elbrueckii subsp. bulgaricus :Lb.) 300 菌株、Lb. 305 菌株、Lb. 401 菌株、Lb. 421 菌株、Lb. 492 菌株、 Lb. 495 菌株、Lb. 496 菌株、Lb. 499 菌株、Lb. 505 菌株、Lb. 511 菌株、Lb. 601 菌株、Lb. 863 菌株、Lb. 883菌株、Lb. 885菌株。
[0065] 从上述分离菌株中筛选下述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为筛选菌株，所述德 氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在将上述分离菌株的种菌1. 〇%与上述嗜热链球菌的筛选菌株 1. 0%共同接种至豆浆中，于37~45°C培养12~24小时时，能够在发酵物中蓄积0. 4g/L以 上的D-乳酸。具体而言，将德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lb.) 492菌株、Lb. 505菌株、Lb. 511 菌株、Lb. 601菌株作为筛选菌株。
[0066]另外，将NIZO food research持有的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus) St. 2333菌株和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus)Lb. 185接种至无调整豆衆 (Kikkoman Soyfoods Company制）中，进行传代培养。将豆衆发酵物以1 % (v/v)的比率 反复接种至豆浆中，于37~45°C培养12~24小时。实施约700代的传代培养，将从所得 豆浆发酵物中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为K1581株。
[0067] 进而，将同样由NIZO food research持有的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)St. 131 和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) Lb. 194接种至无调整豆衆（Kikkoman Soyfoods Company制）中，进行传代培 养。将豆浆发酵物以1% (v/V)的比率反复接种至豆浆中，于37~45°C培养12~24小时。 实施约700代的传代培养，将从所得豆浆发酵物中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作 为K1585菌株。同样地，将从St. 131和Lb. 185的传代培养中得到的德氏乳杆菌保加利亚 亚种菌株作为K1583菌株。
[0068] 3.豆浆发酵物中的D-乳酸量的比较
[0069] (1)供试菌株
[0070] 使用从市售混合发酵剂中分离的乳酸菌及筛选?育种的乳酸菌（参见上述2)使 豆浆发酵，测定?比较所得豆浆发酵物中的D-乳酸量。
[0071] (2)发酵条件及测定方法
[0072] 发酵原料使用成分无调整豆衆（Kikkoman Soyfoods Company制）。向该发酵原料 中添加构成包含嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的乳酸菌混合发酵剂的 物质，于42°C发酵24小时。发酵结束后，利用酶电极法（王子计测机器株式会社制，生物传 感器BF-5)测定所得豆浆发酵物中的D-乳酸量。
[0073] (3)结果
[0074]图1是表示测定由各种嗜热链球菌菌株和作为育种菌株的德氏乳杆菌保加利亚 亚种K1581菌株构成乳酸菌混合发酵剂并进行发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的 结果的图。
[0075] 图2是表示测定代替德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株而使用同样为育种菌株 的德氏乳杆菌保加利亚亚种K1585菌株作为乳酸菌混合发酵剂、并在同样的条件下将豆浆 进行发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的结果的图。
[0076] 如图1及图2所示，确认到即使为相同的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，D-乳酸 生成量也根据组合的嗜热链球菌菌株的不同而不同，因此，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株 的代谢能力也会因嗜热链球菌菌株的特征而变化。特别地，以果糖的生成量为0. 4g/L以上 为指标筛选的菌株中，存在D-乳酸生成量显著升高的倾向。
[0077] 图3是表示测定将由作为育种菌株的嗜热链球菌K1580菌株和从市售发酵剂中分 离的各德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株构成的乳酸菌混合发酵剂接种至豆浆中、并在同样的 条件下进行发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的结果的图。
[0078] 如图3所示，确认到即使在使用育种的嗜热链球菌K1580菌株时，D-乳酸量的生 成也根据德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的不同而存在较大差异。
[0079] 如图1、图2、图3、图4所示，对于嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株 而言，在通过直接使用市售的乳酸菌混合发酵剂的发酵得到的豆浆发酵物中，均几乎不生 成D-乳酸，与此相对，通过将嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株两者置换为 筛选或育种的菌株，可以得到含有〇. 4g/L以上的D-乳酸的豆浆发酵物。特别地，使用由本 发明中育种的乳酸菌（嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株）构 成的乳酸菌混合发酵剂时，可以得到D-乳酸量更多的豆浆发酵物（参见图1)。
[0080] 根据以上结果，可见嗜热链球菌所具备的特征使得由共同发酵的德氏乳杆菌保加 利亚亚种带来的D-乳酸生成量有较大变化，另外，确认到德氏乳杆菌保加利亚亚种也由于 菌株的不同而使得在豆浆中的D-乳酸生成量大为不同。
[0081] 4.无调整豆浆膜透过液中的利用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株发酵后的D-乳酸 量的比较
[0082] (1)如上所述，发现了根据嗜热链球菌菌株的特征，由德氏乳杆菌保加利亚亚种菌 株带来的D-乳酸生成量大大改变。于是，为了确认筛选?育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种 菌株和从市售发酵剂分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在豆浆膜透过液中的代谢能力 的区别，比较了在预先补充了果糖的豆浆膜透过液中的D-乳酸生成量。豆浆膜透过液是从 豆浆中除去了高分子的不溶性蛋白质、脂质而得的液体，可以认为豆浆中的游离氨基酸、可 溶性肽、糖分、矿物质等没有大的区别。
[0083] (2)无调整豆浆膜透过液的制作
[0084] 使用空心丝状超滤组件（型式：USP_143(旭化成公司制））并通过真空栗抽吸 (_60kPa)市售的无调整豆衆（Kikkoman Soyfoods Company制），将透过了膜的液体作为成 分无调整的豆浆膜透过液。向该液体中无菌地添加果糖，使得最终浓度为1.0% (v/V)(无 调整豆浆膜透过液）。进而，向该豆浆膜透过液中添加盐酸，制作调节为pH5. 0的酸性豆浆 膜透过液。
[0085] (3)豆浆膜透过液中的培养后的D-乳酸生成量的测定
[0086] 在MRS培养基中分别培养下述菌株：从市售的酸奶制造用粉末混合发酵剂 (Danisco Co.，Ltd.制：含有嗜热链球菌菌株及保加利亚乳杆菌菌株的冷冻干燥品）中分 离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株、3株育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株（K1581菌 株、1(1583菌株、1(1585菌株）、野生菌株仏了〇：11842菌株）。将所得菌液用0.85%灭菌盐 水离心?清洗2次，将得到的沉淀（pellet)悬浮在无调整豆浆膜透过液中，制成发酵剂菌 液。
[0087] 分别在无调整豆浆膜透过液、酸性（pH 5. 0)豆浆膜透过液中接种1. 0%的经洗菌 后的菌液，于42°C培养（单独培养德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株）24小时，测定培养后的菌 液的D-乳酸量（图5及图6)。
[0088] 在无调整豆浆膜透过液中，与市售发酵剂、ATCC11842菌株相比，由本发明中育种 的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株带来的D-乳酸产生量显示出了显著高的数值。同样地，与 无调整豆浆膜透过液相比，在酸性豆浆膜透过液中，可见市售发酵剂和育种的菌株在D-乳 酸生成量上有显著区别。确认到利用市售发酵剂分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在特 别低的PH条件下（pH5. 0)D-乳酸的生成量低，与此相对，育种的菌株在相同条件下产生了 约3倍以上的D-乳酸。可以认为在与嗜热链球菌菌株在豆浆中的共发酵中，先由嗜热链球 菌菌株的生长使得pH降低，之后德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株生长。就市售的德氏乳杆菌 保加利亚亚种菌株而言，确认到在上述那样的环境中，不存在D-乳酸的生成超过0. 4 (g/L) 的菌株，在豆浆环境中生长?代谢果然受到了限制。结合上述结果，关于育种的菌株，推测 即使在低pH、并且为豆浆的条件下，与市售菌株、ATCC11842菌株相比，代谢也非常旺盛地 进行，结果可以认为能够制作具有类似酸奶的良好的酸味、风味的豆浆发酵物。
[0089] 需要说明的是，虽然来自市售发酵剂的分离菌株中也含有Lb. 505菌株、Lb. 511菌 株等在图3中作为筛选菌株生成了 0. 4g/L以上的D-乳酸的菌株，在图5、图6中也显示出 了比其它来自市售发酵剂的菌株高的D-乳酸生成，但并未达到0.4g/L的生成量。可以认为 这是因为图5、图6所示的试验中不存在嗜热链球菌。可以认为虽然向无调整豆浆膜透过液 中补充了果糖，但在使德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢活跃从而提高D-乳酸的生成量时， 嗜热链球菌并不仅仅单纯地供给果糖，还承担着其它作用。
[0090] 5.单独使用嗜热链球菌进行发酵而得到的豆浆发酵液中的果糖残糖量的测定
[0091]从市售的乳酸菌混合发酵剂（Danisco Co. ,Ltd?制）Y0-MIX300、305、496、499、 501、885中仅分尚嗜热链球菌菌株（St. 300菌株、St. 305菌株、St. 496菌株、St. 499菌株、 St. 501菌株、St. 885菌株）。将分离的各菌株在IOmL的LM17培养基中培养后，将培养液 用0. 9% NaCl溶液离心?清洗，再次悬浮在IOmL的0. 9% NaCl溶液中。豆浆发酵原液使 用市售的无调整豆衆（Kikkoman Soyfoods Company制）。将该豆衆发酵原液以1.0% (v/ v)的量接种在上文中制备的悬浮液中，于42°C发酵24小时。发酵后，回收离心上清液，利 用F Kit D-葡萄糖/果糖（JK INTERNATIONAL Co.，Ltd.制）测定果糖的残糖量。结果示 于图7。
[0092] 如图7所示，嗜热链球菌菌株中，存在St. 496菌株、St. 499菌株、St. 885菌株这样 在豆浆发酵物中蓄积0. 4g/L以上的果糖的菌株、和在豆浆发酵物中不蓄积果糖的菌株。
[0093] 6.由乳酸菌发酵剂的组合带来的对D-乳酸量的生成的影响
[0094] 将具有蓄积果糖的特征的嗜热链球菌（St. 499菌株）和不蓄积果糖的菌株 (St. 305菌株）与从