔支持物然后戊二醛交联的方法(美国专利No.4,268,410和Mosbach，于44酶学方法中的固定化酶，(1976)(学术出版社，纽约))。最初筛选2种支持物rRDhl活性的回收。已用PEI浸渗的多孔二氧化硅获自Sigma(标准250孔径大小)。Celite R-648获自Manville(标准孔径约150)并根据美国专利No.4,268,410的方法用Sigma的PEI(平均50,000MW)浸渗。将两种支持物均以戊二醛(GIA)处理且然后用水彻底清洗。将5.5单位(1.0mL，0.55mg蛋白/mL)高度纯化的rRDhl酶制品(由SDS-PAGE(测定为)＞98％纯度)用于偶联至500mg每种以戊二醛处理，PEI浸渗的2种支持物上。此上样水平(0.11％w/w)认为比该支持物的已知上样能力至少低2个数量级。在彻底清洗以去除未连接的蛋白之前，将该酶与支持物在4℃轻轻振荡孵育过夜(18个小时)、用DCB重新测定这两种支持物证明PEI-Celite R-648有40％的回收且PEI-二氧化硅有31％的回收。在反应条件(饱和DCB)下将这些样品贮存于室温1周并进行再次测定。Celite固定的酶制品在1周中丢失49％的活性而二氧化硅固定的酶制品丢失其28％的活性。
为了快速测定哪一种类型的无机支持物将得到rRDhl活性的最佳回收，筛选数种商业上可得到的多孔支持物，与在前面的实验中一样，将高度纯化rRDhl酶的上样水平设定比该支持物预期的上样能力低三个多数量级(0.0055％w/w)从而仅仅根据回收的活性比较支持物而依赖于上样能力、孔径大小等。
筛选出三种多孔的氧化铝、三种多孔的二氧化硅及二种多孔的碳。此外，在相同条件下重新评估Sigma PEI-Silica和Celite R-648(在以前的筛选中评价过)。与以前一样用PEI浸润所有的支持物并以戊二醛处理。将25μL酶制品(13.8μg)与每种支持物于4℃轻轻搅动孵育72小时从而确保最大的上样。在洗浴液中酶的上样通过测定24和72小时的A280而加以监测。孵育72小时后在洗浴液(未结合的)及洗过的凝胶(结合的)上测定对DCB的活性。表6和7显示这些研究的结果。
表6由A280监测到的rRDhl酶向PFI-浸渗GIA处理的多孔支持物中的浸入支持物于24小时上样的百分数 于72小时上样的百分数氧化铝-Davison Low SA 83％62％氧化铝-Norton SA 6176 86％84％氧化铝-Calcicat Type C 84％67％二氧化硅-Calcicat S-88-473 TypeA69％72％二氧化硅-Shell 5980-F 81％93％二氧化硅-Davison 952-08-5×91％92％碳-Borecker Subunit 77％91％碳-AmCy 5701-Sn 90％95％硅藻土-Manville R64882％95％PEI-二氧化硅-Sigma 85％93％表7在PEI-浸渗GIA处理支持物上酶活性的回收支持物 ％结合％未结合％丢失*氧化铝-Davison Low SA7％ 38％55％氧化铝-Norton SA 61763％ 17％80％氧化铝-Calcicat Type C 7％ 34％59％二氧化硅-Calcicat S-88-473 TypeA 12％ 28％60％二氧化硅-Shell 5980-F12％ 8％ 80％二氧化硅-Davison 952-08-5× 17％ 11％72％碳-Borecker Subunit 5％ 9％ 86％碳-AmCy 5701-Sn 7％ 5％ 88％硅藻土-Manville R648 21％ 5％ 74％PEI-二氧化硅-Sigma 6％ 7％ 87％*％丢失＝100％-(％结合+％未结合)72小时后每种支持物显示出62％到95％浸入范围的不同浸入模式。对于大多数系统，72小时对于在4℃完成可完成蛋白的最大上样是足够的。然而，三种氧化铝系统实际上在24小时表现出较72小时更大的浸入。与未处理可溶性酶对照相比，在72小时结合酶活性的回收为3％到21％的范围。在所有检测的系统中，有55％到87％的相当多活性没有被计算或“丢失”。同样，以前用的支持物(Sigma PEI-Silica和Manville Celite R 648)显示出更少的结合回收。这可能是由于用于该实验中较低的酶上样比例或更长的孵育时间。如果有了此结合效率和该结合酶活性的回收，硅藻土、、二氧化硅、碳和氧化铝均可用作本发明中有效的固定支持材料，虽然硅藻土和二氧化硅的表现优于氧化铝和碳。然而，就稳定性而言，氧化铝支持物似乎表现更优越(见下面)。
此结合样品也进行长期稳定性研究。用DCB作为底物分析后，冲洗支持物并浸于TCP-饱和的缓冲液中。在给定的时间点，去除TCP缓冲液，再次冲洗支持物并用DCB进行分析。表8室温中PEI交联支持物的长期稳定性研究支持物 维持的活性％at 41 hrat 136 hr氧化铝1 38 57氧化铝2 66 67氧化铝3 58 75二氧化硅1 76 81二氧化硅2 79 46二氧化硅3 60 30碳1 75 0碳2 37 48硅藻土57 12PEI-二氧化硅 43 60因此，在固定反应中表现出中间回收水平的2种支持物，二氧化硅和氧化铝证明经过一定时间后具有最好的稳定性。也筛选所有这些支持物没有PEI或GIA修饰而直接结合该酶的能力。然而，结合很弱且不可重复并且容易用冲洗从支持物上除去酶。具有通过离子交换而结合酶的聚乙烯亚胺浸渗的无机支持物同样已知PEI的分子量对固定化酶的整体产量和稳定性具有影响。此外，PEI能够作为各种支持物上的离子交换配体或作为戊二醛交联受体而起作用。由于这些原因，根据前面的部分所述的方法将两种不同分子量的PEI浸渗入各种多孔的无机支持物中。然而，在这些实验中，酶(含有1-2U/mL的半纯化制品)通过离子交换而结合但省略了GIA交联步骤。对样品进行稳定性筛选从而检测是否PEI大小为重要的因素。表9没有交联的PEI浸渗的多孔支持物的稳定性筛选支持物 供应商 MW PEI 维持的活性％at 24 hrat 120 hr1氧化铝 Norton SA 6176 50,00070 622氧化铝 Calcicat Type C 50,00061 423二氧化硅 Calcicat S-88-473 Type A 50,000101 644二氧化硅 Shell 5980-F 50,00080 555碳 Borecker Subunit 50,00041 326碳 AmCy 5701-Sn 50,00039 177硅藻土 Manville R 648 50,00083 508氧化铝 Norton SA 6176 2000 82 559氧化铝 Calcicat Type C 2000 91 6110二氧化硅 Calcicat S-88-473 Type A 2000 94 5711二氧化硅 Shell 5980-F 2000 76 5512碳Borecker Subunit 2000 44 5013碳AmCy 5701-Sn 2000 42 2114硅藻土Manville R 648 2000 58 2除了硅藻土外，不同分子量的PEI似乎没有对酶的固定效率或稳定性具有重要影响。实施例4pRSET-RDhl.Nde的构建通过用限制酶NdeI和Hind III消化质粒pRSET RDhl克隆16-4然后将5′端含有NdeI位点且3′端含有Hind III位点的RDhl基因片段掺入该构建体中而构建pRSET-RDhl.Nde表达载体。然后将该新的构建体转化入大肠杆菌JM109感受态细胞(获自美国加州Carlsbad的Invitrogen)中并挑取氨苄青霉素抗性的菌落。通过分析性限制酶消化鉴定含有RDhl基因的质粒并称为pRSET-RDhl.Nde构建体。重组Rdhl蛋白的制备将两种新的构建体-pRSET-RDhl.Nde和pTrcHis-RDhl转化入大肠杆菌B834(DE3)感受态细胞(来自Novagen公司，Madison，WI，美国)。通过脱卤素活性分析证实活性脱卤素酶的产生并用PAGE研究酶产生的水平。用460nm处氯化物释放比色分析测定脱卤素活性从而分析对1，4-二氯丁烷(DCB)的酶促脱氯化活性。
我们观察到在此宿主-大肠杆菌B834(DE3)感受态细胞中增加的重组RDhl酶的产生。下表显示在不同表达系统和宿主细胞中脱卤素活性与总可溶性蛋白中rRDhl酶百分数之间的关系。
*DCB单位为对1，4-二氯丁烷(DCB)脱氯化活性的量度。+大肠杆菌AG1化学感受态细胞购自Stratagene(La Jolla，CA，美国)；大肠杆菌TOP 10F′化学感受态细胞购自Invitrogen(Carlsbad，CA，美国)；大肠杆菌G1 174细胞购自Invitrogen(Carlsbad，CA)并根据供应商说明制成电感受态。实施例5修饰的红球菌脱氢酶由于由TrcHis RDhl构建体制备的红球菌脱氢酶已在氨基及羧基端用额外的氨基酸加以修饰，故建立质粒构建体从而测试这些修饰中的每种修饰可能对该酶活性具有的影响。通过以NcoI和AgeI酶促消化pTrcHis Rdhl 18-3质粒并将17bp的寡核苷酸连接到得到的缺口中而去除氨基末端的多-组氨酸尾部。
此寡核苷酸对的DNA序列如下RDhl ΔHis-6-F5′-CATGGGTGAAATAGGTA-3′RDhl ΔHis-6-R5′-CCGGTACCTATTTCACC-3′用标准的分子生物学方法，将His-6-F和His-6-R寡核苷酸退火、连接入消化的18-3构建体中并转化入感受态大肠杆菌TOP 10F′细胞中。通过培养于LB/Amp琼脂板上筛选转化的克隆。得到的氨基末端序列为-12 -11 3ATG GGT GAA ATA GGTMet Gly Ile(以最初未修饰序列的氨基酸编号显示)。
消化和重新连接得到其中的Ala-293 Ser-294序列(图2)变为Ala-293 Arg-294序列的构建体。编码Arg密码子的后面为相应于原始序列中碱基927-979处的TGA核苷酸三聚体的终止密码子。
通过以AvrII和NheI消化pTrcHis RDhl 18-3并且再连接该质粒而去除羧基末端EXFLAG。
通过酶促消化和凝胶电泳筛选单个克隆。将候选克隆于37℃培养于5mL培养物中，以IPTG诱导并通过超声处理裂解。通过PAGE、Western印迹和氯化物检测分析来分析裂解物。缺乏氨基末端多组氨酸或羧基末端EXFLAG的那些克隆显示出与原初构建体同等的催化活性。实施例6pTrcHis RDhl-S-Tag和pRSET RDhl-S-Tag的构建材料与方法CTERM S-Tag F(正向)和CTERM S-Tag R(反向)为被设计将FLAG多肽-一种11氨基酸肽-转变为S-Tag多肽-一种15氨基酸序列的两条引物。这些寡核苷酸的序列如下(S-Tag片段的每条链被下划线)
---Avr II---CTERM S-Tag F 5’-CTA GGT GAC AAA GAA ACC GCT GCT GCT AAA---Nsp V---TTC GAA CGC CAG CAC ATG GAC AGC AAA TAAGTT TAA ACA TCA TTCCAATTGC---Not I---CTERM S-Tag R 5’-GGCCGCAATTGGAATGATGTTTA AAC TTA TTT GCT--Nsp V---GTC CAT GTG CTG GCG TTC GAA TTT AGC AGC AGCGGT TTC TTT GTCACpTrcHis RDhl-S-Tag的构建为了构建质粒pTrcHis RDhl-S-Tag，用限制酶AvrII和NotI消化质粒pTrcHis RDhl克隆18-3并与S-Tag片段连接(通过室温将引物CTERM S-Tag F和引物CTERM S-Tag R一起退火而制备S-Tag片段)。将此新的构建体，pTrcHis RDhl-S-Tag掺入到大肠杆菌AG1感受态细胞(来自Stratagene，La Jolla，CA，美国)并挑取氨苄青霉素抗性的菌落。通过分析性限制酶消化鉴定含有S-Tag片段的质粒。pRSET RDhl-S-Tag的构建也使用与用于构建pTrcHis RDhl-S-Tag相同的方法构建pRSETRDhl-S-Tag，但是用限制酶AvrII和NotI消化的质粒pRSET RDhl克隆16-4起始并将该构建体连接到上述的S-Tag片段上。
将半纯化的rRDhl(来自TrcHis RDhl克隆18-3的EXFLAG标记的蛋白)与该实施例中制备的半纯化RDhl-S-Tag蛋白进行动力学比较。在0mM到5mM的TCP浓度范围检测氯化物释放活性。如图19中所示，S-Tag-修饰的蛋白显示出较EXFLAG修饰蛋白Vmax大约15％的一致性增加。与EXFLAG蛋白相比，S-Tag蛋白也显示出对TCP～25％更低的Km。这些结果证实TDhl酶C-末端的改变可用于调节和提高该酶的活性。实施例7反应器设计及行为表现反应器设置用总共316根1/4英寸ID的不锈钢装配壳形及管形的小规模反应器。反应器的进出口管也为不锈钢。用Lauda循环水浴(具有恒温器)维持反应器于30℃。反应器以上流(up-flow)方向的固定化rRDhl酶流填充。固定化rRDhl酶首先通过将部分纯化的酶制品(SDS-PAGE鉴定约为70％纯度)上样至PEI浸渗的以25％(w/v)戊二醛预处理2小时的氧化铝(来自UOP的ISP 4000级)中而加以制备；然后以蒸馏水充分冲洗，将足够的蛋白导入氧化铝中以得到每gm支持物300mg蛋白(通过Lowry方法)。在室温下结合过夜。通过测定浸泡液中未结合的酶活性或通过280nm处的最终光吸收而估计结合酶的活性。
用2mm玻璃珠作为间隔体在进出口处将固定化的rRDhl酶转移至反应器中。用预温的10mM磷酸钠/10μM EDTA缓冲液(pH 7.0)的液体加料开始灌流。清洗数小时去除任何未结合的酶后，用1，2，3-三氯丙烷(TCP)饱和液体加料并以0.15mL/min的流速作为连续搅拌的溶液而输送。在通过GC分析取样进出口液流的反应物TCP和产物2，3-二氯-1-丙醇(DCH)浓度之前让反应器平衡～2个滞留时间。为了制备用于GC的样品，将每种样品首先以硫酸钠饱和且然后用含有10mM 2种内部标准中每一种(1，1，1，2-四氯乙烷和3-氯-1-丙醇)的氯仿(2体积)提取。然后用内部标准方法从GC数据中估计TCP和DCH水平并且计算其产率(每时间每体积的百分产量)。此最初的产率用作最初酶活性的量度。小规模rRDhl生物反应的产率将生物反应器连续运行三个月的时间、同时根据上述方法周期性取样进出口液流。在每个时间点测定该酶的容量产率(每分钟每液流体积的产物重量)并且在此段时间里转换百分数从约60％下降到约40％。测定结果列于图16中。根据此数据，估计此固定化酶的半寿期约为3500小时。这使得该固定化脱卤素酶为至今报道的最为稳定蛋白催化剂中的一员。实施例8EPPCR对脱卤素酶的定向进化对AgeI和Nhe-消化的已通过琼脂糖凝胶电泳纯化并从凝胶中提取出的质粒pTrc/His RDhl 18-3进行易错PCR诱变。将EPPCR产物连接到具有AgeI和NheI切割位点的表达载体中。将得到的质粒转化入感受态AGI细胞，将其在补充氨苄青霉素的琼脂上培养成菌落。用通过测定pH改变而测定RDhl酶活性的方法测试此得到的细胞克隆“pTrc/HisRDhl”EPPCR文库，方法如下用来自pTrc/His RDhl EPPCR文库的单菌落接种96-孔微量培养板的B1到H12孔，每孔含有200μL SOB/Amp培养基，A1-A6孔仅含有阴性对照培养基，且用野生型pTrc/His RDhl18-3菌落接种A7-A12孔作为阳性对照。代表结果列于图17和18中。
结果显示由EPPCR诱变产生的大多数克隆显示出较由TrcHisRDhl克隆18-3产生的野生型RDhl相等或更小的活性范围。然而，在分析84个来自EPPCR文库随机克隆脱卤素酶活性的每种情况中，每只96-孔板中有少数显示出较野生型酶显著更高的活性。
于1998年2月3日，将三种质粒，pTrcHis RDhl克隆18-3、pRSET RDhl克隆16-4，及pTrxFus RDhl克隆根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)并且分别得到下面的命名ATCC 209609、ATCC 209610和ATCC 209611。于1998年2月3日，将细胞培养物大肠杆菌TrxFusRDhl克隆4根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)并得到下面的命名ATCC 202087。
于1998年1月30日，将细胞培养物，大肠杆菌TrxHis RDhl克隆18-3和大肠杆菌RSET RDhl克隆16-4根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)并分别得到下面的命名ATCC202086和ATCC 202085。
基于这里公开的此说明书或本发明的实践，本发明的其它实施方案对于本领域中的技术人员来说是显而易见的。应当注意到此说明书和实施例仅应看作为例举性的，本发明真正的范围及精神由下面的权利要求加以说明。
序列表一般信息申请人名称Dow化学公司街道1790 Bldg.Washington Street城市马里兰州MI国家美国邮编48674电话517-636-1687电传517-638-9786发明题目重组卤代脂族脱卤素酶序列数目26计算机可读形式介质类型3-1/2″软盘计算机IBM PC兼容机操作系统MS-DOS软件PatentInSEQ ID NO1信息序列特征长度305类型氨基酸链型单链拓扑学线性最初来源生物紫红红球菌单个分离株TDTM003特征名称/关键RDhl酶位置1..292特征名称/关键羧基-末端EXFLAG尾部位置295..305特征名称/关键氨基-末端多-His尾部位置-10..-1序列描述SEQ ID NO1Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ser Glu Ile Gly-12 -10 -5 -1 1Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg510Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu PheLeu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg Asn Ile Ile ProHis Val Ala Pro Ser His Arg Trp Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly MetGly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Asp Tyr Phe Phe Asp Asp His ValArg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val ValLeu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala LysArg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Cys Met Glu Phe Ile ArgPro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr PheGln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val Gly Arg Glu Leu Ile Ile Asp GlnAsn Ala Phe Ile Glu Gly Val Leu Pro Lys Cys Val Val Arg Arg LeuThr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Lys Pro ValAsp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Ile Pro Ile Ala GlyGlu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Ala Tyr Met Asn Trp LeuHis Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly ValLeu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Glu Ser Leu Pro AsnCys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu His Tyr Leu Gln Glu AspAsn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Pro Gly Leu290Ala Ser Lys Leu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys295 300 305SEQ ID NO2RDhl图2 DNACC ATG GGG GGT TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT ATG TCT GAA ATA 47GGT ACC GGT TTT CCC TTC GAC CCT CAT TAT GTG GAA GTC CTG GGC GAGCGT ATG CAC TAC GTC GAT GTT GGA CCG CGG GAT GGC ACG CCT GTG CTGTTC CTG CAC GGT AAC CCG ACC TCG TCC TAC CTG TGG CGC AAC ATC ATCCCG CAT GTA GCA CCG AGT CAT CGG TGC ATT GCT CCA GAC CTG ATC GGGATG GGA AAA TCG GAC AAA CCA GAC CTC GAT TAT TTC TTC GAC GAC CACGTC CGC TAC CTC GAT GCC TTC ATC GAA GCC TTG GGT TTG GAA GAG GTCGTC CTG GTC ATC CAC GAC TGG GGC TCA GCT CTC GGA TTC CAC TGG GCCAAG CGC AAT CCG GAA CGG GTC AAA GGT ATT GCA TGT ATG GAA TTC ATCCGG CCT ATC CCG ACG TGG GAC GAA TGG CCG GAA TTC GCC CGT GAG ACCTTC CAG GCC TTC CGG ACC GCC GAC GTC GGC CGA GAG TTG ATC ATC GATCAG AAC GCT TTC ATC GAG GGT GTG CTC CCG AAA TGC GTC GTC CGT CCGCTT ACG GAG GTC GAG ATG GAC CAC TAT CGC GAG CCC TTC CTC AAG CCTGTT GAC CGA GAG CCA CTG TGG CGA TTC CCC AAC GAG ATC CCC ATC GCCGGT GAG CCC GCG AAC ATC GTC GCG CTC GTC GAG GCA TAC ATG AAC TGGCTG CAC CAG TCA CCT GTC CCG AAG TTG TTG TTC TGG GGC ACA CCC GGCGTA CTG ATC CCC CCG GCC GAA GCC GCG AGA CTT GCC GAA AGC CTC CCCAAC TGC AAG ACA GTG GAC ATC GGC CCG GGA TTG CAC TAC CTC CAG GAAGAC AAC CCG GAC CTT ATC GGC AGT GAG ATC GCG CGC TGG CTC CCC GGACTC GCT AGC GGC CTA GGT GAC TAC AAG GAC GAT GAT GAC AAA TAA TGAGCGGCCGC AAGCTTSEQ ID NO3TCCH氨基酸Met Ser Leu Gly Ala Lys Pro Phe Gly Glu Lys Lys Phe Ile Glu IleLys Gly Arg Arg Met Ala Tyr 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Seq 8CGGGCCGATC TCCACTGSEQ ID NO14Dh1 Seq 11TGCTCCAGAC CTGATCGSEQ ID NO15Dh1 Seq 12TCTGATCGAT GATCAACSEQ ID NO16Dh1 Seq 13TCCCGACGTG GACGAATGSEQ ID NO17Dh1 Seq 14GAGCGCGACG ATGTTCGCSEQ ID NO18Dh1 Seq 15CACCCGGCGT ACTGATCCSEQ ID NO19Dh1 Seq 18GAGACCGGTC AGCATTCCSEQ ID NO20PROK-Seq 1GAGCGGATAA CAATTTCASEQ ID NO21PROK-Seq 2TCTCATCCGC CAAAACAGSEQ ID NO22EXFLAG接头GAATTCAGCC ATGGCATAAG CTTTCTAGAC TCGAGGGAGC TAGCGGCCTA GGTGACTACAAGGACGATGAT GACAAATAAT GAGCGGCCGC TAGCTTSEQ ID NO23RDhl ΔHis-6-FCATGGGTGAA ATAGGTASEQ ID NO24RDhl ΔHis-6-RCCGGTACCTA TTTCACCSEQ ID NO25CTERM S-Tag FCTAGGTGACAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCAAATAAGTTTAAACATCATTCCAATTGCSEQ ID NO26CTERM S-Tag RGGCCGCAATTGGAATGATGTTTAAACTTATTTGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTGTCAC
权利要求
1.能够将卤化脂族烃转换为卤代醇的酶，所述的酶含有基本上与图2中残基1-292的氨基酸序列同源的多肽。
2.权利要求1的酶，其中所述的酶含有与图2中残基1-292氨基酸序列至少约90％到100％同源的氨基酸序列。
3.权利要求2的酶，其中所述的酶含有与图2中残基1-292氨基酸序列至少约95％同源的氨基酸序列。
4.DNA序列可表达与图2中残基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽，所述的多肽能够将卤化脂族烃转换为卤代醇。
5.权利要求4的DNA序列，其中所述的多肽与图2中残基1-292的氨基酸序列至少约90％到100％同源。
6.权利要求5的DNA序列，其中所述的多肽与图2中残基1-292的氨基酸序列至少约95％同源。
7.含有与图2中碱基37-912的核苷酸序列基本上同源多核苷酸的DNA序列，所述的多核苷酸能够表达能够将卤化脂族烃转换为卤代醇的多肽。
8.权利要求7的DNA序列，其中所述的多核苷酸与图2中碱基37-912的核苷酸至少90％到100％同源。
9.权利要求8的DNA序列，其中所述的多核苷酸与图2中的碱基37-912的核苷酸序列至少95％同源。
10.含有重组质粒的微生物，其中的质粒能够指导含有与图2中残基1-292中氨基酸序列基本上同源多肽的酶的合成。
11.权利要求10的微生物，其中的微生物为埃希氏菌属、毕赤酵母属、芽孢杆菌属、糖酵母属、假单胞菌属、红球菌属、放线菌属或曲霉属。
12.权利要求11的微生物，其中的微生物为埃希氏菌属。
13.含有编码与图2中残基1-292氨基酸序列基本上同源多肽的DNA序列的表达构建体。
14.具有卤代链烷脱卤素酶的固定化酶，该脱卤素酶具有卤代脂族脱卤素酶活性并被附着到固相支持物上。
15.权利要求14的酶，其中的酶能够从卤化脂族烃、卤化脂族醇和卤化脂族多元醇分子及基团的分子或基团中水解去除至少一个卤素取代基。
16.权利要求15的酶，其中所述的分子或基团具有至少一个卤素原子和2到10个碳原子，所述碳原子中的每一个以一个或几个的所述卤素原子独立取代，前提条件是当所述的分子或基团为醇或多元醇时，具有羟基取代基的碳原子不再有卤素取代基。
17.权利要求16的酶，其中所述的分子或基团含有至少2个卤素原子。
18.权利要求17的酶，其中所述的分子或基团为1，2-二卤代分子或基团。
19.权利要求17的酶，其中所述的分子或基团选自1，2-二卤代乙烷、1，2-二卤代丙烷、1，2-二卤代丁烷及1，2，3-三卤代丙烷。
20.权利要求19的酶，其中所述的分子或基团分别选自1，2-二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷、1，2-二溴-3-氯丙烷及1，2，3-三氯丙烷。
21.权利要求20的酶，其中所述的分子或基团转换成至少一种下面的产物分子或产物基团，包括2-氯乙醇、1-氯-2-丙醇、2-氯-1-丙醇、1-氯-2-丁醇、2-氯-1-丁醇、1-溴-3-氯-2-丙醇、2-溴-3-氯-1-丙醇、2，3-二溴-1-丙醇、1，2-二氯-3-丙醇及1，3-二氯-2-丙醇。
22.权利要求14的酶，其中所述的卤代链烷脱卤素酶获自红球菌。
23.制备含有与图2中残基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的酶的方法，包括以下步骤1)提供包括能够表达所述多肽多核苷酸的DNA片段，2)将所述的DNA片段插入表达构建体中，3)用所述的表达构建体转染宿主细胞，和4)提供宿主细胞表达所述多肽的环境。
24.权利要求23的方法，在所述方法的步骤4之后，进一步包括纯化所述酶的步骤。
25.制备共价连接到固相支持物上含有与图2中残基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的固定化酶的方法，包括以下步骤1)提供含有与图2中残基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的酶，2)提供附着到具有至少一种反应性基团连接子上的固相支持物，和3)将所述酶与所述连接子在生物可接受条件下接触，其中所述的反应性基团与共价附着到所述多肽上的氨基、羧基、羟基或巯基反应以形成共价附着。
26.权利要求25的方法，其中所述的连接子具有至少一种选自如下的基团，包括二醛类、二酸类、二胺类、二异氰酸酯类、氰酸酯类、二亚胺类及碳化二亚胺类，前提条件是二胺不与碳化二亚胺合用。
27.根据权利要求25方法制备的固定化酶。
28.将卤化脂族烃转换为醇或卤代醇的方法，包括以下步骤1)提供含有与图2中残基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的酶，2)提供附着到具有至少一种反应性基团连接子上的固相支持物，3)将所述酶在生物可接受的条件下与所述连接子接触，其中所述的反应性基团与共价附着到所述多肽上的氨基、羧基、羟基或巯基反应以产生共价附着并形成固定化酶，和4)在其中所述酶可将卤化脂族烃转换为醇或卤代醇的条件下将所述的固定化酶与卤化脂族烃接触。
29.权利要求28的方法，其中所述的酶为权利要求2或3的酶。
30.根据权利要求1-3中任一项的酶，其中所述的酶为具有一个或两个末端多肽尾部的融合蛋白。
31.权利要求30的酶，其中所述的融合蛋白具有达30个氨基酸的单一氨基末端尾部，其中含有至少六个连续组氨酸残基的序列。
32.权利要求30的酶，其中所述的融合蛋白具有达150个氨基酸的单个羧基末端尾部。
33.权利要求32的酶，其中所述的羧基末端尾部为亲水性的。
34.权利要求30的酶，其中所述的融合蛋白同时具有达30个氨基酸的氨基末端尾部和达150个氨基酸的羧基末端尾部。
35.权利要求34的酶，其中所述的氨基末端尾部含有具有至少6个连续组氨酸残基的序列。
36.权利要求34的酶，其中所述的羧基末端尾部含有选自如下的多肽EXFLAG多肽、S-Tag多肽、含有六组氨酸序列的多肽及纤维素结合域。
37.具有卤化脂族脱卤素酶活性的酶，其DNA是通过定向进化方法从相关DNA序列中得到的，其中所述的酶具有较相关DNA序列更大的脱卤素活性。
38.根据权利要求37的酶，其中所述的相关DNA序列编码野生型或重组的脱卤素酶。
39.根据权利要求38的酶，其中所述的相关DNA序列编码野生型或重组的卤代链烷脱卤素酶。
40.根据权利要求39的酶，其中所述的相关DNA序列编码野生型或重组的红球菌卤代链烷脱卤素酶。
41.根据权利要求37的酶，其中所述的定向进化方法包括进行易错PCR。
42.根据权利要求37的酶，其中的酶为具有一个或两个末端多肽尾部的融合蛋白。
43.根据权利要求42的酶，其中的一个尾部或两个尾部通过定向进化方法加以修饰。
44.选自ATCC 209609、ATCC 209610和ATCC 209611的表达载体。
45.选自ATCC 202085、ATCC 202086和ATCC 202087的细胞培养物。
全文摘要
本发明涉及能够将卤化的脂族底物分子转换为邻位卤代醇的卤代脂族脱卤素酶、以及编码这些酶多肽的DNA序列、含有此DNA的表达构建体、和通过将该表达构建体置于宿主细胞中从而在足以使这些转化子产生脱卤素酶的条件下制备这类酶的方法。同时分开了将该酶固定于固体支持物上的方法和该固定化酶转化卤化的脂族烃为醇的用途。
文档编号C12P7/16GK1252100SQ98804107
公开日2000年5月3日 申请日期1998年2月13日 优先权日1997年2月13日
发明者J·A·阿夫霍尔特, P·E·斯万森, H·L·坎, R·A·里查德 申请人:唐化学原料公司