专利名称：硒化多糖化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及海洋多糖新型分子结构的硒化多糖及其制备方法，以及其在医药方面的应用，即海洋多糖和无机硒结合，发挥彼此协同的预防和治疗肿瘤及提高机体免疫力的作用，其属于海洋生物技术和海洋药物技术领域。
自1957年Schwarz，k.等发现缺乏维生素E的饮食中添加微量硒可以防止营养性肝坏死以来，有许多出色的工作揭示了硒在人类防癌抗癌，抗老化，预防和治疗心血管疾病，克山病和大骨节病以及家畜白肌病等方面的重要作用。对硒作为生命必需微量元素的认识正日益深入。同时硒又是一个极毒元素，动物对硒的营养需要范围是0.1～0.3ppm，2～10ppm将引起慢性中毒，而超过10ppm时会引起急性中毒以致突然死亡。但人类社会趋势的当今是食物链中硒含量在减少，动物和人体缺硒病增加，缺硒情况正在加剧。显然，寻求低毒而生物利用度好的硒化物对于进一步揭示硒的生化行为及其在人类保健事业上的应用是十分有意义的。国外未见有硒多糖的报导，国内有两篇硒多糖制备方面的专利。第一篇专利公告号为CN1038454A，发明名称硒化卡拉胶的制法。该方法是硒粉以浓硝酸溶解后，用无离子水制备成浓度为0.5-1.0mg Se/ml的硒液，而后按0.5-1.0mg Se/m硒液加0.5-5％的卡拉胶的比例(即1∶0.1-50重量比)加入Kappa-角叉菜胶或Lambda-角叉菜胶溶胶液，硒化反应后，经乙醇沉析，乙醇洗涤后得到硒化角叉菜胶粗品。该方法制备的硒化卡拉胶，其硒含量最高为2512ppm。该硒化产物分子结构仍然是保持硫酸多糖酯的基本构型，其中硒是以两个不同价态存在的。即角叉菜胶中部分硫酸根为硒取代形成硒酸酯；而末端单元的3，6-内醚-D-半乳糖在C1开环形成C-Se-H结构。该方法制备的硒化卡拉胶，其硒含量较低。该制备方法中使用硒粉与浓硝酸反应，其中硒粉和反应生成的硒化氢等副产物都是剧毒化合物，以致使该剧毒副产物即使是微量也可造成人员的生命危险；此外，该硒化产物产品中的硒是+6价的，其生物利用度低，卡拉胶多糖本身无抗肿瘤作用。制备的硒化卡拉胶不仅抗肿瘤活性不强，而且该硒化卡拉胶虽然毒性较低，但仍然是有毒性的。该硒化卡拉胶的分子量太大，不易被人体机体吸收利用。然而几乎所有的药理实验都是用亚硒酸钠进行的，这其中硒是+4价的，并证实其具有显著的防癌抗癌，抗老化，预防和治疗心血管疾病，克山病和大骨节病以及家畜白肌病等方面的作用，Combs等发现亚硒酸钠的生物利用度也显著高于硒酸钠。该方法制备的硒化卡拉胶对小鼠的LD50为2.92g/kg，亚硒酸钠的LD50为12.7mg/kg，显然该硒化卡拉胶还具有相当的毒性。第二篇专利公开号为CN1069495，发明名称硒多糖及其制造方法。该方法是“富硒酵母→提取→分离→加碱匀浆→中和→浓缩→加乙醇沉淀→精制→成品。提取在反应锅中进行，分离在离心机中进行，加碱匀浆在匀浆机中进行，中和时pH值为8-10，然后静止分离所得的清液减压浓缩，加乙醇沉淀后烘干得粗制品，进一步精制得精制品。”该方法制备的每克硒多糖的硒含量为400微克/克以上。该文献中没有对硒多糖的分子结构的分析。
本发明的目的是要提供海洋新药产品-硒化多糖化合物及其制备方法，以及其在医药方面的应用，即海洋多糖和无机硒结合，发挥彼此协同的预防和治疗肿瘤及提高机体免疫力的作用，将两者优势互补，起协同作用，同时该硒化多糖化合物要成为低毒甚至无毒药物。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种硒化多糖化合物。该化合物包括其本身及其盐，加成盐或药用盐，该化合物的单元分子通式为 其中x1，x3为亚硒酸根及其盐，C1-C4烷基，或羟基；x2为亚硒酸根及其盐，或亚硒酰胺基，或羟基；x4为C1-C4羟烷基；x5为亚硒酸根及其盐；n为自然数。
本硒化多糖化合物，所设计的 其可以是2位硒化褐藻多糖和3位硒化褐藻多糖，即 化合物；该化合物的物化性质如下(1)外观灰白色或浅黄色粉末；(2)溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；
(3)粘度该化合物1％水溶液在25℃时的特性粘度为1-100；(4)pH值该化合物1％水溶液在25℃时的pH值为6.8-7.0；(5)平均分子量3000-30000道尔顿；(6)平均含硒量10-125mg/g；(7)稳定性该化合物及其盐、加成盐或药用盐常温存放一年后，含硒量不变；(8)旋光度-30--80度；(9)光谱①紫外光谱在波长255nm附近处有弱特征吸收峰②红外光谱在波长1255-1260cm-1或820cm-1处有中强度的伸缩振动特征吸收峰；③氢谱在化学位移3.906ppm和3.929ppm两处有特征吸收峰；④碳谱在化学位移75ppm和76ppm两处有特征吸收峰。
本硒化多糖化合物，所设计的 其可以是硒化壳聚糖，即 化合物；该化合物的物化性质如下(1)外观灰褐色粉末；(2)溶解性微溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；(3)粘度该化合物1％水溶液在25℃时的特性粘度为30-500；(4)pH值该化合物1％水溶液在25℃时的pH值为6.6-7.0；(5)平均分子量100-20000道尔顿；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)稳定性该化合物及其盐、加成盐或药用盐常温存放一年后，含硒量不变；(8)旋光度-5--30度；(9)光谱①紫外光谱在波长281nm附近处有明显的特征吸收峰；②红外光谱在波长1538.39cm-1和1091.05cm-1处有很宽的伸缩振动特征吸收峰；③氢谱在化学位移3.830ppm处有一个多重特征吸收峰；④碳谱在化学位移76.090ppm和58.710ppm两处有两个特征吸收峰。
本硒化多糖化合物，所设计的 化合物；该化合物的物化性质如下(1)外观灰白色，或浅褐色粉末；(2)溶解性易溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；(3)粘度该化合物1％水溶液在25℃时的特性粘度为10-200；(4)pH值该化合物1％水溶液在25℃时的pH值为6.7-7.0；(5)平均分子量100-20000道尔顿；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)稳定性该化合物及其盐、加成盐或药用盐常温存放一年后，含硒量不变；(8)旋光度+30-+90度；(9)光谱①紫外光谱在波长281nm附近处有明显的特征吸收峰；②红外光谱在波长1263.54cm-1处有明显的特征吸收峰，并在704.11cm1和771.62cm-1处有两个特征吸收峰；③氢谱在化学位移4.834ppm和4.794ppm处有两个特征吸收峰；④碳谱在化学位移73.002ppm和72.546ppm处有两个特征吸收峰。
本硒化多糖化合物的制备方法，所述的硒化多糖化合物是由下列步骤制成的(1)硒化反应将多糖类化合物与亚硒酸及其盐在酸性溶液中经钡离子、氢离子的催化作用下，并加热10-100℃，恒温反应5-10小时，该反应是在吡喃己糖单元的C2或C3或/和C5位上的取代反应，或在3，6-内醚-D-半乳糖单元的C3和C6位上的加成反应，而生成硒化多糖化合物；该反应式如下多糖类化合物+亚硒酸根 硒化多糖化合物，反应完毕，降温反应液至室温；(2)除去催化剂将降温的反应液逐步滴加0.1-1N的硫酸溶液，使反应液中的Ba2+离子成为硫酸钡沉淀；(3)除去未反应的亚硒酸根离子将(2)中的带有硫酸钡沉淀的反应液抽滤，取滤液，再加入氯化铁溶液，之后用NH3-NH4HCl溶液调节pH值3-12，搅拌促反应，再放置过夜，之后用离心机分离，取滤液；(4)乙醇分级沉淀将(3)中的滤液用15％的醋酸钠溶液调节pH值3-9，再用乙醇溶液分级沉淀，并分别抽滤，得分子量分级的粗产品-硒化多糖；(5)烘干将(4)中的分级的粗产品-硒化多糖，分别烘干，并在真空度大于0.09Pa的条件下，烘干温度30-60℃下，进行，可得烘干的分级的粗产品-硒化多糖，该粗产品的硒含量为20-100mg.Se/g硒化多糖；(6)精制将(5)中的该粗产品采用超滤仪按需要精制成各级分子量的硒化多糖精品。
本硒化多糖化合物的制备方法，所述的(1)中的多糖类化合物，其是褐藻多糖，或壳聚糖，或红藻多糖，或其它海藻多糖；所述的(1)中的亚硒酸及其盐，其与多糖类化合物的投料重量比为1∶0.1-10；所述的(1)中的硝酸溶液，其浓度范围是0.5-5％(w/v)。
本硒化多糖化合物的制备方法，所述的(1)中的钡离子，其可以是氯化钡，也可以是碳酸钡，也可以是硝酸钡，还可以是可溶性钡盐；其中钡离子的投料重量比为0.1-10.0。
本硒化多糖化合物的制备方法，所述的(3)中的氯化铁溶液，其溶液浓度为10-30％，以除去未反应的亚硒酸根离子为准。
本硒化多糖化合物的制备方法，所述的(4)中的乙醇溶液分级沉淀并分别抽滤所得的不同分级分子量的粗产品-硒化多糖，其中乙醇在整个溶液的终点浓度沉淀的硒化多糖的分子量的对应关系如下，(1)乙醇在整个溶液的终点浓度85-95％，对应沉淀的硒化多糖的分子量为100-3500道尔顿；(2)乙醇在整个溶液的终点浓度70-85％，对应沉淀的硒化多糖的分子量为3500-8000道尔顿；(3)乙醇在整个溶液的终点浓度30-70％，对应沉淀的硒化多糖的分子量为8000以上道尔顿。
本硒化多糖化合物的制备方法，所述的(6)中的采用超滤仪按需要精制成各级分子量的硒化多糖精品，其各级分子量的硒化多糖精品对应的硒含量如下(1)分子量为100-3500道尔顿的硒化多糖精品的硒含量为50-100mg·Se/g；(2)分子量为3500-8000道尔顿的硒化多糖精品的硒含量为40-80mg·Se/g；(3)分子量为8000以上道尔顿的硒化多糖精品的硒含量为20-60mg·Se/g。
本发明的硒化多糖化合物及其制备方法，其优点之一在于在催化剂钡离子和氯离子、硝酸根的作用下，将亚硒酸与在吡喃己糖单元的C2或C3或/和C5位上的硫酸根发生取代反应，或亚硒酸根将在3，6-内醚-D-半乳糖单元的醚键打开而连接在该单元的C3位，而在D-半乳糖单元的醚键打开的C6位上加成亚硒酸根的加成反应，而生成本专利的硒化多糖化合物。本专利的硒化多糖化合物是一种新的化合物，通过对本专利的硒化多糖化合物的光谱分析，可以证实硒化多糖化合物真实存在。本专利的硒化多糖化合物的物化性质既有共性，又有个性。本硒化多糖化合物的分子结构的构型、光谱分析、物化性质等在国内外还未见报导。
本发明的硒化多糖化合物及其制备方法，其优点之二在于利用本发明的硒化多糖化合物的制备方法技术，制备的硒化多糖化合物，其最高硒含量可达125mgSe/g。然而，目前有文献报道硒化多糖的最高硒含量为16mgSe/g。本发明制备的硒化多糖化合物的技术与其它的方法相比，避免了硒粉和硝酸反应这一有剧毒物产生的操作，而以亚硒酸这一稳定性的化合物作为硒化剂，用氯化钡和硝酸作为催化剂，操作对人体无害，产品得率和质量均比其它的方法高。在分子结构中引入亚硒酸根，其中硒是正四价，硒是处于中间价态，既可以被氧化也可以被还原，因此本发明的硒化多糖化合物在人体内具有广泛的生理功能。
本发明的硒化多糖化合物及其制备方法，其优点之三在于本发明的硒化多糖化合物及其制备方法，制备的硒化多糖化合物是测不出LD50，MTD＞16g/kg，属于无毒物质。有文献报道，同类硒化多糖的LD50为2.92g/kg，因此是有毒物质。本发明的硒化多糖化合物及其制备方法所制备的硒化多糖化合物，其抑瘤率为67.77％和70.17％。而文献报道，目前硒化物的最高抑瘤率为40.12％。
本发明的硒化多糖化合物毒性试验，药理实验，临床应用的效果如下一、硒化褐藻多糖的极性毒性试验摘要对小鼠以能允许的最大浓度10％的硒化褐藻多糖混悬液0.4ml/10gig，测不出LD50，故根据新药审批办法中对急性毒性的要求，进行了最大耐受量(MTD)的测定。当给予小鼠硒化褐藻多糖16g/kg.24h，对小鼠未见明显毒性反应，表明其MTD＞16g/kg。
1)材料，受试药物硒化褐藻多糖，本实验室制备，纯度大于95％，含硒量为50.3mg/g，用时用水配成0.1g/ml(即浓度为10％)的浓药液。试验动物昆明种健康小鼠，由山东医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为鲁动质字980102。
2)试验方法与结果预试验选取18-20g小鼠，给予10％的硒化褐藻多糖混悬液0.4ml/10gig，观察24h，10只小鼠均无中毒死亡，故本品难以求测LD50，其本品10％浓度其粘稠度已很大，已达最大允许浓度。故根据新药审批办法中关于急性毒性的要求，进行了最大耐受量(MTD)的测定，选18-22g小鼠40只，♂♀各20只，随机分为2组，每组♂♀各10只，禁食8h，分别给予10％的硒化褐藻多糖悬液0.4ml/10gig，对照组给予水0.4ml/10gig，24h内给4次，结果除给药组有8只小鼠出现稀便外，用药组小鼠与对照组比较其进食、活动、粪便、毛泽等均未见明显差异，观察7天，40只小鼠无一死亡，于第7日再次称体重，药前药后两组小鼠体重如下表。
表1 药物对小鼠体重的影响组别鼠数(只) 药前(X±S)g药后(X±S)g对照组20 18.69±0.4721.00±1.36试验组20 18.71±0.4521.63±1.47从表1可知两组小鼠体重药前药后比较无明显差异，P＞0.05。
3)结果对小鼠以能允许的最大浓度灌胃给药，测不出LD50，故根据卫生部新药审批办法中急性毒性的实验要求，进行了最大耐受量(MTD)的测定，当小鼠给予硒化褐藻多糖达16g/kg·24h时，对小鼠无明显毒性反应，表明其MTD＞16g/kg，根据毒性物质的分级标准，本品应属无毒物质。
二、硒化褐藻多糖抗肿瘤作用的实验研究摘要对小鼠S180肉瘤按4.0/kg、3.0g/kg和2.0g/kg的剂量连续灌胃给药9天，各剂量组小鼠均表现出明显的抑瘤作用，其中以中剂量组(3.0g/kg)为最佳，其抑瘤率达67.77％，与阳性对照药物FT-207的抑瘤率(70.37％)接近，低剂量组抑瘤率为40.77％，高剂量组为31.48％。
1)材料受试药物硒化褐藻多糖为灰白色粉末(纯度大于95％，含硒量为50.3mg/g)，有本实验室提供，用时根据用药剂量的需要分别配成浓度为0.0667g/ml(4.0g/kg)，0.05g/ml(3.0g/kg和0.0334g/ml(2.0g/kg)的混悬液备用。阳性对照药物替加氟片(FT-207)，为济南制药厂产品，生产文号为鲁卫药准字(1995)第024020，产品批号为980605。
试验动物昆明种健康小鼠，由山东医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为鲁动质字980102。
2)方法与结果选19-21g小鼠，左腋下接种S180腹水小鼠腹水稀释液，S180腹水瘤种鼠由山东省医科院药物研究所引进，在无菌条件下抽出腹水，用无菌生理盐水稀释3倍，每鼠接种0.1ml。于接种18h后将小鼠随机分为5组，试验组每组♂♀各6只，共12只，对照组根据n=12×(试验组数)1/2=12×41/2=24，分别给硒化褐藻多糖4.0g/kg、3.0g/kg、2.0g/kg·日ig，阳性对照组给予FT-207 150mg/kgig，阴性对照组给予生理盐水0.6ml/10gig，给药组和阴性对照组为每日分两次给药，分别于8Am、6Pm、阳性对照组为8Am给药一次。连续给药9天，禁食12h，于末次给药24h后称体重后，剖杀各组小鼠，剥离瘤体，于电子天平下称瘤体，分别称体重、瘤重，计算抑瘤率和瘤体系数(瘤体/体重×100％)，结果见下表2表2 硒化卡拉胶抗S180的抑瘤实验结果组别鼠数 体重 瘤重 抑瘤率 瘤体系数(％)(只)(X±S) (X±S) (％) (瘤重/100g体重)N S组2422.98±3.091.085±0.380 4.89±1.832g/kg1222.16±1.640.64±0.482***40.77 2.95±2.05***3g/kg1222.77±2.590.352±0.1*** 67.77 2.53±1.50***4g/kg1222.83±2.390.742±0.288*** 31.48 3.13±1.15***FT-207 1217.08±1.20*** 0.318±0.150*** 70.37 2.06±0.79***与阴性组比***P＜0.001，NS对照组最大瘤重2.392g，试验组最大为1.706g3)讨论对硒化褐藻多糖以4.0/kg、3.0g/kg和2.0g/kg的剂量灌胃给药，进行小鼠抗S180的抑瘤试验，结果表明三剂量组小鼠均具有明显的抑瘤作用，其中以中剂量组3.0g/kg抑瘤效果最佳，其抑瘤率达67.77％，与FT-207的抑瘤作用(70.37％)接近，低剂量组(2.0g/kg)抑瘤作用次之，为40.77％，高剂量组(4.0/kg)抑瘤作用最低，为31.48％，这可能与药物在高浓度下粘度较大，影响吸收，使生物利用度降低有关。
本试验仅对S180进行抑瘤试验，对其它瘤谱的抑瘤作用及临床的抗癌效果尚有待于深入研究。
三、初步临床应用情况在经过极性毒性试验和药效试验后，经过1年多的临床应用，已直接观察病例100例，其中肿瘤、肝病、心血管疾病、抗衰老和提高免疫力的有90例，年龄在40-87之间，口服硒化褐藻多糖每次10ml(口服液)每日两次，服药后，无不良反应，也没有胃肠道反应，无任何毒副作用，均有不同疗效，自感症状头痛、头晕明显减轻，食欲增加，自感有力，头脑清醒，记忆恢复。
例1、陈×，干部，男，51岁，患脂肪肝，近年来常感烦燥，脾气不好，且经常头昏，也有健忘、易疲劳等症状，肝区也偶尔隐隐作痛，医院检查后说除了肝病外，还有脑供血不足等问题。服用硒化褐藻多糖一段时间后，感觉精神情况等大有改善，而且过年这一段时间喝酒也没有什么大影响，脾气也好多了。特别是记忆力见明显改善，晚上看书，第二天能记住了。体力也比以前好一些，以前回家上个五层楼就1气喘吁吁，用了硒化褐藻多糖后，现在感觉上楼很轻松。
例2、张××，女，86岁，退休，患有反应迟缓，语速变慢等衰老现象，有老年痴呆症的倾向。且有窦性心律过缓，血压偏低，多年稀便(七、八次/天)等病史。服用了10瓶硒化褐藻多糖，感觉明显精神，气色都较以前好，而且说话语速、反应都明显好转等，另外感觉稀便逐渐减少，大便趋向正常。
例3、刘××，女，60岁，退休，前几年患鼻咽癌，做了手术切除，有转移；一年后又做了手术切除，放化疗三个余月。近两年诊断为冠心病，先后发作十余次心绞痛、胸闷、憋气等，去医院急救过几次。前不久冠心病发作，急救治疗出院后儿子的同学来看望，买了4瓶硒化褐藻多糖口服液，用完后感觉睡眠很好，精神也很好，而且自从服用后到现在冠心病一直未发作，吃饭也好，感觉生活轻松了许多。
例4、孙××，男，74岁，退休，确诊为扩散性肝癌，在山大医院做了一次介入疗法，医生建议去做全身化疗，但老人74岁了，哪能受得了全身化疗呢？没办法只做了一般性治疗。后来买了8盒硒化褐藻多糖口服液，当时老人发烧，谁知老人服用1瓶后，发烧竟然好了。家人信心大增，一直坚持服用。从那开始，病人情况一天比一天好，基本上和正常人一样，也不痛了，吃饭也正常人一样。目前，老人仍在山大医院治疗。
例5、张××，女，76岁，退休，去年10月份的一天疼痛难忍，到山大医院一查，是淋巴瘤晚期。医院采用化疗，一个疗程没做完，老人病情开始恶化，呕吐、无法入睡，体质极弱。买了四盒硒化褐藻多糖口服液。服用4盒，老人病情明显好转，可以吃饭了。现在，老人不但饮食和睡眠恢复到了发病前的良好状态，而且生活习惯也和正常人一样。
例6、赵××，男，65岁，退休，在一次例行体检中被诊断为前列腺癌，老人住进了市人民医院12病房28号，进行了手术及放、化疗治疗，治疗期间老人明显消瘦，体重由160斤下降到140斤，无食欲口味差，小便失禁、尿急，在服用硒化褐藻多糖口服液两个疗程以后，老人的病情得到了有效的控制，体重增加到150多斤，面容红润，症状减轻。
例7、高×，男，62岁，98年11月经CT诊断为肝血管瘤，采用四次介入治疗，头发几乎脱光，食欲下降，口内反酸无味，食欲全无，老人由160斤下降到不足90斤，整个人骨瘦如柴，身体极度虚弱，而肿瘤却仍然在不停的生长。老人于2000年2月1日开始服用硒化褐藻多糖口服液，5天后患者食欲明显增加，精神得到改善，睡眠质量好，服用一个月后患者食量等方面基本正常。脸部出现红润，头发重新长出来，3月29日到人民医院检查，肿瘤缩小1公分。
例8、徐××，男，70岁，徐老在99年11月6号在医院查出来是胰腺癌，11月8号做化疗，二个疗程没下来，病人便卧床不起，滴食不进，奄奄一息，只好停止化疗，12月8号，他买了2盒硒化褐藻多糖口服液，还没吃完，病人开始好转，可以吃饭了，又买了2盒，吃完后，病人可以下床在室内活动了。
本发明的实施例不仅局限在以下实施例中，结合附图进一步说明如下
图1为硒化褐藻多糖(a)、褐藻多糖(b)紫外图。图2为硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)红外光谱。图3为硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的氢谱。图4为硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的碳谱。图5为硒化壳聚糖(a)、磺化壳聚糖(b)和壳聚糖(c)的紫外光谱。图6为硒化壳聚糖(a)、磺化壳聚糖(b)和壳聚糖(c)的红外光谱图7为硒化壳聚糖(a)和磺化壳聚糖(b)氢谱。图8为硒化壳聚糖(a)和磺化壳聚糖(b)的碳谱。图9为硒化红藻多糖(a)和红藻多糖(b)紫外光谱。图10为硒化红藻多糖(a)和红藻多糖(b)的红外光谱。图11为硒化红藻多糖(a)和红藻多糖(b)的氢谱。图12为硒化红藻多糖(a)和红藻多糖(b)的碳谱。
一、硒化褐藻多糖的光谱测定结果1)紫外光谱测定结果褐藻多糖(b)的紫外光谱图与有关的文献报道基本相同。从硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的紫外光谱图可以清楚地看出，硒化褐藻多糖只在255nm左右有很弱的吸收峰，而褐藻多糖在265nm左右有较强的吸收峰。因此，褐藻多糖分子中含硒而使紫外光谱有明显的区别。结合褐藻多糖所经历的化学反应机理，可以初步肯定褐藻多糖分子中的部分硫酸根已被亚硒酸根所取代。
2)硒化褐藻多糖的红外光谱测定结果硒化褐藻多糖和褐藻多糖的红外光谱图见图11，其中褐藻多糖的红外光谱图与文献报道基本相同。褐藻多糖的结构比较复杂，一般来说，在1100～1010cm-1区间的吸收峰表明含有呋喃糖苷健；在1250～1260cm-1的峰为S=O伸缩振动峰；810～850cm-1的吸收峰是C-O-S伸缩振动峰，它的位置与硫酸根在糖上的连接位置有关，连接在褐藻多糖的C4位处于自立键位置的硫酸根，在850cm-1有吸收，连接在岩藻聚糖的C2或C3位处于平伏健位置的硫酸根，它的吸收峰在820cm-1左右。
从本文得到的褐藻多糖的红外光谱来看，褐藻多糖在1255～1260cm-1有S=O伸缩振动峰，说明含有硫酸根，而且在820cm-1处有吸收，表明硫酸根连在C2或C3的位置上。
从硒化褐藻多糖的红外光谱来看，与褐藻多糖的红外光谱基本相同，但是硒化褐藻多糖在1255～1260cm-1处的S=O伸缩振动峰已变得非常弱，这表明，硫酸根大部分已被亚硒酸根所取代；此外，硒化褐藻多糖在820cm-1处的C-O-S伸缩振动峰强明显变弱，也可证实硫酸根被亚硒酸根所取代。
3)、硒化褐藻多糖和褐藻多糖的1H-NMR测定结果硒化褐藻多糖和褐藻多糖的氢谱见图，从硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的氢谱对照可以看出，两者基本相同，所以两者的骨架结构和基本构型相同。但是，硒化褐藻多糖的氢谱上出现褐藻多糖氢谱上所没有的两个新峰，即3.906ppm和3.929ppm。这两个峰可能是连在C2或C3位上的亚硒酸根的氢产生的吸收峰，或者是C2或C3上的氢产生的吸收峰。
4)、硒化褐藻多糖和褐藻多糖的13C-NMR的测定结果硒化褐藻多糖和褐藻多糖的碳谱见图4，从硒化褐藻多糖和褐藻多糖的碳谱对比可以清楚地看出，褐藻多糖在77.383ppm和77.076ppm处有明显的吸收峰，而硒化褐藻多糖在此位移具有很弱的吸收峰，但在75ppm和76ppm附近处出现两个褐藻多糖碳谱中没有的新峰。亚硒酸根与硫酸根相比，电子云更多地偏向氧原子，因而相比较而言，与亚硒酸根相连的碳原子的化学位移在高场，与硫酸根相连的碳原子的化学位移在地场。据此，根据褐藻多糖和硒化褐藻多糖的C2位或C3位移变化可以证实，褐藻多糖的C2位或C3位的硫酸根被亚硒酸根所取代。
5)结论利用紫外光谱和红外光谱证实了硒化褐藻多糖中确实含有有机硒；结合氢谱和碳谱基本确定亚硒酸根是取代褐藻多糖C2位或C3的硫酸根而连接在褐藻多糖的C2位或C3位。
二、硒化壳聚糖的光谱测定结果1)硒化壳聚糖的紫外光谱测定结果硒化壳聚糖和磺化壳聚糖及壳聚糖紫外光谱见图5，可以清楚地看出，硒化壳聚糖除了在200nm左右有末端吸收外，在281nm左右有明显的吸收峰；而磺化壳聚糖在200nm左右有末端吸收，在255nm左右有很强的吸收峰；壳聚糖只在200nm左右有吸收峰。这可以清楚地表明通过磺化反应壳聚糖分子中引入了磺酸根，又通过硒化反应磺化壳聚糖分子中的硫酸根又被亚硒酸根取代，生成硒化壳聚糖。
2)硒化壳聚糖的红外光谱测定结果硒化壳聚糖、磺化壳聚糖和壳聚糖的红外光谱见图6，壳聚糖的红外光谱与文献报道(周赤，1997)基本相同，从磺化壳聚糖与壳聚糖的红外光谱数据和图形对比可以看出，可能磺酸根连接在C2位的氨基上和连接在C6位的羟基上，主要是因为有以下的光谱图形和光谱数据变化得到证明壳聚糖C2位的氨基被磺化后，氨基和羟基在3400cm-1附近的峰形变尖锐；壳聚糖C2位氨基上未脱干净的乙酰基的羰基振动峰位为1663.21cm-1而磺化壳聚糖C2位氨基上未脱干净的乙酰基的羰基振动峰位为1637.77cm-1，可能是受到C6位的羟基上磺酸基的影响；同样由于磺化壳聚糖C2位氨基上和C6位羟基上磺酸基的影响，对应于壳聚糖C-O伸缩振动的峰由1074.49cm-1变为磺化壳聚糖的1086.06cm-1；壳聚糖C2位的氨基磺化后，NH的弯曲振动峰位由1558.68cm-1变为相对应的磺化壳聚糖的1522.03cm-1。
从磺化壳聚糖和硒化壳聚糖的红外光谱数据和光谱图可以看出，磺化聚糖经过硒化取代后，C2位氨基上的磺酸根一部分被亚硒酸根取代，另一部分被水解成游离氨基，这可以由磺化壳聚糖的氨基和羟基伸缩振动的峰形很窄，而硒化壳聚糖的氨基和羟基伸缩振动的峰形很宽得到证实；磺化壳聚糖C2位氨基上的磺酸根一部分被亚硒酸根取代后，其N-H弯曲振动峰位由1522.03cm-1变为相对应的硒化壳聚糖的1538.39cm-1；由于磺化壳聚糖C2位氨基上的磺酸根一部分被亚硒酸根取代后，以及可壳能还有C6位的磺酸根被亚硒酸根取代，使得磺化壳聚糖C-O伸缩振动的峰位由1086.06cm-1变为硒化壳聚糖相对应的1091.85cm-1，而且峰形变宽。
3)硒化壳聚糖的1H-NMR测定结果硒化壳聚糖和磺化壳聚糖的氢谱见图7，磺酸根的化学位移参考了有关的文献报道(于德泉，1989)。磺化壳聚糖在δ8.954ppm和δ8.821ppm处的吸收峰，可能是链节上C2位氨基上和C6位羟基上同时连有两个磺酸根时，连在C2位羟基和连在C6氨基上的磺酸根上的氢产生的吸收峰；δ8.271ppm可能是一个链节上只在氨基上连有一个磺酸根时该磺酸根上的氢产生的吸收峰。而硒化壳聚糖在氢谱上没有这三个峰，但在3.830ppm出现磺化壳聚糖碳谱中没有的一个多重峰，可能是磺酸根已被亚硒酸根所取代所致。
4)硒化壳聚糖和磺化壳聚糖的13C-NMR测定结果硒化壳聚糖和磺化壳聚糖的碳谱见图8。从图中可以看出，硒化壳聚糖的碳谱中出现磺化壳聚糖碳谱中没有的两个新峰，即76.090ppm和58.710ppm，它们分别是磺化壳聚糖C2位氨基上和C6位羟基上的磺酸根被亚硒酸根取代后C2位和C6位碳产生的吸收峰。
5)结论对制备的硒化壳聚糖用原子荧光光谱法进行了测定，证实其含有较高的硒含量。对硒化壳聚糖的理化性质进行了测定，并与壳聚糖和磺化壳聚糖的理化性质进行了对比，对三者具有不同理化性质的原因作了分析分子中引入了不同的基团从而具有不同的理化性质，这是主要原因；分子量的不同对理化性质也有影响。通过紫外和红外光谱分析，确认了硒化壳聚糖含有硒，而且是有机硒。通过氢谱和碳谱基本确认硒化壳聚糖中的亚硒酸根是连在C2和C6位。
三、硒化红藻多糖的光谱测定结果1)硒化红藻多糖和红藻多糖的紫外光谱测定结果硒化红藻多糖和红藻多糖的紫外光谱见图9。可以明显看出，硒化红藻多糖除了200nm的末端吸收外，在281nm处有明显的吸收峰；而红藻多糖只有200nm的末端吸收峰。281nm峰的出现，正是红藻多糖分子中引入了亚硒酸根的结果。因此，紫外光谱的测定结果可以证实硒化红藻多糖含有有机硒。
2)硒化红藻多糖和红藻多糖的红外光谱测定结果硒化红藻多糖和红藻多糖的红外光谱见图10。红藻多糖的红外光谱与文献报道的基本相同。比较两者的红外光谱，硒化红藻多糖中，在1263.54cm-1处有吸收峰，这是由于红藻多糖存在Se=O的伸缩振动所致；在1271.25cm-1处有一吸收峰，该峰是S=O伸缩振动的特征峰。说明，由于红藻多糖分子中半乳糖单元的硫酸根被亚硒酸根取代以及3，6-内醚-D-半乳糖单元的C3位引入亚硒酸根导致两者分子结构不同，使对应于红藻多糖的硒化红藻多糖的该峰产生位移。另外，红藻多糖硒化后生成的硒化红藻多糖出现了704.11cm-1和771.62cm-1两个新峰，这两个峰是亚硒酸根的特征吸收峰。因此，从红外光谱图也可以证实硒化红藻多糖中含有有机硒。
3)硒化红藻多糖和红藻多糖的氢谱的测定结果硒化红藻多糖和红藻多糖的氢谱见图11。可以看出，硒化红藻多糖和红藻多糖的氢谱基本是相同的，并且它们的C1质子的δ值均超过了5.0ppm，所以它们的糖苷键构型均为α型，说明硒化红藻多糖仍然保持红藻多糖硫酸酯多糖的基本构型。但与红藻多糖的氢谱相比，硒化红藻多糖氢谱中在4.834ppm和4.794ppm出现两个新峰。这两个新峰，一个是红藻多糖半乳糖单元的C4位上硫酸根被亚硒酸根取代后的亚硒酸根上的氢，或者是红藻多糖半乳糖单元的C4位上硫酸根被亚硒酸根取代后亚硒酸根所连结的C4位上的氢产生的吸收峰；另一个是红藻多糖3，6-内醚-D-半乳糖单元的内醚键被亚硒酸根打开而连在该单元C3位上的亚硒酸根上的氢，或者是红藻多糖3，6-内醚-D-半乳糖单元的内醚键被亚硒酸根打开而连在该单元C3位上的C3上的氢所产生的吸收峰。氢谱主要解决多糖结构中糖苷键构型问题。由于多糖的信号大多堆积在δ4.0-5.5ppm的狭小范围内，除C1上的质子信号在δ4.8-5.5ppm范围易解析外，其它C2-C6上的质子信号均集中在δ4.0-4.8范围，互相重叠交叉，解析困难。所以1H-NMR的测定结果通常作为13C-NMR分析结果的补充资料。通常α型吡喃己糖C1质子的δ值超过5.0ppm，而β型吡喃己糖C1质子的δ值则小于5.0ppm。
4)硒化红藻多糖和红藻多糖的碳谱的测定结果硒化红藻多糖和红藻多糖的碳谱见图12。硒化红藻多糖和红藻多糖各碳的位移参考了有关的文献报道。红藻多糖硒化后生成硒化红藻多糖，各碳化学位移的变化数据，详见表3。13C-NMR谱表明硒化红藻多糖仍保持硫酸酯多糖的基本构型；在红藻多糖D-半乳糖硫酸酯单元中硒化红藻多糖的C4位较的C4位显著向高场位移(红藻多糖的77.465ppm变为硒化红藻多糖72.546ppm)，是因为-SeO32-取代了-SO42-所致；同时，与红藻多糖的碳谱相比，硒化红藻多糖的碳谱上在73.002ppm处出现新峰，这是因为红藻多糖在3，6-内醚-D-半乳糖单元可能发生了下列反应。由此可以证实，红藻多糖在3，6-内醚-D-半乳糖单元的C3位引入了-SeO32-，使得该碳位移由分子中的79.188ppm变为硒化红藻多糖分子中的73.002ppm，显著向高场方向移动。
表3硒化红藻多糖和红藻多糖的碳谱数据对比 注(1)碳谱的化学位移是，以二甲亚砜为对照。(2)该峰是新峰。(3)该碳谱在73.002ppm处有新峰。
5)结论硒化红藻多糖的理化性质与红藻多糖的理化性质相比，有差异不显著的方面，也就是硒化后的红藻多糖，仍基本保持红藻多糖的分子链长度，保持原有的稳定性，保持基本相同的溶解度，保持红藻多糖硫酸酯多糖的基本构型；差异显著之处有，两者的特性粘度相差较大，旋光度差异明显，硒化红藻多糖的紫外光谱在281nm处有明显的吸收峰而卡拉胶则没有，硒化红藻多糖的氢谱与红藻多糖的相比在4.834ppm和4.794ppm处出现两个新峰，硒化红藻多糖的碳谱与红藻多糖的相比在72.546ppm和73.002ppm处出现两个新峰。分析造成这些不同的原因，一是在硒化反应过程中，红藻多糖分子中半乳糖单元的硫酸根被亚硒酸根取代以及3，6-内醚-D-半乳糖单元的C3引入亚硒酸根导致两者分子结构不同所致，这可能是主要原因；二是硒化红藻多糖的分子量比红藻多糖的小些。
对硒化红藻多糖的结构进行的光谱测定，紫外和红外光谱可以证实硒化红藻多糖含有有机硒；氢谱和碳谱则可以确认硒化红藻多糖中的亚硒酸根是取代红藻多糖中D-半乳糖硫酸酯单元中的硫酸根而连接在C4位，同时有些亚硒酸根将红藻多糖中3，6-内醚-D-半乳糖单元的醚键打开而连接在C3位。从硒化红藻多糖中的实际含硒量和红藻多糖中硫酸根完全被亚硒酸根取代后的理论含硒量比较可知硒化红藻多糖中还含有部分硫酸根，这一点在光谱中也表现得很明显，即硫酸根和亚硒酸根在光谱中都同时存在。
本发明的硒化多糖化合物的制备方法，是按下列步骤组成的(1)硒化反应；(2)除去催化剂；(3)除去未反应的亚硒酸根离子；(3)除去未反应的亚硒酸根离子；(5)烘干；(6)精制。按照上述步骤，本发明的制备实施例如下列表4-表6所列反应条件和产品质量数据。(转下页三表)
硒化褐藻多糖制备实施例见下表4 硒化壳聚糖制备实施例见下表5 硒化红藻多糖制备实施例见下表6
权利要求
1.一种硒化多糖化合物，其特征在于该化合物包括其本身及其盐，加成盐或药用盐，该化合物的单元分子通式为 其中x1，x3为亚硒酸根及其盐，C1-C4烷基，或羟基；x2为亚硒酸根及其盐，或亚硒酰胺基，或羟基；x4为C1-C4羟烷基；x5为亚硒酸根及其盐；n为自然数。
2.根据权利要求1所述硒化多糖化合物，其特征在于所述的 其可以是2位硒化褐藻多糖和3位硒化褐藻多糖，即或 的化合物；该化合物的物化性质如下(1)外观灰白色或浅黄色粉末；(2)溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；(3)粘度该化合物1％水溶液在25℃时的特性粘度为1-100；(4)pH值该化合物1％水溶液在25℃时的pH值为6.8-7.0；(5)平均分子量3000-30000道尔顿；(6)平均含硒量10-125mg/g；(7)稳定性该化合物及其盐、加成盐或药用盐常温存放一年后，含硒量不变；(8)旋光度-30--80度；(9)光谱①紫外光谱在波长255nm附近处有弱特征吸收峰②红外光谱在波长1255-1260cm-1或820cm-1处有中强度的伸缩振动特征吸收峰；③氢谱在化学位移3.906ppm和3.929ppm两处有特征吸收峰；④碳谱在化学位移75ppm和76ppm两处有特征吸收峰。
3.根据权利要求1所述硒化多糖化合物，其特征在于所述的 其可以是硒化壳聚糖，即 化合物；该化合物的物化性质如下(1)外观灰褐色粉末；(2)溶解性微溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；(3)粘度该化合物1％水溶液在25℃时的特性粘度为30-500；(4)pH值该化合物1％水溶液在25℃时的pH值为6.6-7.0；(5)平均分子量100-20000道尔顿；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)稳定性该化合物及其盐、加成盐或药用盐常温存放一年后，含硒量不变；(8)旋光度-5--30度；(9)光谱①紫外光谱在波长281nm附近处有明显的特征吸收峰；②红外光谱在波长1538.39cm-1和1091.05cm-1处有很宽的伸缩振动特征吸收峰；③氢谱在化学位移3.830ppm处有一个多重特征吸收峰；④碳谱在化学位移76.090ppm和58.710ppm两处有两个特征吸收峰。
4 根据权利要求1所述硒化多糖化合物，其特征在于所述的 其可以是硒化红藻多糖，即 化合物；该化合物的物化性质如下(1)外观灰白色，或浅褐色粉末；(2)溶解性易溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；(3)粘度该化合物1％水溶液在25℃时的特性粘度为10-200；(4)pH值该化合物1％水溶液在25℃时的pH值为6.7-7.0；(5)平均分子量100-20000道尔顿；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)稳定性该化合物及其盐、加成盐或药用盐常温存放一年后，含硒量不变；(8)旋光度+30-+90度；(9)光谱①紫外光谱在波长281nm附近处有明显的特征吸收峰；②红外光谱在波长1263.54cm-1处有明显的特征吸收峰，并在704.11cm1和771.62cm-1处有两个特征吸收峰；③氢谱在化学位移4.834ppm和4.794ppm处有两个特征吸收峰；④碳谱在化学位移73.002ppm和72.546ppm处有两个特征吸收峰。
5.根据权利要求1或2或3或4所述硒化多糖化合物的制备方法，其特征在于所述的硒化多糖化合物是由下列步骤制成的(1)硒化反应将多糖类化合物与亚硒酸或其盐在酸性溶液中经钡离子、氢离子的催化作用下，并加热10-100℃，恒温反应5-10小时，该反应是在吡喃己糖单元的C2或C3或/和C5位上的取代反应，或在3，6-内醚-D-半乳糖单元的C3和C6位上的加成反应，而生成硒化多糖化合物；该反应式如下多糖类化合物+亚硒酸根 硒化多糖化合物，反应完毕，降温反应液至室温；(2)除去催化剂将降温的反应液逐步滴加0.1-1N的硫酸溶液，使反应液中的Ba2+离子成为硫酸钡沉淀；(3)除去未反应的亚硒酸根离子将(2)中的带有硫酸钡沉淀的反应液抽滤，取滤液，再加入氯化铁溶液，之后用NH3-NH4HCl溶液调节pH值3-12，搅拌促反应，再放置过夜，之后用离心机分离，取滤液；(4)乙醇分级沉淀将(3)中的滤液用15％的醋酸钠溶液调节pH值3-9，再用乙醇溶液分级沉淀，并分别抽滤，得分子量分级的粗产品-硒化多糖；(5)烘干将(4)中的分级的粗产品-硒化多糖，分别烘干，并在真空度大于0.09Pa的条件下，烘干温度30-60℃下，进行，可得烘干的分级的粗产品-硒化多糖，该粗产品的硒含量为20-100mg.Se/g硒化多糖；(6)精制将(5)中的该粗产品采用超滤仪按需要精制成各级分子量的硒化多糖精品。
6.根据权利要求5所述硒化多糖化合物的制备方法，其特征在于所述的(1)中的多糖类化合物，其是褐藻多糖，或壳聚糖，或红藻多糖，或其它海藻多糖；所述的(1)中的亚硒酸及其盐，其与多糖类化合物的投料重量比为1∶0.1-10；所述的(1)中的硝酸溶液，其浓度范围是0.5-5％(w/v)。
7.根据权利要求5所述硒化多糖化合物的制备方法，其特征在于所述的(1)中的钡离子，其可以是氯化钡，也可以是碳酸钡，也可以是硝酸钡，还可以是可溶性钡盐；其中钡离子的投料重量比为0.1-10.0。
8.根据权利要求5所述硒化多糖化合物的制备方法，其特征在于所述的(3)中的氯化铁溶液，其溶液浓度为10-30％，以除去未反应的亚硒酸根离子为准。
9.根据权利要求5所述硒化多糖化合物的制备方法，其特征在于所述的(4)中的乙醇溶液分级沉淀并分别抽滤所得的不同分级分子量的粗产品-硒化多糖，其中乙醇在整个溶液的终点浓度沉淀的硒化多糖的分子量的对应关系如下，(1)乙醇在整个溶液的终点浓度85-95％，对应沉淀的硒化多糖的分子量为100-3500道尔顿；(2)乙醇在整个溶液的终点浓度70-85％，对应沉淀的硒化多糖的分子量为3500-8000道尔顿；(3)乙醇在整个溶液的终点浓度30-70％，对应沉淀的硒化多糖的分子量为8000以上道尔顿。
10.根据权利要求5所述硒化多糖化合物的制备方法，其特征在于所述的(6)中的采用超滤仪按需要精制成各级分子量的硒化多糖精品，其各级分子量的硒化多糖精品对应的硒含量如下(1)分子量为100-3500道尔顿的硒化多糖精品的硒含量为50-100mg·Se/g；(2)分子量为3500-8000道尔顿的硒化多糖精品的硒含量为40-80mg·Se/g；(3)分子量为8000以上道尔顿的硒化多糖精品的硒含量为20-60mg·Se/g。
全文摘要
本发明公开了三种海洋新药产品及制备方法。该新药对肾衰和血管病和肿瘤具有显著疗效,是低毒甚至无毒的药物。其中有抗病毒、抗HIV、抗肿瘤和提高机体免疫等广泛功能的硒化褐藻多糖,硒化壳聚糖,硒化红藻多糖,其中硒化红藻多糖还对淋巴细胞的分裂有显著的促进作用,具有抑制疱疹病毒复制作用。本发明的硒化多糖化合物是新的化合物,通过对本硒化多糖的光谱分析,可以证实该化合物真实存在。其物化性质既有共性,又有个性。其分子结构的构型、光谱分析、物化性质等在国内外还未见报导。
文档编号A61K31/715GK1288899SQ0011126
公开日2001年3月28日 申请日期2000年8月4日 优先权日2000年8月4日
发明者李光友, 缪锦来, 刘发义 申请人:国家海洋局第一海洋研究所