、载玻片等。
[0127] 绵羊红细胞（SRBC)、生理盐水、Hank's液（pH7. 2-7. 4)、RPM11640培养液、小牛血 清、青链霉素工〇1^、1%冰醋酸，1111〇〇1/1_，的10^溶液，酸性异丙醇（961111异丙醇加1111 〇1/1 的HCL。溶液4mL)、MTT、PBS缓冲液（Ph7. 2-7. 4)、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、琼脂糖、都氏 试剂、YAC- 1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0. 2mol/l. 的！^8-11(^，缓冲液、1%的即40、印度墨汁、0.1%的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、6161118 &染液 等。
[0128] 1.6实验方法：
[0129] 1.6. 1脏器，体重比值测定：称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平 上称重，计算脏/体比值。
[0130] 1. 6. 2迟发型变态反应【Dill)(足跖增厚法）
[0131] 小鼠腹腔注射2% (v/v)sRBC(0. 2ml/每鼠）致敏后4天，测量左后足妬厚度，然后 在测量部位皮下注射20% (v/v)SRBC(20ul/每鼠），于注射后24h测量左后足跖部厚度，同 一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值（足跖肿胀度）来表示DTH的程度。
[0132] I. 6. 3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法）
[0133] 无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛 网过滤。用Hank's液洗2次，每次离心10分钟（lOOOr/min)。然后将细胞悬浮于lml_， 完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3XIO6个/ml。再将细 胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔lmL，在其中一孔加7. 5uL(30nA液（相当于7. 5yg/ mL)，另一孔作为对照，置5%二氧化碳，37°C培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清 液0.711^，加入不含小牛血清的1?^11640培养液，同时加入1〇'1'(511^/1^)5011117孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入ImL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到 96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的 增殖能力用加corA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
[0134] 1. 6. 4抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）
[0135] 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min)lOmin，将压积SRBC用生理 盐水配成2% (v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.21。将免疫后5天的小鼠处死，取脾，轻 轻磨碎，用Hanks液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗绦、离心2次，最后将细胞悬浮在5ml Hanks液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5X106个/ml。将表层培养基加热溶解后与等 量的PH7,4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0. 5ml，再向管内加入用SA液配制 的10 %SRBCSOul(v/v)、20ul脾细胞悬液（5x106个/mL)，迅速混勾后倾倒于已刷薄层琼 脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育 1.5h，然后用SA液稀释的补体fl: 10)加入到玻片凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空 斑数。
[0136] 1. 6. 5半数溶血值（I~cso)的测定
[0137] 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2% (v/v，用生理盐水配制1压 积RBC0,2mI。进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约lh，将凝固血与管壁剥 离，使血清充分析出，2000rpm离心lOrain，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍，取 lml。置试管内，依次加入10% (v/v，用SA缓冲液配制）压积SRBCO. 5ml-，补体ImL(用SA缓冲液按I: 10稀释）。另设不加血清的对照管f?以SA缓冲液代替）。置37°C恒温水 浴中保温30rain后，冰浴终止反应。2000rpm离心lOmin，取上清lmL，加都氏试剂3ml。同 时取10% (v/v，用SA缓冲液配制）压积SRBCO. 25mi，加都氏试剂至4ml于另一试管中，充 分混匀，放置IOmin后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量 以半数溶血值（HC5tl)表示，按下式计算：
[0138] 半数溶血值（I]C50)=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值X稀释倍数.
[0139] 1.6. 6小鼠碳廓清实验
[0140] 小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每IOg体重注射0.lmL，墨汁注 入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20ul，加入到2ml0. 1%/ 〇Na2C03溶液中，摇匀。以0. 1 %Na2C03溶液作空白对照，用722型分光光度计在600nm波 长处比色测光密度值（0D)。将小鼠处死，取肝、脾，称重，计算吞噬指数a。
[0141] 1. 6. 7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）
[0142] 小鼠腹腔注射20% 6(v/v，用生理盐水配制）的压积鸡红细胞（2000rpm，IOmin) 悬液lmL，间隔30min，颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入 生理盐水2mL，转动鼠板lmin。取腹腔巨噬细胞洗液lmL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的 搪瓷盒内，置37°C孵箱温育30rain。孵毕，于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干，以 甲醇：丙酮（I: 1)固定，4% (vAOGiemsa.磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下 每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
[0143] 吞噬率％ =吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数X100
[0144] 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
[0145] I. 6. 8NK细胞活性的测定（乳酸脱氢酶测定法）
[0146] 受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank's液洗3次，弃上清 将细胞浆弹起，加入〇. 5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0. 5ml2倍Hank's液及 8mlHank's，10000rpm离心lOmin，用ImL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬， 用台酚兰染色计数（活细胞数应在95 %以上），调整细胞浓度为2X107个/mL，此为效应细 胞，取传代后24h生长良好的YAC- 1细胞用RPMl1640完全培养液调整细胞浓度为4X105 个/mL此为靶细胞：取靶细胞和效应细胞各IOOul(效靶比50 : 1)，加入U型96孔培养 板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各l〇〇ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2. 5% Triton各IOOul;上述各项均设三个平行孔，于37°C，5 %二氧化碳培养箱中培养4h，然后将 96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清IOOul置平底96孔培养板中，同时加入 LDH基质液100ul，根据室温反应3-10min，每孔加入lmol/L的HCl30ul，在酶标仪490nm 处测定光密度（〇D)。NK细胞活性=【（反应孔OD-自然释放孔ODV(最大释放孔OD-自 然释放孔0D)】X100%
[0147] 1. 7实验数据统计：用Excel2003、Spssll.0软件进行数据转化和统计分析。用 Spssl1. 0软件分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总 体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方 差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统 计；若变量转换后仍未达到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采 用不要求方差齐性的Tamhane'sT2检验进行两两比较。
[0148] 2 结果
[0149] 2. 1玛卡黑茶颗粒对小鼠体重的影响
[0150] 见表1 _5。经方差齐性检验，各组小鼠实验初、实验中期、实验末体重及实验期间小 鼠体重增长方差齐，采用单因素方差分析，结果显示，各组之间上述指标总体比较无显著性 差异（P> 0? 05)。
【主权项】
1. 一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物及制备方法，其特征在于，所述的组合 物由下述重量份配比的安化黑茶与中药材制成：黑茶占总重量份的85~95% ;由玛卡、灵 芝、冬虫夏草、枸杞子、地黄、黄精、百合、天冬、银耳、甘草等药食同源类物品中的至少3种， 包括多种或全部物品的提取物占有本发明的玛卡黑茶组合物总重量份的5~15%。
2. 根据权利要求1所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物，其特征在于， 所述的安化黑茶由产于湖南省安化县的、属于国家非物质文化遗产名录的、国家地理标志 产品安化黑茶。它包括了安化黑茶所有的产品形态，如茯砖茶、花砖茶、黑砖茶、青砖茶；千 两茶、百两茶、十两茶；天尖茶、生尖茶、贡尖茶。
3. 根据权利要求2所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物，其特征在于， 所述的安化黑茶优选茯砖茶。
4. 根据权利要求1所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物，其特征在于， 所述的中药材的重量份配比是：玛卡168g~278g、灵芝168g~278g、冬虫夏草112g~ 178、枸杞子119g~200g、熟地119g~200g、桃仁97g~156g、山药97g~156g、茯等97g~ 156g、黄精97g~156g、百合56g~112g、天冬97g~156g、银耳97g~156g、甘草30g~ 60g〇
5. 根据权利要求4所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物，其特征在于， 所述的中药材的重量份配比是：玛卡278g、灵芝278g、冬虫夏草178、枸杞子200g、熟地 200g、桃仁156g、山药156g、茯苳156g、黄精156g、百合112g、天冬156g、银耳156g、甘草 60g〇
6. 根据权利要求4所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物及制备方法，其 特征在于，所述的制备方法步骤为： ① 、采摘产自安化云台山茶区的大叶种茶鲜叶，按照黑毛茶的生产工艺制备黑毛茶备 用。 ② 、按配方称取下列中药材：由玛卡、灵芝、冬虫夏草、枸杞子、地黄、黄精、百合、天冬、 银耳、甘草。其中灵芝切片，冬虫夏草粉置于布袋中。 ③ 、提取浓缩：将步骤②中处理好的原料加水浸泡1~1. 5小时后，投入提取罐中，第一 次加8倍量水煎煮2小时，第二次加6倍量水煎煮1. 5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩（温 度为80°C，真空度为0.08Mpa)至相对密度约1.25~1.30(60°C)的稠膏，真空干燥（温度 为70°C，真空度为0. 08Mpa)，粉碎，过80目筛，干燥，备用。 ④ 、分别称取三级黑毛茶、六级黑毛茶，与玛卡、药食同源类提取物混合均匀、拼配一筛 制一风选一茶还一汽蒸一怄堆一称茶一蒸茶一紧压一茶砖退出一发花一干燥一即得玛卡 黑茶之成品玛卡茯砖黑茶。
7. 根据权利要求1、2、3、4、5、6所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物，其 特征在于，所述的玛卡黑茶包括了饮食补充剂、也可以是茶饮料、功能食品、普通食品如咀 嚼片、含片、袋泡茶。更优选的是安化黑茶的各种产品形态。如茯砖茶、花砖茶、黑砖茶、青 砖茶；千两茶、百两茶、十两茶；天尖茶、生尖茶、贡尖茶；薄片茶、沱茶，以及由上述的产品 形态改制成的袋泡茶、巧克力茶等等。
8. 根据权利要求1所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物，其特征在于， 所述的玛卡黑茶改善女性亚健康状态包括了中医学上所指的疲劳/包括性生活幸福指数、 性功能低下、免疫力下降、活力下降、体力下降、月经改变，潮热，盗汗，或血压轻度增高；或 食欲不佳，易疲劳；失眠健忘，头痛头晕；抑郁忧虑，烦躁易怒，多疑善虑；胸闷心悸；体重增 加等症状。记忆力及工作效率下降、情绪不稳等表现，以及外加过度紧张和承受压力，不良 生活方式和习惯，环境污染、心理因素等，这些均属于本发明玛卡黑茶改善女性亚健康的状 态的范畴。
9.根据权利要求1所述的一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物及制备方法，其 特征在于，所述的产品形态还可以是制成药学上可以接受的产品形态如胶囊、口服液、颗粒 剂、片剂、茶剂、茶膏剂或者饮料等。
【专利摘要】一种改善女性亚健康状态的玛卡黑茶组合物及制备方法，由安化黑茶的所有产品形态与玛卡、灵芝、冬虫夏草、枸杞子、地黄、黄精、百合、天冬、银耳、甘草等药食同源类物品组成。对改善女性亚健康状态具有明显的作用。
【IPC分类】A23F3-14
【公开号】CN104719535
【申请号】CN201510140233
【发明人】贺志弘
【申请人】湖南省天下武陵农业发展有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月21日