子。
[0166] 如图1-2所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制活 化的原代人树突细胞的白介素_12p70 (IL12p70)的促炎细胞因子分泌。
[0167] 如图3-4所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制活 化的原代人树突细胞的干扰素-y (IFN纟）的促炎细胞因子分泌。
[0168] 如图5-6所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制活 化的原代人树突细胞的白介素-8 (IL8)的促炎细胞因子分泌。
[0169] 如图7-8所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制活 化的原代人树突细胞的肿瘤坏死因子-a (TNF a )的促炎细胞因子分泌。
[0170] 如图9-10所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制 活化的原代人树突细胞的白介素-6 (IL6)的促炎细胞因子分泌。
[0171] 如图11-12所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制 活化的原代人树突细胞的白介素-10 (IL1P)的促炎细胞因子分泌。
[0172] 实施例4 实施例4涉及在原代人巨噬细胞测定中，广泛水解的酪蛋白水解物及其大于500 Da部 分对促炎细胞因子肿瘤坏死因子-a ( "TNFa "）的抑制。
[0173] 将分离的单核细胞悬浮于补充有10%热灭活的胎牛血清（"FBS"）和青霉素/链 霉素的RPMI培养基中。加入重组人M-CSF，终浓度100 ng/ml，并在37°C和5% C02中将细 胞孵育5天。
[0174] 在第5天，将终浓度0. 007、0. 02、0. 08和0. 2 % m/v的包含广泛水解的酪蛋白及 其大于500 Da部分的水解物样品加入含有M-CSF的RPMI培养基中。
[0175] 在第6天，去除包含水解物样品的培养基并用水解物样品在无M-CSF的培养基中 更新细胞。加入水解物后1小时，加入LPS (大肠杆菌（0111:84)，终浓度10 ng/ml。然后 在37°C和5% C02中将细胞孵育24小时，随后收集上清液并贮存于-20°C，直到按照制造商 说明书，用Meso Scale Discovery TNFa测定法定量测定TNFa 0
[0176] 如图13-14所示，广泛水解的酪蛋白和广泛酪蛋白水解物的大于500 Da部分抑制 活化的原代人巨噬细胞的肿瘤坏死因子-a (TNF a )的促炎细胞因子分泌。
[0177] 实施例5 实施例5涉及在非肥胖糖尿病（N0D)小鼠的回肠中，对促炎细胞因子信使RNA表达的 评价。
[0178] 简而言之，年龄相当的雌性BALB/c小鼠用作健康对照小鼠。自断奶时期开始，如 果没有其它说明的话，将BALB/c小鼠维持在常规饲料上，同时将N0D小鼠维持在常规饲料 或含有广泛水解的酪蛋白（CH)的膳食制剂上。
[0179] 通过RNA分离试剂盒，自回肠样品进行RNA分离。合成cDNA并通过定量实时PCR 评价细胞因子表达。通过运行标准和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH)作为装载对照，计算 RNA的绝对拷贝数（分子/呢）。
[0180] 如图15-18所示，相比年龄相当的健康（BALB/C)对照小鼠，在N0D小鼠回肠中的 IL1、IL6、IL18和IL17的促炎细胞因子分泌升高。这些升高水平在喂食广泛水解的酪蛋白 膳食的N0D小鼠中是下降的。
[0181] 实施例6 实施例6涉及对分离自非肥胖糖尿病（N0D)小鼠的肠引流淋巴结的T细胞的促炎细胞 因子分布的评价。
[0182] 简而言之，年龄相当的雌性BALB/c小鼠用作健康对照小鼠。自断奶时期开始，如 果没有其它说明的话，将BALB/c小鼠维持在常规饲料上，同时将N0D小鼠维持在常规饲料 或含有广泛水解的酪蛋白（CH)的膳食制剂上。
[0183]在完全培养基（DMEM，含有 10% (vol./vol.) FBS、L-谷氨酰胺 2 mmol/l、100 U/ ml青霉素+链霉素）中，将各组小鼠的分离的肠系膜淋巴结细胞，用板结合的抗CD3刺激。 48小时后收集上清液部分，用于按照制造商说明书用多元细胞因子珠阵列进行细胞因子分 析。
[0184] 如图19-21所示，相比年龄相当的健康（BALB/C)对照小鼠，N0D小鼠的肠引流淋 巴结T细胞的促炎细胞因子IFNy、IL4和IL17的分泌升高。这些升高的水平在喂食广泛 水解的酪蛋白膳食的NOD小鼠中是下降的。
[0185] 实施例7 实施例7涉及在鼠巨噬细胞细胞系中的细胞因子分泌分析。
[0186] 将J774A. 1鼠巨噬细胞细胞系维持在RPMI-1640上，其中补充有10%(v/v)胎牛 血清、50 IU/ml青霉素和0. 5mg/ml链霉素。将细胞在37°C在5%0)2中孵育。
[0187] 将包含广泛水解的酪蛋白及其大于500Da部分的酪蛋白水解物样品加入到无菌 水中，浓度为l〇〇mg/ml，然后通过0.2Wii尼龙滤器除菌过滤。作为额外对照，也测试未经除 菌过滤的广泛水解的酪蛋白。一式三份地，将细胞以lxlO6细胞/ml接种平板并用终浓度1 mg/ml水解物孵育1小时。然后将细胞用100ng/mlLPS处理或未经处理24小时，然后通过 离心收集上清液并贮存于-20°C。
[0188] 按照制造商说明书，使用对于IL-lf3、IL_6、IL12p40和TNF-a的各自的ELISA测 定法，对于评价上清液的各细胞因子浓度。一式三份地测试样品并在graphpad prism 6软 件上使用常规单侧AN0VA分析计算显著性差异。p〈0. 05被认为是显著的。
[0189] 如图22-25所示，在细胞孵育前有或无除菌过滤的广泛水解的酪蛋白导致用LPS 刺激的小鼠巨噬细胞的IL-12p40和IL-1的促炎细胞因子分泌下降（*p〈0.05)。广泛水 解的酪蛋白导致促炎细胞因子IL6的分泌显著下降（*p〈0.05)。广泛酪蛋白水解物的大于 500 Da部分导致促炎细胞因子TNF a的分泌的显著下降（*p〈0.05)。结果也以表格形式示 于图26。
[0190] 制剂实施例 表3提供包含表中的8种肽的肽组分的实施例实施方案。
[0191] 表3.实施例肽组分
表4提供包含表1的某些肽的肽组分的实施例实施方案。
[0192] 表4.实施例肽组分
表5提供本公开内容的营养组合物的实施例实施方案，并描述了每100 kcal份中包括 的各成分的量。
[0193]表5.实施例营养组合物的营养分布
本说明书引用的所有参考文献，包括而不限于所有的论文、出版物、专利、专利申请、简 报、教科书、报告、底稿、小册子、书籍、互联网文章、杂志文章、期刊等，通过引用以其整体结 合到本说明书中。本文的参考文献的阐述仅仅意在概括其作者所做出的断言，并非承认任 何参考文献构成先有技术。申请人保留对所引用的参考文献的准确性和相关性提出异议的 权利。
[0194] 虽然使用特定术语、装置和方法已描述了本公开内容的实施方案，但是这类描述 只用于说明目的。所用词汇是描述词汇而不是限制词汇。要了解，在不偏离随附权利要求书 中阐述的本公开内容的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可进行变动和改变。另 外，应了解，不同实施方案的方面可全部或部分互换。例如，在举例说明依据那些方法制备 的市售无菌液体营养补充剂的生产方法的同时，考虑了其它的用途。因此，随附权利要求书 的精神和范围不应限于其中所含形式的描述。
【主权项】
1. 营养组合物，其包含： (i) 碳水化合物源； (ii) 脂肪源；和 (iii) 蛋白等价物源； 其中 20%至80%的蛋白等价物源包含含有以下的肽组分：SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 60 和 SEQ ID NO 63 ;和 20%至80%的蛋白等价物源包含完整蛋白、部分水解蛋白、或其组合。2. 权利要求1的营养组合物，其中所述肽组分的量为约0. 2 g/100 kcal至约5. 6 g/100 kcal〇3. 权利要求1的营养组合物，其中所述肽组分进一步包含选自表1的至少10种另外的 肽。4. 权利要求1的营养组合物，其中所述蛋白等价物源包含水解度小于40%的部分水解 蛋白。5. 权利要求1的营养组合物，进一步包含至少一种长链多不饱和脂肪酸。6. 权利要求5的营养组合物，其中所述至少一种长链多不饱和脂肪酸选自二十二碳六 烯酸和花生四烯酸。7. 权利要求1的营养组合物，进一步包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期晚期 的培养上清液，用于治疗或预防病原体感染。8. 权利要求1的营养组合物，进一步包含益生菌。9. 权利要求1的营养组合物，进一步包含益生元。10. 权利要求1的营养组合物，其中当给予受试者时，所述营养组合物减少选自以下的 促炎细胞因子的产生：IL_12、IL17、IL-5、IL-4、IFN-y、IL-8、TNF-a、IL-6 和 IL-1。11. 营养组合物，包含： (i) 碳水化合物源； (ii) 脂肪源；和 (iii) 蛋白等价物源； 其中 20%至80%的蛋白等价物源包含含有选自表1的至少5种肽和选自表2的至少3种另 外的肽的肽组分；和 20%至80%的蛋白等价物源包含完整蛋白、部分水解蛋白、或其组合。12. 权利要求11的营养组合物，包含选自表1的至少10种另外的肽。13. 权利要求11的营养组合物，其中所述蛋白等价物源包含摩尔质量分布大于500道 尔顿的酪蛋白水解物。14. 权利要求11的营养组合物，其中所述蛋白等价物源包含水解度小于40%的部分水 解蛋白。15. 权利要求11的营养组合物，进一步包含益生元。16. 权利要求11的营养组合物，进一步包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期晚 期的培养上清液，用于治疗或预防病原体感染。17. 在受试者中减少炎性反应的方法，包括给所述受试者提供包含以下的营养组合 物： 碳水化合物源， 脂肪源，和 蛋白等价物源， 其中20%至80%的蛋白等价物源包含含有以下的肽组分：SEQIDNO4、SEQIDNO13、SEQIDNO17、SEQIDNO21、SEQIDNO24、SEQIDNO30、SEQIDNO31、SEQIDNO32、 SEQIDNO51、SEQIDNO57、SEQIDNO60 和SEQIDNO63,和其中 20% 至 80% 的蛋白等 价物源包含完整蛋白、部分水解蛋白或其组合。18. 权利要求17的方法，其中所述肽组分进一步包含选自表1的至少10种另外的肽。19. 权利要求17的方法，其中所述蛋白等价物源包含水解度小于40%的部分水解蛋白。20. 权利要求17的方法，其中所述营养组合物减少选自以下的促炎细胞因子的产生： IL-12、IL17、IL-5、IL-4、IFN-丫、IL-8、TNF-a、IL-6 和IL-1。
【专利摘要】本公开内容涉及包含蛋白等价物源的营养组合物，其中20%至80%的蛋白等价物源包含含有以下的肽组分：SEQ？ID？NO？4、SEQ？ID？NO？13、SEQ？ID？NO？17、SEQ？ID？NO？21、SEQ？ID？NO？24、SEQ？ID？NO？30、SEQ？ID？NO？31、SEQ？ID？NO？32、SEQ？ID？NO？51、SEQ？ID？NO？57、SEQ？ID？NO？60和SEQ？ID？NO？63，和20%至80%的蛋白等价物源包含完整蛋白、部分水解蛋白、或其组合。本公开内容进一步涉及通过将所述营养组合物提供给目标受试者而减少炎性反应和/或促炎细胞因子即白介素-17的产生的方法。
【IPC分类】A23L1/305, A61K38/01, A61K38/08, A61K38/07
【公开号】CN105072928
【申请号】CN201480015753
【发明人】D.洪曼, E.A.F.范托尔, G.格罗斯, M.H.舍马克, T.T.兰伯斯
【申请人】Mjn 美国控股有限责任公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月11日
【公告号】CA2905799A1, US8889633, US20140271553, US20150093463, WO2014150558A1