专利名称：糖蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生产糖蛋白的方法，所述糖蛋白具有包含甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链，其中所述糖链可以作为所述糖蛋白转运进哺乳动物如人类细胞的溶酶体的标记性标记。
背景技术：
已经证明，当天然蛋白被除去糖链时，它们不能显示固有的生物学活性(A.Kibata，Tanpakushitsu Kakusan Koso 36，775-788(1991))。这提示糖链在发挥生物学活性中起重要作用。然而，由于糖链结构与生物学活性之间的相关关系并不总是明显的，因此需要发展允许灵活地修饰和控制附着于蛋白的糖链结构(糖的类型、连接位置、链长度等)的技术。
糖蛋白的糖链主要分为Ash连接型、粘蛋白型、O-GlcNAc型、GPI锚定型和蛋白聚糖型(M.Takeuchi，Glycobiology Series 5，Glycotechnology；由A.Kibata，S.Hakomori，K.Nagai编辑，KodanshaScientific，191-208(1994))，每种类型都有独特的生物合成途径，执行不同的生理学功能。Asn连接型糖链的生物合成途径已经得到广泛研究和详细分析。
Asn连接型糖链的生物合成开始于合成在脂载体中间体上由N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖组成的前体，以及所述前体转移到内质网(ER)中糖蛋白的特定序列(Asn-X-Ser或Thr)。然后所述前体受到加工(切割葡萄糖残基和特定甘露糖残基)，合成由8个甘露糖残基和2个N-乙酰葡萄糖胺残基组成的M8高甘露糖型糖链(Man8GlcNAc2)。包含所述高甘露糖型糖链的蛋白被转运到高尔基体，在高尔基体中接受各种修饰，高尔基体中进行的这些修饰在酵母和哺乳动物之间有显著不同(Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.，56，915-944(1987))。
在哺乳动物细胞中，根据接受糖链修饰的蛋白类型，采用三种不同途径中的一种。所述三种途径是1)核心糖链不受到改变，2)在核心糖链的Man的位置6添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸酯部分(GlcNAc-1-P)，产生Man-6-P-1-GlcNAc，然后仅去除GlcNAc部分，以转化为具有酸性糖链的糖蛋白，以及3)从核心糖链顺序去除五个Man分子，留下Man3GlcNAc2，在其上几乎顺序同时加入GlcNAc、半乳糖(Gal)和N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸(NeuNAc))，产生多种不同杂种与复合糖链的混合物[R.Kornfeld和S.Kornfeld，Ann.Rev.Biochem.，第54卷，第631-664页(1985)](
图1)。因此，已经发现哺乳动物糖链具有与糖蛋白功能密切相关的各种结构。
另一方面，已经发现酵母产生甘露聚糖型糖链，或“外部链”，在上述核心糖链(Man8GlcNAc2)上有几个到上百个甘露糖残基，同时也产生在所述核心糖链部分和外部糖链部分上添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链(见图2)。该修饰与动物细胞的修饰不同，已经报道，在酵母中，所述修饰不作为将糖蛋白定位到液泡(对应与动物细胞中溶酶体的细胞器)的分拣信号。因此，酵母中磷酸化糖链的生理功能仍是个谜[Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.，第56卷，第915-944页(1987)]。
如图2所示，酵母中包含甘露糖磷酸酯的糖链的磷酸化位点有时添加到在ER中合成的Man8GlcNAc2核心糖链的α-1，3分支侧和α-1，6分支侧，有时添加到高尔基体中合成的甘露糖外部链上大量存在的α-1，2分支，或者添加到甘露糖外部链的非还原端[Herscovics和P.Orlean，FASEB J.，第7卷，第540-550页(1993)]。
人们相信，酵母属(Saccharomyces)酵母中外部链的生物合成沿着图2所示的途径发生[Ballou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第3368页(1990)]。
具体地说，发生延长起始反应，其中甘露糖以α-1，6键添加到M8高甘露糖型糖链上(图2，反应I、B)。已经显示，进行该反应的酶是由OCH1基因编码的蛋白(Nakayama等，EMBO J.，11，2511-2519(1992))。此外，通过α-1，6键连续延伸甘露糖的反应(图2II)形成外部链的骨架，即聚α-1，6连接甘露糖(图2E)。所述α-1，6连接甘露糖具有α-1，2连接甘露糖分支(图2C、F、H)，并且α-1，3连接甘露糖常常添加到所述分支的α-1，2连接甘露糖的末端(图2D、G、H、I)。MNN1基因产物进行这些α-1，3连接甘露糖的添加(Nakanishi-Shindo等，J.Biol.Chem.，268，26338-26345(1993))。已经证明，产生一些酸性糖链，所述酸性糖链在高甘露糖型糖链部分添加甘露糖-1-磷酸酯(图2*)，以及在外部链部分添加甘露糖-1-磷酸酯。已经显示，该反应依赖于由MNN6基因编码的蛋白(Wang等，J.Biol.Che m.，272，18117-18124(1997))，另外已经鉴定一个基因(MNN4)，该基因编码积极控制该转移反应的一种蛋白(Odani等，Glycobiology，6，805-810(1996)；Odani等，FEBS Letters，420，186-190(1997))。
在大多数情况下，外部链导致异源蛋白产物，使蛋白纯化变得复杂并降低比活(Bekkers等，Biochim.Biophys.Acta，1089，345-351(1991))。此外，由于糖链结构上的巨大差异，酵母中产生的糖蛋白并不表现与哺乳动物产生的糖蛋白相同的生物学活性，并在哺乳动物具有很强的免疫原性。例如，已知在酿酒酵母(S.cerevisiae)中MNN1基因产生的α-1，3甘露糖苷键具有强免疫原性(Ballou，C.E.，MethodsEnzymol.，185，440-470(1990))。已经报道，酵母本身具有甘露糖-6-磷酸酯-α-1-甘露糖(Man-6-P-1-Man)形式的甘露糖-6-磷酸酯(Man-6-P)，该形式并不结合Man-6-P受体(Kukuruzinska等，Annu.Rev.Biochem.，56，915-944(1987)；Faust和Kornfeld，J.Biol.Chem.，264，479-488(1989)；Tong等，J.Biol.Chem.，264，7962-7969(1989))。因此，人们认为酵母作为生产有用哺乳动物糖蛋白的宿主是不合适的。学术界和工业界都希望开发出能够产生具有与哺乳动物相当生物活性的糖链(即哺乳动物型糖链)的糖蛋白的酵母。本发明的发明人以前已经成功地创造缺乏外部链的突变体和具有哺乳动物型糖链的酵母(日本专利申请第11-233215号)。
如上文所述，酵母通过MNN4基因和MNN6基因的作用，产生在核心糖链部分和外部链部分添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链。已经证明，由所述产生核心糖链并且编码外部链合成酶的基因为缺陷型的突变体生产的糖蛋白的糖链包括中性糖链(图3结构式I)和酸性糖链(图3结构式II到IV)(Proceedings of the 12th BiotechnologySymposium，p.153-157，10/14/2004，Biotechnology DevelopmentalTechnology Research Society)。
所述酸性糖链具有在哺乳动物糖链中未曾发现的结构。具体地说，在哺乳动物细胞中不是添加甘露糖-1-磷酸酯，而是添加N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸酯，然后仅去除N-乙酰葡萄糖胺部分，产生图1中标记为“*”的最终酸性糖链。正如将在下文进一步解释并在Methodsin Enzymology，[第185卷，第440-470页(1990)]中教导的，该糖链在哺乳动物细胞中作为溶酶体转运信号起作用。
溶酶体是包含各种酸性水解酶的细胞内细胞器，所述水解酶分解从细胞内和细胞外吸收入溶酶体的物质。定位于人溶酶体内的这类酶中的大多数酶一旦被生物合成并转运到高尔基体，就在高甘露糖型糖链的非还原端甘露糖残基的位置6添加磷酸酯基团，由此转化为携带酸性糖链的糖蛋白，并且所述磷酸酯基团用作溶酶体酶特异性识别标记。它们通过结合高亲和力甘露糖-6-磷酸酯受体(MPR)而与其它蛋白区分开来，然后被携带进入前溶酶体，在前溶酶体的酸性环境下，它们从MPR解离，然后转运到溶酶体(von Figura和Hasilik，Annu.Rev.Biochem.，54，167-193(1984))。与甘露糖-6-磷酸酯受体(MPR)的结合需要每个糖链包含一个或多个甘露糖-6-磷酸酯分子。该溶酶体酶特异性磷酸酯基团添加由两个不同的酶反应完成。W.Canfield等已经成功克隆编码参与甘露糖-6-磷酸酯合成的两个酶的基因(GlcNAc-磷酸-磷酸转移酶，GlcNAc-磷酸二酯-GlcNAc酶)(Abstractof the XV International Symposium on Glycoconjugates.GlycoconjugateJournal第16卷No.4/5 S41(1999))。
这些溶酶体酶中的遗传缺陷、涉及添加磷酸酯反应的酶的遗传缺陷或促进所述溶酶体酶激活或稳定的因子的遗传缺陷导致一组特征在于酶反应受到阻断和细胞内底物积累的疾病，所述疾病统称为“溶酶体病”(Leroy和DeMars，Science，157，804-806(1967))。已知人类有超过30种不同类型的溶酶体病，它们共同构成儿科和内科中的一组重要疾病。发展针对所述疾病的基本治疗的策略包括骨髓移植和基因疗法。也已经尝试过使用溶酶体酶的酶补充疗法，但靶器官吸收差成为主要障碍，目前仅观察到酶补充对戈谢病有令人满意的效果。
戈谢病源于编码葡糖脑苷脂酶(一种降解葡糖苷脂酰鞘氨醇的溶酶体酶)的基因内突变，该突变导致其底物葡糖苷脂酰鞘氨醇主要在骨髓巨噬细胞衍生的细胞中积累，表现为显著的肝脾肿大和包括贫血和出血在内的造血功能障碍。如上文所述，对该疾病的治疗方法包括酶补充疗法，所述疗法产生有利的治疗结果，但所述疗法必须终生持续，并且所述酶制剂异常昂贵。如下产生葡糖脑苷脂酶制剂修饰CHO细胞表达的人重组葡糖脑苷脂酶的糖链末端，形成使甘露糖暴露的形式。由于这种疾病中的发病细胞主要是巨噬细胞，因此葡糖脑苷脂酶可能在通过巨噬细胞上的甘露糖受体被吸收入细胞后被转运到溶酶体。已知葡糖脑苷脂酶被转运进溶酶体，而不论其糖链上是否有甘露糖-6-磷酸酯。因此，推测该酶通过不依赖于甘露糖-6-磷酸酯受体(MPR)的转运机制被转运到溶酶体。
然而，大多数其它溶酶体病中的缺陷酶通过甘露糖-6-磷酸受体介导的系统转运到溶酶体，因此用于酶补充疗法的溶酶体酶必须具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链，作为与甘露糖-6-磷酸酯受体(MPR)结合所需的溶酶体迁移信号。因此，在这些溶酶体酶链上添加甘露糖-6-磷酸酯是关键策略。
目前，已经报道的获取溶酶体酶的方法包括从胎盘纯化的方法、使用培养细胞例如成纤维细胞或黑素瘤细胞的生产方法、使用培养细胞例如昆虫细胞或中国地鼠卵巢(CHO)细胞的重组方法、以及从转基因兔奶获取所述酶的方法。然而，这些方法有下面缺点1)带有添加磷酸酯的糖链的溶酶体酶含量低，因此溶酶体摄入的效率低，和2)低生产率/高培养成本。因此，缺点1)要求高剂量给药，而缺点2)导致高治疗费用。此外，还没有实现使用酵母细胞的重组方法生产。因此，希望的目标是在糖链上具有甘露糖-6-磷酸酯并且溶酶体摄入活性高的酶。
其中一种称为法布莱病(Fabry disease)的溶酶体病是一种X染色体遗传疾病，其特征在于α-半乳糖苷酶活性降低以及其体内底物神经酰胺三己糖苷在体内积累。典型法布莱病的患者一般从少年期或青年期开始就遭受极度疼痛、皮肤血管瘤和出汗障碍，并随着年龄增加出现肾病或心血管病和脑血管病。在最近几年，鉴定出一种相对温和的法布莱病“亚型”，该“亚型”的特征是中年期后期或更晚的时候出现心肌病，并且已经报道，该疾病的患者可能隐藏在被误诊为心肌病的患者组中。
α-半乳糖苷酶与上文提到的葡糖脑苷脂酶不同，因为它通过甘露糖-6-磷酸酯受体介导的系统转运到溶酶体。因此，它必须具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链，以便被靶细胞有效吸收。然而，还不存在大量生产适用于治疗的高纯度具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链的α-半乳糖苷酶的技术。例如，甘露糖-6-磷酸酯糖链的比例据认为占成纤维细胞衍生的糖蛋白(α-半乳糖苷酶)约20％，该糖蛋白已经显示作为酶补充注射液在10名人类患者的9名中有优越性(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，97365-370(2000))。
由于添加到蛋白的糖链的结构在酵母细胞和哺乳动物细胞中不同，因此通过遗传工程方法在酵母中生产的有用的人或其它哺乳动物糖蛋白并不显示与从哺乳动物获得的糖蛋白的相同活性，或者它们由于不同的糖链而可能具有不同的抗原性。由于该原因，在酵母中生产哺乳动物糖蛋白是困难的。此外，具有与在人类细胞和其它哺乳动物细胞中添加的相同糖链结构的有用的包含磷酸酯的酸性糖链虽然作为转运糖蛋白进入人类或其它哺乳动物细胞内溶酶体的标记性标志是有利的，但目前无法均一大量地提供所述具有酸性糖链的糖蛋白。因此，非常需要发展所述技术。
本发明的发明人以前已经提议一种方法，包括使用糖链合成突变体(ΔOCH1 mnn1)生产糖蛋白，允许所述MNN6基因产物在体内或体外作用于其上，获得添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链，然后进行酸处理，获得有效作为溶酶体转运信号的哺乳动物样糖链(未经审查的日本专利公开HEI No.9-135689)。然而，由于用于该方法的极端变性条件(0.01N盐酸，100℃，30分钟)，实际上所有糖蛋白都被变性。因此，该方法作为获得具有生理活性的糖蛋白的方法是不令人满意的。
发明公开本发明的一个目标是克服上述在酵母中生产糖蛋白有关的问题，并由此提供使用酵母的生产方法，生产具有与在人类或其它哺乳动物细胞中添加的相同糖链结构的有用的包含磷酸酯的酸性糖链，以及具有所述糖链的糖蛋白。
作为许多致力于解决上述问题的研究的结果，本发明的发明人已经发现通过使用酵母的糖链合成突变体获取具有包含大量磷酸酯的糖链的糖蛋白，并允许α-甘露糖苷酶作用于所述糖蛋白，有可能大量生产高纯度并且保留生理活性的具有包含甘露糖-6-磷酸酯的无抗原性酸性糖链的糖蛋白，其中所述酸性糖链可作为转运进哺乳动物细胞(包括人类细胞)的溶酶体的标记性标志。进一步发现得到的带有包含磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白可以用作有效治疗人溶酶体酶缺乏等的药物。由此，完成本发明。
换句话说，本发明提供生产具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链的糖蛋白，其特征是在产生受到高度磷酸化的核心糖链的酵母糖链生物合成突变体中引入和表达编码靶糖蛋白的基因，然后用α-甘露糖苷酶处理得到的包含添加了甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白，去除所述甘露糖部分。
本发明还提供具有包含磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白，包括人类溶酶体酶，所述糖蛋白通过使用依照本发明的酵母的生产方法生产。
本发明还提供用于治疗溶酶体病的治疗组合物，其中使用依照本发明产生的人溶酶体酶。
更具体地说，本发明提供(1)到(27)。
(1)一种使用酵母生产活性形式糖蛋白的方法，其中糖蛋白的所述活性形式具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链。
(2)上述(1)的方法，其中所述携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链可以结合甘露糖-6-磷酸酯受体。
(3)一种使用酵母生产活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖链，其中所述高甘露糖型糖链显示于下面结构式I到VIII
(4)上述(1)到(3)中任一项的方法，其中所述酵母含有酸性糖链，并且在所用的酵母菌株中至少α-l，6-甘露糖苷转移酶基因被打断。
(5)上述(1)到(3)中任一项的方法，其中所述酵母含有酸性糖链，并且在所用的酵母菌株中至少α-1，6-甘露糖苷转移酶基因和α-1，3-甘露糖苷转移酶基因被打断。
(6)上述(4)或(5)的方法，其中所述α-1，6-甘露糖苷转移酶基因是酿酒酵母的OCH1基因，所述α-1，3-甘露糖苷转移酶基因是酿酒酵母的MNN1基因。
(7)上述(1)到(6)中任一项的方法，其中所述酵母是包含受到高度磷酸化的糖链的突变体。
(8)上述(7)的方法，其中所述酵母是酿酒酵母菌株HPY21。
(9)上述(1)到(8)中任一项的方法，其中所述具有携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链的活性形式糖蛋白是溶酶体酶。
(10)上述(9)的方法，其中所述溶酶体酶是α-半乳糖苷酶。
(11)上述(10)的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的结构基因是来自人类的基因。
(12)上述(11)的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的结构基因具有SEQID NO5核苷酸序列表示的核苷酸序列。
(13)上述(10)到(12)中任一项的方法，其中生产所述α-半乳糖苷酶的所述酵母是菌株HPY21G。
(14)上述(1)到(13)中任一项的方法，通过允许α-甘露糖苷酶作用于由权利要求4到8中任一项定义的酵母所产生的糖蛋白，从糖链中的甘露糖-1-磷酸酯键去除甘露糖残基。
(15)上述(14)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有从甘露糖-1-磷酸酯键去除甘露糖残基的活性。
(16)上述(14)或(15)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有非特异性破坏α-1，2-甘露糖苷键、α-1，3-甘露糖苷键和α-1，6-甘露糖苷键的活性。
(17)上述(16)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶活性是外切型活性，并且不具有内切型活性。
(18)上述(17)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶是来自纤维单胞菌属(Cellulomonas)细菌的α-甘露糖苷酶。
(19)上述(18)的方法，其中所述纤维单胞菌属细菌是纤维单胞菌SO-5。
(20)一种糖蛋白，所述糖蛋白由酵母产生，具有在非还原末端携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链。
(21)上述(20)的糖蛋白，所述糖蛋白是溶酶体酶。
(22)上述(20)或(21)的糖蛋白，所述糖蛋白通过上述(1)到(19)中任一项的方法产生。
(23)上述(21)或(22)的方法，所述糖蛋白是α-半乳糖苷酶。
(24)上述(23)的糖蛋白，所述糖蛋白是由人基因编码的α-半乳糖苷酶。
(25)上述(20)的糖蛋白，所述糖蛋白具有在非还原端包含甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖链结构的糖链，其中所述糖链显示于下面结构式I到VIII
(26)一种治疗和/或预防溶酶体病的药用组合物，所述组合物包含依照上述(20)到(25)中任一项的糖蛋白。
(27)上述(26)的药用组合物，所述药用组合物用于治疗法布莱病，其中所述糖蛋白是人α-半乳糖苷酶。
本说明书结合在日本专利申请第2001-180907号中的说明书和/或图公开的内容，本申请要求该申请的优先权。
附图简述图1举例说明哺乳动物体内N-连接糖链的一般生物合成途径(konfeld等)。
图2举例说明酵母(酿酒酵母)中N-连接糖链的生物合成途径。
图3显示酵母菌株HPY21(Δoch1 Δmnn1)产生的核心糖链和酸性糖链的结构。
图4显示依照本发明的策略图。
图5是引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G的培养物上清液的蛋白质印迹分析的照片。
1)仅引入载体的菌株(HPY21)2)引入α-半乳糖苷酶基因的菌株(HPY21G)图6显示对用Blue Sepharose从引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G的培养物上清浓缩液中分离的α-半乳糖苷酶糖链进行结构分析的结果。
图7显示对用Asahi-Pak NH2-P柱从引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G的培养物上清浓缩液中纯化的α-半乳糖苷酶糖链进行结构分析的结果。
1)从培养物上清液纯化的α-半乳糖苷酶的糖链(在每个糖链中包含一个磷酸酯分子)。
2)来自α-甘露糖苷酶处理过的上述1)的糖链。
3)来自碱性磷酸酶处理过的上述2)的糖链。
4)来自从α-甘露糖苷酶处理过的培养物上清液纯化得到的α-半乳糖苷酶的用α-甘露糖苷酶和碱性磷酸酶处理过的糖链部分(在每个糖链条上包含两个磷酸酯分子)的糖链。
图8是对纯化的α-半乳糖苷酶进行蛋白质印迹分析的照片，所述纯化的α-半乳糖苷酶已经进一步用纤维单胞菌属SO-5菌株产生的α-甘露糖苷酶处理。
1)未用α-甘露糖苷酶进行处理2)α-甘露糖苷酶进行处理图9显示对用Asahi-Pak NH2-P柱从α-半乳糖苷酶获得的糖链进行结构分析的结果，所述α-半乳糖苷酶已经用纤维单胞菌属SO-5菌株产生的α-甘露糖苷酶进行处理。
图10显示依照本发明获得的纯化的α-半乳糖苷酶的摄入实验(酶活性分析)的结果，所述摄入实验使用来自一名法布莱病患者的培养皮肤成纤维细胞。
图11是一幅照片，显示通过将依照本发明获得的纯化α-半乳糖苷酶给予从一名法布莱病患者获得的培养成纤维细胞，对底物积累的效应。
符号解释GlcNAc，GNN-乙酰葡萄糖胺Man，M甘露糖PA2-氨基吡啶化的实施本发明的最佳模式下面将更详细地解释本发明。
依照本发明生产具有包含磷酸酯的酸性糖链(其中所述糖链可用作转运进入溶酶体的标记性标记)的糖蛋白的方法基本上包括下面步骤。
1)一个步骤是将编码目的糖蛋白的基因引入产生所需磷酸化核心糖链的糖链合成突变体酵母菌株，以表达具有添加了甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白。
2)一个步骤是用α-甘露糖苷酶处理所获得的具有添加了甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白，切除甘露糖部分，由此产生具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链的糖蛋白。
可以用下面方法制备本发明的在对酵母特异性的外部链生物合成基因破坏的突变体酵母菌株。首先，分离破坏靶基因所需的DNA基因片段，酿酒酵母基因组计划(Goffeau等，Nature，387(增刊)，1-105(1997))已经阐明所有靶基因的染色体位置，所述DNA基因片段可以从围绕所述靶基因的任何基因片段分离得到，所述靶基因可以从公共机构例如ATCC(美国典型培养物保藏中心)(ATCC RecombinantDNA materials，第三版，1993)获得。或者，通过常规方法从酿酒酵母提取基因组DNA，然后筛选靶基因，可以获得这些DNA基因片段。可以通过例如Cryer等的方法(Methods in Cell Biology，12，39-44(1975))或P.Philippsen等的方法(Methods Enzymol.，194，169-182(1991))从酿酒酵母中提取基因组DNA。
通过PCR扩增靶基因，然后将其破坏。PCR方法是使用在目的区两端的有义/反义引物组合、热稳定DNA聚合酶和DNA扩增系统，允许在约2-3小时内体外扩增特定DNA片段几十万倍的技术。当使用所述技术扩增靶基因时，使用25-30体的合成单链DNA作为引物，使用基因组DNA作为模板。
根据本发明，可以基本根据Rothstein在Methods Enzymol.，101，202-211(1983)中公开的方法完成靶基因的破坏。该方法包括首先切割或部分缺失质粒上的靶基因，然后插入合适的选择性标记基因DNA，产生其中所述选择性标记夹在所述靶基因上游部分和下游部分之间的构建物，然后将所述构建物引入酵母细胞。通过该程序，重组事件在所引入的片段(夹着所述选择性标记的DNA构建物)两端和染色体上所述靶基因的同源部分之间出现两次，使得染色体上的所述靶基因被所引入的片段取代。
下面将构建一个OCH1基因破坏的菌株作为具体实例来解释。用限制性内切酶从Alani等构建的质粒切除hisG-URA3-hisG盒，所述质粒具有连接URA3基因两端的沙门氏菌属hisG基因DNA片段(Alani等，Genetics，116，541-545(1987))，然后将该盒插入质粒上的靶基因，构建所述破坏基因的等位基因。使用该质粒取代染色体上的靶基因，获得基因被破坏的突变体。插入染色体的URA3基因被两个hisG基因夹在中间，在hisG序列之间的同源重组时该基因和一个拷贝的hisG可能从染色体上除去。染色体上的所述靶基因仍然保留一个拷贝破坏的hisG片段，但宿主细胞具有URA-表型。可以用5-氟乳清酸(5-FOA)完成所述两个hisG基因之间的同源重组。一种ura3突变体对5-FOA有抗性(Boeke等，Mol.Gen.Genet.，197，345-346(1984)；Boeke等，Methods Enzymol.，154，165-174(1987))，但Ura3+表型的酵母菌株不能在5-FOA培养基中生长。因此，可以分离在含5-FOA的培养基中表现抗性性状的菌株，使得能够通过使用所述URA3标记的程序再次操作所述菌株。
然后用同样程序破坏该OCH1基因破坏的菌株的MNN1基因，获得所需的双突变体菌株(Δoch1 Δmnn1)。
酵母Δoch1突变体是添加甘露糖外部链到糖蛋白核心糖链上所需的起始α-1，6连接甘露糖添加反应缺陷的，而Δmnn1突变体是添加α-1，3-连接甘露糖到核心糖链非还原端和外部糖链分支的反应缺陷的。正如本发明的发明人已经提出的(日本专利公开第3091851号)，所述具有两个突变的双突变体(Δoch1 Δmnn1)产生中性核心糖链Man8GlcNAc2，同时除所述中性糖链外产生副产物即包含甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链(Proceedings of the 12th Biotechnology Symposium，第153-157页，10/14/1994，Biotechnology Developmental TechnologyResearch Society)。
用于本发明的酵母菌株必须具有携带甘露糖-6-磷酸酯的糖链。已知所述糖链在酵母中普遍存在。涉及糖链合成的酿酒酵母基因包括催化添加甘露糖-1-磷酸酯到甘露糖位置6上的反应的基因(MNN6)(该基因在图2所示的糖链结构式中用“*”号指示)，以及控制甘露糖-1-磷酸酯添加的基因(MNN4)。
从对数生长期到培养晚期(稳定期)检测到大量包含磷酸酯的糖链。这与控制添加甘露糖-1-磷酸酯的基因(MNN4)的表达模式一致。增强MNN4和MNN6基因的表达可以允许培育包含大量具有甘露糖-6-磷酸酯的糖链的酵母。
酿酒酵母KK4是在MNN4基因启动子区具有突变并且组成型表达MNN4基因的菌株。因此，它包含许多磷酸化糖链。因此，它被认为适于生产具有甘露糖-6-磷酸酯的糖蛋白。
将所述DNA引入细胞和用其转化细胞的方法可以是常规方法，例如用噬菌体载体等感染大肠杆菌(E.coli)细胞，以将所述DNA有效掺入所述宿主细胞。作为使用质粒转化酵母的方法，可以使用通过锂盐处理产生天然摄入DNA的条件而掺入所述质粒的方法，或者使用电将DNA引入所述细胞的方法(Becker和Guarente，MethodsEnzymol.，194，182-187(1991))。
也可以依照常规方法进行上述程序的DNA分离、纯化等，以大肠杆菌为例，可以通过碱/SDS方法和乙醇沉淀提取DNA，随后通过RNase处理、PEG沉淀等纯化DNA。可以通过常用方法例如双脱氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463-5467(1977))确定所述基因的DNA序列。可以利用市场购买的测序试剂盒等容易地确定DNA核苷酸序列。
为产生具有上述糖链的不同物种的糖蛋白，可以构建包含连接到能够在酵母中表达的启动子下游的编码靶糖蛋白基因的基因(cDNA等)，通过同源重组将所述构建物加入作为宿主的上述酵母突变体，或者可以将所述基因引入质粒，用于转化宿主细胞产生转化子，然后通过众所周知的方法培养所述转化子，以允许收集由所述酵母在细胞内或细胞外产生的靶糖蛋白。
在这种情况下，编码靶糖蛋白的基因具有相同的翻译氨基酸序列就足够了。因为人类的密码子使用与酵母不同，所以来自人类的基因通常在酵母中表达欠佳。因此，假如合成一种基因，将其密码子使用转变到酵母系统，那么预期会有更好的表达。基本上使用的基因必须是编码与来自人类的酶相同氨基酸序列的基因，因为不同物种的酶将增加有关抗原性的考虑。
可以应用通常用于培养酵母的常规方法培养所述酵母突变体。可以使用合成培养基(包括氮源、碳源、无机盐、氨基酸、维生素等)，所述合成培养基包含例如从Difco Laboratories获得的各种培养成分，并且缺乏可以根据复制和保留质粒所需的标记提供的氨基酸(Sherman，Methods Enzymol.，194，3-57(1991))。将外源基因掺入染色体而不是质粒将防止排除所述基因并因此允许在普通富含营养的培养基中培养。
可以使用常见的蛋白分离和纯化方法从培养产物(培养物溶液或培养的细胞)中分离和纯化糖蛋白。例如，在糖蛋白存在于细胞内的情况下，完成培养后通过离心分离收集细胞，悬浮于水性缓冲溶液中，然后用超声波破碎仪、French压榨机(French press)、Manton-Gaulin匀浆器、Dynomill等破碎细胞，随后离心所述无细胞提取物，获得上清液。在糖蛋白存在于培养物上清液情况下，完成培养后离心分离细胞，然后通过超滤、盐析等浓缩。可以通过单独或组合使用常规蛋白分离和纯化方法进行随后的程序，获得纯化产物，所述常规蛋白分离和纯化方法例如溶剂萃取、用硫酸铵等盐析、脱盐、用有机溶剂沉淀、用二乙基氨乙基(DEAE)Sepharose等的阴离子交换层析、用磺丙基(SP)Sepharose(Pharmacia)等的阳离子交换层析、用Phenyl Sepharose等的疏水层析、用带有Sephacryl的分子筛等的凝胶过滤、用基团特异性载体、植物凝集素配体、金属鳌合物等的亲和层析、层析聚集或电泳方法例如等电电泳。
根据本发明成功地进行亲和层析，分离具有磷酸化糖链的α-半乳糖苷酶和没有磷酸化糖链的α-半乳糖苷酶。具体地说，使用BlueSepharose层析分离靶糖蛋白。Blue Sepharose使用的亲和配体是Cibacron Blue F3GA，即一类氯三嗪色素，有可能应用允许分离磷酸化糖链的所述色素作为配体的亲和层析，纯化携带包含甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白。
在离子交换、层析聚集或等电电泳中可以利用糖链上依赖于磷酸的电荷差异来纯化和浓缩具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链的糖蛋白，更具体地说，纯化和浓缩下面从甘露糖-1-磷酸酯中除去甘露糖的酵母特异性糖蛋白。
此外，可以利用被认为是识别甘露糖的植物凝集素的伴刀豆凝集素A(ConA)的结合特异性差异用α-甘露糖苷酶切割携带未磷酸化糖链的来自酵母的糖蛋白的糖链，因此降低或消除所述糖蛋白对ConA的亲和力。另一方面，由于在包含磷酸酯的糖链的情况下，甘露糖-6-磷酸酯不被识别为底物，因此不发生对所述糖链的进一步切割，对ConA的亲和力也不降低。可以利用该情况获得具有高生物学活性的纯溶酶体酶样品，所述高生物学活性即细胞摄入活性高，更具体地说是与甘露糖-6-磷酸酯受体的结合活性高，所述纯溶酶体酶样品适于作为高度功能性药用产物。
依照本发明用于除去酵母特异性甘露糖的α-甘露糖苷酶没有具体限制，只要该酶降解甘露糖-1-磷酸酯键、具有外切型活性、作用于糖蛋白并且在需要处理的糖蛋白稳定的pH范围内作用。所述α-甘露糖苷酶具有广泛范围的底物特异性，作用于α-1，2、α-1，3或α-1，6连接的甘露糖苷键，同时也作用于合成底物例如对硝基苯-α-吡喃甘露糖苷或4-甲基伞形基-α-吡喃甘露糖苷。需要使用的可能的α-甘露糖苷酶包括刀豆(Jack Bean)α-甘露糖苷酶和来自酵母液泡的甘露糖苷酶。然而，刀豆α-甘露糖苷酶对糖蛋白糖链具有相对低的酶活性，并且需要长时间的反应，同时其最佳pH也稍稍接近酸性端(pH4.5)。因此，因为在轻微酸性条件下不稳定的蛋白可能被失活，所以该酶被认为不适于通过从糖蛋白去除糖链而获得结构稳定的蛋白。因此，需要提供具有更强酶活性、容易纯化并且可以在糖蛋白稳定的中性pH下作用的新型α-甘露糖苷酶。由本发明的发明人获得的纤维单胞菌属SO-5菌株产生的α-甘露糖苷酶满足这些条件，可以认为是对本发明有效的酶。上述纤维单胞菌属SO-5菌株在2001年6月12日作为FERMBP-7628国际保藏于International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan。
本发明所述产生酶的酵母没有具体限制，只要所述酵母用α-甘露糖苷酶处理时最终产生甘露糖-6-磷酸酯，并且可以产生没有抗原性的糖链。例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇酵母，它产生携带具有甘露糖-1-磷酸酯的糖链的糖蛋白，并且用α-甘露糖苷酶的处理应当产生与芽殖酵母的糖链等价的糖链。
此外，依照本发明产生的溶酶体酶并不特定限制于α-半乳糖苷酶。例如，可以用同样方法表达和纯化下面基因，作为药物应用于治疗和/或预防各种溶酶体疾病编码β-己糖胺酶A(泰萨病的治疗剂)的基因、编码β-己糖胺酶A和B(桑霍夫病的治疗剂)的基因、编码半乳糖脑苷脂酶(克拉贝病的治疗剂)的基因、编码α-艾杜糖苷酸酶(胡尔勒病的治疗剂)的基因、编码β-葡糖苷酸酶(斯赖病的治疗剂)的基因、编码岩藻糖苷酶(岩藻糖苷贮积病的治疗剂)的基因或编码α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Schindler病和Kanzaki病的治疗剂)的基因。
在α-半乳糖苷酶的情况下，可以将其用作法布莱病的治疗剂，以治疗所需量给予α-半乳糖苷酶。这里，治疗所需量指α-半乳糖苷酶的量显著缓解法布莱病症状的量。根据本发明的详细说明，α-半乳糖苷酶具有多种包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链，表现结合甘露糖-6-磷酸酯受体的活性。将α-半乳糖苷酶作为包含标准药学上可接受的稳定剂、等渗溶液等的药用组合物给予，并且，例如，可以将该酶通过常规方法静脉输注给予。依照本发明产生的α-半乳糖苷酶具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖链，所述糖链的量等于或多于从人组织获得的纯化酶样品以及由培养动物细胞或转基因动物产生的重组酶样品，因此能够以更低剂量表现其效应，同时避免病毒等的污染(使用动物组织的药物产生的问题)，以便可以提供稳定和高度功能性的药用组合物。
根据本发明，所述药用组合物除所述糖蛋白外，还可以包含合适的药学上可接受的稳定剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、矫味剂、着色剂、芳香剂等，并且可以制备成为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、微粒剂、散剂等形式。本发明所述药用组合物的剂型可以是口服给药或胃肠外给药，例如静脉注射、肌内注射等。剂量将依赖于患者的年龄、体重和症状以及给药途径，但就对一名成人的活性成分量而言，在口服给药的情况下优选每剂量1-10mg的范围，在胃肠外给药的情况下优选每剂量10-50mg的范围。
本发明不限于溶酶体病的治疗剂，因为本发明还可用作转运糖蛋白到溶酶体的技术。所述技术可用于溶酶体酶转运机制或溶酶体中废物产物降解机制的研究，由此导致相关领域内研究的进一步前进。
下面将通过实施例更详细地解释本发明，所述实施例不是以任何方式限制本发明的技术范围。
构建包含高度磷酸化糖链的糖链生物合成双突变体酵母(酿酒酵母Δoch1 Δmnn1菌株)用BglIII和BamHI从pNK51切割其中沙门氏菌属hisG基因通过直接重复连接到URA3基因两端的盒(HUH)，这已经有报道(Alani等，Genetics，116，541-545(1987))，然后将该盒插入大肠杆菌质粒pSP73中的BamHI位点。将该质粒命名为pSP73-HUH。
OCH1基因位于酵母染色体7上，OCH1基因的DNA核苷酸序列以保藏号D11095在GenBank数据库中注册(Nakayama等，EMBO J.，11，2511-2519(1992))。用SalI和HindIII切割以前构建的破碎OCH1基因的载体poch1∷LEU2-1(Nakayama等，EMBO J.，11，2511-2519(1992))，切下包含Δoch1∷LEU2的区，通过乙酸锂方法(Ito等，J.Bacteriol.，153，163-168(1983))用该区转化产生高度磷酸化糖链的酵母，即酿酒酵母KK4菌株(MATa URA3 his1或his3 trp1 leu2 gal80；Nogi等，Mol.Gen.Genet.，195，29-34(1984))。Δoch1破坏的菌株表现低渗敏感性。因此，将转化细胞铺展在含0.3M KCl的SD-Ura培养基(2％葡萄糖，0.67％Yeast Nitrogen Base w/o氨基酸(Difco)，除尿嘧啶以外的核碱基(nucleobase)以及氨基酸混合物(20-400mg/L))平板上，30℃下培养2天，获得转化子。
从所述转化子制备基因组DNA，通过PCR证实尿嘧啶标记整合进染色体的Δoch1区。该转化子命名为HPY11菌株。
MNN1因位于酵母染色体5着丝粒附近，MNN1基因的DNA核苷酸序列以保藏号L23753注册于GenBank数据库(Yip等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9，2723-2727(1994))。通过PCR用引物A(GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGTSEQ ID NO1)和引物B(GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGCSEQID NO2)扩增MNN1基因的3′区，通过PCR用引物C(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTCSEQ IDNO3)和引物D(GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAATSEQ IDNO4)扩增该基因的5′区。将获得的DNA片段加入携带HIS3标记的质粒pHYH中的SphI位点，构建pHYHΔmnn1。为使用所述HUH盒破坏MNN1基因，从pHYHΔmnn1获得1.8kb SphI片段，然后插入pSP73-HUH的SphI位点，构建pSP73-Δmnn1∷HUH。在需要线性化的NotI位点切割该质粒，通过乙酸锂方法用于转化菌株HPY11。转化后，将细胞铺展在含0.3M KCl的SD-Ura培养基平板上，在30℃下培养2天，获得转化子。
从所述转化子制备基因组DNA，通过PCR证实尿嘧啶标记整合入该染色体的MNN1区。该转化子命名为HPY22菌株。从该菌株开始，在含0.3M KCl和5-FOA的YSD培养基(1％酵母提取物，2％葡萄糖，腺嘌呤(40mg/L)，尿嘧啶(20mg/L))内进行选择，由此获得URA3基因缺陷性菌株。以上述同样方式，通过PCR证实缺乏URA3基因的mnn1破坏菌株。包含Δoch1∷LEU2 Δmnn1∷hisG的该菌株命名为包含高度磷酸化糖链的双突变体酵母菌株酿酒酵母HPY21。
将α-半乳糖苷酶基因引入Δoch1Δmnn1双破坏菌株人α-半乳糖苷酶基因的序列作为NM000169在GenBank数据库注册(Nucleic Acids Res.17(8)，3301-3302(1989))。用EcoRI切割以前报道的pCXN2(在Ishii等，Hum.Genet.89，29-32(1992))，切出人α-半乳糖苷酶的cDNA区(-16到+1290；SEQ ID No5)。为在酵母中表达的目的，然后将其插入酵母表达载体质粒YEP352-GAP的EcoRI位点。得到的质粒命名为YEP352-GAP-GLN。然后用BamHI从所述质粒切下包括启动子和终止子区在内的编码人α-半乳糖苷酶的cDNA区，插入整合载体pRS404的BamHI位点。用Bst1107I切割该质粒pRS-GLN-4后，用其转化在实施例1中构建的酿酒酵母HPY21菌株。通过乙酸锂方法进行所述转化。转化后，将细胞铺展在含0.3M KCl的SD-Trp培养基(2％葡萄糖，0.67％Yeast Nitrogen Base w/o氨基酸(Difco)，核碱基/除色氨酸外的氨基酸的混合物(20-400mg/L))平板上，在30℃下培养2天，获得转化子酿酒酵母HPY21G。
在30℃下5ml含0.3MKCl的YPAD培养基(2％聚胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，腺嘌呤(40mg/L))中培养所述酿酒酵母HPY21G菌株3天，然后离心收集培养物上清液。使用超滤膜(Ultrafree C3LGC(分子量截断值10,000)，Millipore)获得作为粗酶溶液的约5倍浓缩物。该粗酶溶液根据常规方法用SDS样品缓冲液变性，然后接受蛋白质印迹分析。蛋白质印迹分析使用兔抗α-半乳糖苷酶抗体作为第一抗体，抗兔Ig抗体/碱性磷酸酶复合物作为第二抗体，通过使用CDP-Star系统(Pierce)的X-射线底片曝光进行检测。
结果用对照菌株HPY21完全没有检测到信号，而在转化子HPY21G的培养物上清中在约50kDa分子量证实有信号(图5)。
测定所述粗酶溶液中的α-半乳糖苷酶活性。将10μl酶溶液加入60μl 0.15M乙酸缓冲液(pH4.6)中的5mM 4-甲基伞基-D-吡喃半乳糖苷后，使所述混合物在37℃反应30分钟。在所述混合物中加入700μl 0.2M甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(pH10.7)，终止反应。然后使用荧光光度计(Ex365nm，Em450nm)测量所述反应混合物。结果与使用来自对照菌株HPY21的粗酶溶液作为酶来源相比，当使用来自菌株HPY21G的粗酶溶液作为酶来源时，荧光显著增加(表1)。
表1 粗酶溶液中的α-半乳糖苷酶活性
从引入α-半乳糖苷酶基因的菌株的培养物上清液中纯化α-半乳糖苷酶，并分析所纯化的酶的糖链结构以实施例2的相同方式培养引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G并制备其粗酶溶液。将所述粗酶溶液调节到pH4.5，用BlueSepharose CL-6B(Pharmacia)进行柱层析。用乙酸钠缓冲液(pH4.5)洗涤后，用含4M NaCl的MES缓冲液(pH6.0)进行洗脱。测定每个组分的酶活性后，检测柱流通组分和洗脱组分中的α-半乳糖苷酶活性。将各组分应用于ConA Sepharose。用含0.15M氯化钠，0.5mM氯化钙和0.5mM氯化镁的MES缓冲液(pH6.0)洗涤后，用含0.15M氯化钠，0.5mM氯化钙，0.5mM氯化镁和0.2Mα-甲基甘露糖苷的MES缓冲液(pH6.0)洗脱。然后将洗脱组分上样到MonoQ。用MES缓冲液(pH6.0)洗涤后，用含1MNaCl的MES缓冲液进行梯度洗脱。透析有强酶活性的组分，然后浓缩获得纯化的α-半乳糖苷酶制备物。
用酶处理获得的α-半乳糖苷酶，获得连接天冬酰胺的糖链。将糖链的冻干产物溶解于100μl N-糖苷酶F缓冲液(含0.5％SDS和0.35％2-巯基乙醇的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0))，然后煮沸所述溶液5分钟。冷却到室温后，加入50μl 7.5％Noridet P-40、138μl H2O和12μl N-糖苷酶F(Behringer)。然后在37℃下处理所述混合物16小时。用BioRad AG50W-X8柱进行脱盐，获得糖链制备物。
执行下面程序，荧光标记(吡啶基胺化，下文简写为“PA”)得到的糖链。浓缩所述糖链制备物到干燥，然后在其中加入40μl偶联试剂(在200μl乙酸中含552mg 2-氨基吡啶的溶液)。密封所述混合物，在90℃处理60分钟。冷却到室温后，加入140μl还原剂(在50μlH2O和80μl乙酸中含200mg硼烷/二甲基胺复合物的溶液)。密封所述混合物，在80℃处理80分钟。反应后，用TOYOPEARL HW-40F(TOSOH)进行凝胶过滤，除去未反应的2-氨基吡啶。用0.22μm滤器过滤所述糖链组分，由此制备PA-寡糖制备物。
根据本发明的发明人提议的方法(未经审查的日本专利公开第9-135689号)分析所述糖链结构。应用装备氨基柱的HPLC，有可能根据链长度分离PA-寡糖，并且由于磷酸酯与氨基柱强吸附引起的洗脱时间延迟，还有可能分离磷酸化的糖链和未磷酸化的糖链。使用Asahipak NH2P-50氨基柱(4.6×250mm)作为柱子。使用的溶剂是200mM乙酸-三乙胺(pH7.2)作为溶剂A，乙腈作为溶剂B。事先以1.0ml/分钟的流速流过30％溶剂A和70％溶剂B，平衡柱子。以1.0ml/分钟的流速进行洗脱，在50分钟内线性梯度从70％溶剂B开始直到20％溶剂B，然后洗脱PA-寡糖。结果显示于图6。在约20分钟(峰A)洗脱用Blue Sepharose洗脱组分中α-半乳糖苷酶制备的糖链，而在约30分钟(峰B)和约38分钟(峰C)洗脱用Blue Sepharose流出组分内α-半乳糖苷酶制备的糖链。
峰A在与Man8GlcNAc2-PA相同的位点洗脱出。这指出它是具有未添加磷酸酯的Man8GlcNAc2结构的糖链。峰B和峰C的洗脱点指出峰B是具有一个分子甘露糖-1-磷酸酯的糖链，峰C是具有两分子甘露糖-1-磷酸酯的糖链。根据下文描述的方法，通过碱性磷酸酶处理进一步证实峰B和峰C的结构。
这些结果证明其中已经引入α-半乳糖苷酶基因的包含高度磷酸化糖链的酵母糖链生物合成双突变体菌株HPY21G产生具有糖链的α-半乳糖苷酶，所述糖链是添加磷酸酯的高甘露糖型糖链(Man-P)2-Man8GlcNAc2和(Man-P)-Man8GlcNAc2以及高甘露糖型糖链Man8GlcNAc2，比例约为1∶1∶1。
已知Blue Sepharose层析能够分离具有磷酸化糖链的α-半乳糖苷酶以及没有磷酸化糖链的α-半乳糖苷酶。
分析反应产物(峰B和C)(图6)，确认它们是否是添加甘露糖-1-磷酸酯的产物。首先，对已经通过NMR证实结构的化合物(图3，结构式II、III和IV)进行HPLC，由此具有结构式II和III的化合物在约30分钟洗脱。因此，得出结论在活性测定中出现的峰B也包含具有一个分子甘露糖-1-磷酸酯的糖链。具有两分子甘露糖-1-磷酸酯的结构式IV的洗脱点比该峰晚很多，因此假设峰C是具有两分子甘露糖-1-磷酸酯的糖链。
为直接证实峰B代表具有一分子甘露糖-1-磷酸酯的糖链，分级分离峰B，用刀豆α-甘露糖苷酶消化，从甘露糖-1-磷酸酯残基上切下甘露糖部分。通过冻干除去所述分级分离组分中的溶剂，然后加入在乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的60mU刀豆α-甘露糖苷酶(SeikagakuCorp.)，在37℃过夜。如图7b所示，结果在比原始糖链更迟的一点洗脱。在接受碱性磷酸酶处理时，洗脱出现在与Man4GlcNAc2-PA相同的点，指出用刀豆α-甘露糖苷酶处理的糖链具有结构PO4-Man4GlcNAc2-PA。峰C也以同样方式进行刀豆α-甘露糖苷酶处理和碱性磷酸酶处理，和峰B一样，洗脱出现在更迟的一点。此外，清楚地证明峰C代表图3中结构式IV显示的酸性糖链，因为当仅接受碱性磷酸酶处理时，它在Man6GlcNAc2-PA的同一点洗脱(图7d)。
上面结果指出接受测试的菌株适于产生具有添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白，作为有效的具有添加甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白的前体。
来自纤维单胞菌属SO-5的α-甘露糖苷酶以及污染酶的活性测定当从土壤细菌筛选新型产生α-甘露糖苷酶的细菌时，本发明的发明人通过使用α-甘露聚糖作为底物的反应，并随后测量游离糖的还原能力，测定甘露聚糖降解活性。具体地说，在含α-甘露聚糖(最终浓度0.1％)和酶溶液的反应溶液(0.4M磷酸缓冲液，pH7.0)中37℃下进行反应10分钟，然后使用甘露糖作为标准，通过Nelson-Somogyi方法测定还原性糖(Sakuzo Fukui，Seibutukagaku-jikkenhou Series 1，“Kangentou no teiryouhou(还原性糖定量方法)”(Gakkai shuppanCenter)，第10页(1979))。
通过使用4-甲基伞形基(MU)-α-吡喃甘露糖苷作为底物的反应，然后测量游离4-MU，测定粗酶和每个纯化阶段部分纯化酶的α-甘露糖苷酶活性。具体地说，在含0.5mM 4-MU-α-吡喃甘露糖苷和酶溶液的70μl反应溶液(含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液，pH7.5)中37℃下进行反应30分钟。随后，在所述混合物中加入700μl 0.2M甘氨酸缓冲液(pH10.7)，终止反应。取其100μl等分物样，用微量培养板读板器(Ex385nm，Em450nm)测量游离4-MU的荧光。对于酶活性，在该反应中每1分钟释放1μmol 4-MU的酶量定义为一单位(下文表示为“U”)。
如下测定共存的污染酶。
通过使用α-1，6-甘露聚糖作为底物的反应，然后测量游离糖的还原能力，测定内切-α-甘露糖苷酶活性。具体地说，在含α-1，6-甘露聚糖(终浓度0.1％)和酶溶液的反应溶液中37℃下反应10分钟，然后使用甘露糖作为标准，通过Nelson-Somogyi方法测定还原性糖(SakuzoFukui，Seibutukagaku-jikkenhou Series 1，“Kangentou no teiryouhou(还原性糖定量方法)”(Gakkai shuppan Center)，第10页(1979))。
通过使用对硝基苯(pNP)-β-D-吡喃甘露糖苷作为底物的反应，然后测量游离pNP，测定β-甘露糖苷酶活性。具体地说，在含5mMpNP-β-D-吡喃甘露糖苷和酶溶液的70μl反应溶液(含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液，pH7.5)中37℃下进行反应24小时。随后在所述混合物中加入700μl 0.2M甘氨酸缓冲液(pH10.7)，终止反应。取其100μl等分物样，用微量培养板读板器(Ex385nm，Em450nm)测量游离4-MU的荧光。对于酶活性，在该反应中每1分钟释放1μmol4-MU的酶量定义为一单位(下文表示为“U”)。
筛选产生α-甘露糖苷酶的细胞以下面方式制备用于诱导产生甘露糖苷酶的培养基(甘露聚糖液体培养基。在2g baker’s酵母甘露聚糖，500mg硫酸铵[(NH4)2SO4]，20mg硫酸铁(II)[Fe2SO4]，400mg硫酸镁[MgSO4·7H2O]，60mg氯化钙[CaCl2·2H2O]，1g酵母提取物，7.54g磷酸氢二钾[K2HPO4]和2.32g单磷酸钾[KH2PO4]的混合物中加水到1L体积。在上述甘露聚糖液体培养基中加入琼脂粉达到1.5％的浓度，制备用于分离产生甘露糖苷酶的细胞的平板培养基。
用接种环将土壤悬浮液中的细胞接种到含2ml甘露聚糖液体培养基的试管中，30℃下震荡培养2个晚上。用接种环再次将所述培养物接种到2ml新鲜的甘露聚糖液体培养基中，继续在30℃下震荡培养两个晚上。总共三个循环的两夜震荡培养后，进行两次震荡培养过夜。离心培养物，上清液对10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，获得粗酶溶液，然后测定粗酶溶液的甘露聚糖降解酶活性。进一步筛选表现所述活性的土壤样品中产生α-甘露糖苷酶的菌株。
通过划线法和稀释法将所述活性培养物接种到平板上，在30℃培养。几天后，检取出现的集落，接种到甘露聚糖液体培养基，30℃下震荡培养两夜。离心所述培养物，上清液对10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，获得粗酶溶液，然后使用α-甘露聚糖和合成底物测定所述粗酶溶液的酶活性。
重复该程序几个循环后，检取清晰的单集落，分离合乎标准的产生α-甘露糖苷酶的菌株。得到的生产菌株命名为SO-5。所述SO-5于2001年6月12日以保藏号FERM BP-7628国际保藏于InternationalPatent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)。
鉴定新型产生α-甘露糖苷酶的菌株SO-5核糖体RNA基因的核苷酸序列同源性在分子系统演化和分类学上是重要的。核糖体RNA基因的构型和拷贝数量根据生物物种的不同而不同。这允许技术人员根据核糖体RNA的核苷酸序列鉴定细菌。
使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega)从菌株SO-5分离基因组DNA。使用所述基因组DNA作为PCR扩增编码核糖体RNA区的核苷酸序列的模板DNA。使用的引物是SPF1(AGAGTTTGATCCTGGCTCAGSEQ ID No5)和SPR1(GGTTACCTTGTTACGACTTSEQ ID No6)。将得到的约1.5kb片段克隆进PGEM-T载体(Promega)，然后通过双脱氧方法部分确定核苷酸序列。结果显示于SEQ ID No7。
使用BLAST系统对该序列进行同源性搜索，所述BLAST系统可以在Japanese DNA Databank网站上获得。结果指出该序列与溶黄嘌呤厄氏菌(Oerskovia xanthineolytica)和纤维单胞菌属都有高同源性。已知厄氏菌属(Oerskovia)形成分支集落，而SO-5形成一般的圆形集落。这提示菌株SO-5是一种纤维单胞菌属菌种。
生产和部分纯化α-甘露糖苷酶为诱导产生α-甘露糖苷酶，参考实施例2中获得的菌株SO-5在甘露聚糖培养基中30℃下培养过夜。培养后，在4℃，15,000xg下离心10分钟，去除细胞。上清液对含2mM氯化钙的10mM HEPES-Na缓冲液(pH7.0)透析，获得粗酶溶液。
然后在所述粗酶溶液中加入硫酸铵达到1.2M的终浓度，4℃下混合过夜。离心后，将上清液与沉淀分开，加入硫酸铵达到1.7M的终浓度，然后继续在4℃下混合过夜。所述混合物在4℃下15,000xg离心10分钟，收集沉淀的蛋白。获得的沉淀溶解于H2O，对含2mM氯化钙的10mM HEPES-Na缓冲液(pH7.0)透析。然后将其上样到用含2mM氯化钙的10mM HEPES-Na缓冲液(pH7.0)平衡的HiTrap Q柱。用增加直到1M的NaCl进行梯度洗脱，由此获得活性组分。将该组分对含2mM氯化钙的10mM HEPES-Na缓冲液(pH7.0)透析，获得部分纯化的样品。
根据参考实施例1的程序，测定所述部分纯化的制备物中的α-甘露糖苷酶活性、内切α-甘露糖苷酶活性和β-甘露糖苷酶活性。比活是31.9mU/mg，没有检测到内切α-甘露糖苷酶活性或β-甘露糖苷酶活性。
来自纤维单胞菌属的α-甘露糖苷酶的酶学活性对参考实施例4中获得的纯化酶进行下面检查。
(a)最佳pH通过分别使用乙酸钠缓冲液(pH4.0-6.5)、磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)和Tris缓冲液(pH7.5-10.0)，在37℃下酶反应30分钟，测试所述酶。确定最佳pH是pH7-8，尤其是约7.5。
(b)最佳温度通过在磷酸盐缓冲液(PH7.5)内20-80℃之间的不同温度反应30分钟，测试所述酶。确定最佳温度是35-45℃，尤其是约40℃。
(c)稳定温度所述酶在0-80℃范围内在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中处理30分钟，然后通过37℃下酶反应30分钟检查残余活性(相对活性)。该酶在直到40℃都是稳定的。
(d)金属离子效应将无机离子和抑制剂加入反应系统中，37℃下酶反应30分钟后，检测它们对所述酶的效应。通过加入Ca2+产生轻微激活(10％)。加入Hg2+和乙二胺四乙酸(EDTA)100％抑制活性，但加入Ca2+则恢复活性。
(e)米氏常数通过用底物浓度倒数对反应速率倒数作图，确定该酶对4-MU-α-吡喃甘露糖苷的米氏常数(Km)。Km是0.32mM-1。用高浓度底物(≥1mM)观察到底物抑制。
(f)对高甘露糖糖链的作用使用装备氨基柱的HPLC，根据链长度可分离荧光标记(PA)的寡糖。使用的柱子是SHODEX AsahiPakNH2P-50(4.6×250mm，Showa Denko)。制备如下的混合物作溶剂200mM乙酸-三乙胺缓冲液(PH7.0)和乙腈的30∶70混合物作为溶剂A，200mM乙酸-三乙胺缓冲液(pH7.0)和乙腈的50∶50混合物作为溶剂B。事先用溶剂A以流速1.0ml/分钟流过，平衡柱子，进样后立即在50分钟内将溶剂B的比例线性增加到100％，洗脱PA-寡糖。使用荧光检测器(激发波长320nm，荧光波长400nm)检测PA-寡糖。37℃下在含100pmol糖链的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入20μU本发明的酶组分处理10分钟到2小时。当使用下面结构式的Man8GlcNAc2-PA(M8)作为底物时 该底物相当快速地降解为Man5GlcNAc2-PA(M5)，然后缓慢产生Man4GlcNAc2-PA(M4)以及少量Man2GlcNAc2-PA(M2)。反应2小时后，除Man4GlcNAc2-PA外，还观察到代表Man3GlcNAc-PA(M3)、Man2GlcNAc2-PA(M2)和Man1GlcNAc2-PA(M1)的3个峰。这指出，该酶非特异性地作用于非还原端的α-甘露糖苷键，包括α-1，2-甘露糖苷键、α-1，3-甘露糖苷键和α-1，6-甘露糖苷键。根据这些结果，还预测不会同时存在内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。
(g)对具有β-甘露糖苷键的糖链的作用使用对硝基苯-β-D-甘露糖苷作为底物没有观察到活性，由此指出该酶不作用于β-甘露糖苷。
(h)对酵母中含磷酸酯的酸性糖链的作用已知由酵母产生的糖链的一个例子是含磷酸酯的糖链(Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.，56，915-944(1987))。检查对具有下面结构式所示结构的糖链的作用。
使用SuperQ 5PW(Toso)进行分析。制备以下溶剂2mM乙酸钠缓冲液(PH5.0)作为溶剂A，0.25M乙酸钠缓冲液(pH5.0)作为溶剂B。事先用溶剂A以流速1.0ml/分钟流过，平衡柱子，进样后立即在30分钟内将溶剂B的比例线性增加到100％，洗脱PA-寡糖。在含100pmol糖链的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入20μU酶组分，37℃过夜。由于磷酸酯基团的负电荷增加，因此已经切除连接磷酸酯的甘露糖的糖链在延迟的保留时间洗脱。对照糖链(未经酶处理)在约10分钟洗脱，而暴露于酶的那些糖链在12分钟后出现另一个峰。由于该洗脱点匹配其中连接磷酸酯的甘露糖已经通过化学处理从结构式6的糖链上去除的糖链的洗脱点。因此证明该酶能够切割连接磷酸二酯的α-甘露糖。
对糖蛋白的作用已知核糖核酸酶B(RNase B)是一种携带高甘露糖型糖链的糖蛋白。在参考实施例2中获得的100μUα-甘露糖苷酶组分加入20μg核糖核酸酶B中，反应在0.1M磷酸钾缓冲液(PH7.0)存在下于37℃进行14小时。作为对照，仅加入等量缓冲液而不是α-甘露糖苷酶组分。在通过SDS-PAGE逐一进行分析时，添加α-甘露糖苷酶组分的样品与对照相比表观分子量降低。该表观分子量接近具有相同肽序列并且仅缺乏糖链的核糖核酸酶A(RNase A)的表观分子量。在测定核糖核酸酶活性时，事实上与反应前相比没有发现活性降低。这提示，所述添加酶组分的样品仅切割所述高甘露糖型糖链的α-甘露糖苷键部分，而保留所述糖链的Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc根部分，对蛋白部分没有影响。
用不同α-甘露糖苷酶进行的消化实验用不同α-甘露糖苷酶处理实施例3中获得的α-半乳糖苷酶，确定所述α-甘露糖苷酶是否作用于糖蛋白并且能够降解所述糖链的甘露糖-1-磷酸酯键。
在实施例3中纯化的1mgα-半乳糖苷酶中加入乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的2mU刀豆α-甘露糖苷酶(Seikagaku Corp.)，反应在37℃下进行过夜。对α-半乳糖苷酶的蛋白质印迹分析显示与未处理的α-甘露糖苷酶相同的迁移率。对该糖链的结构分析结果指出，该糖链中的甘露糖-1-磷酸酯键没有受到切割。因此得出结论，在这些条件下甘露糖-1-磷酸酯键不被切割。
因此考虑有必要筛选新型甘露糖苷酶。尝试使用来自如上文所述的纤维单胞菌属SO-5的α-甘露糖苷酶切割甘露糖-1-磷酸酯键。
在实施例3纯化的1mgα-半乳糖苷酶内加入90μU来自上述纤维单胞菌属SO-5的α-甘露糖苷酶后，反应在37℃下进行过夜。对α-半乳糖苷酶的蛋白质印迹分析显示比未处理的α-甘露糖苷酶更大的迁移率(图8)。如实施例3同样方式对所述α-半乳糖苷酶的糖链进行的结构分析结果指出，所述糖链的甘露糖-1-磷酸酯键受到切割，并且洗脱点与暴露的磷酸酯基团的洗脱点一致(图9)。
此外，由于进一步用碱性磷酸酶处理后洗脱出现在与Man6GlcNAc2-PA的同一点，因此证明通过用α-甘露糖苷酶处理获得的糖链具有(PO4)2Man6GlcNAc2-PA或PO4-Man4GlcNAc2-PA的结构。
大规模制备包含高度磷酸化糖链的α-半乳糖苷酶制备大量具有高度磷酸化糖链的α-半乳糖苷酶。在实施例3纯化的300μgα-半乳糖苷酶中加入磷酸缓冲液(pH7.5)中30mU上述来自纤维单胞菌属SO-5的α-甘露糖苷酶，反应在37℃下进行6小时，然后加入30mUα-甘露糖苷酶，继续反应12小时。反应后，使用MonoQ柱进行纯化。在组分15-18收集α-半乳糖苷酶活性，在组分26-29收集α-甘露糖苷酶活性。
使用来自法布莱病患者的培养的皮肤成纤维细胞对纯化的α-半乳糖苷酶进行摄取实验在37℃，5％CO2下，在3.5cm直径碟内补充10％FCS的Ham’sF10培养基中培养来自法布莱病患者的培养的皮肤成纤维细胞(F377，F87)。然后，在所述培养物中加入实施例5中甘露糖苷酶处理的α-半乳糖苷酶或者未接受处理的α-半乳糖苷酶直到0.1μg/ml或1μg/ml的终浓度，18小时后，收集细胞，测定细胞提取物中的α-半乳糖苷酶活性。作为对照，还测定来自正常个体的培养的皮肤成纤维细胞(F592)的细胞内活性。在抑制实验中，为证实依赖于甘露糖-6-磷酸酯受体的摄取，在所述培养物中加入甘露糖-6-磷酸酯达到5mM的终浓度。结果显示于图10。
当加入α-半乳糖苷酶达到1μg/ml的终浓度时，与使用未经甘露糖苷酶处理的酶相比，使用处理过的酶使来自法布莱病患者的细胞中α-甘露糖苷酶活性增加到约3倍。此外，由于甘露糖-6-磷酸酯抑制酶活性的增加，因此用甘露糖苷酶处理的α-半乳糖苷酶明显地以依赖于甘露糖-6-磷酸酯受体的方式被摄入细胞。这提示，所述用甘露糖苷酶处理的α-半乳糖苷酶具有与人类酶相同的携带甘露糖-6-磷酸酯的糖链结构。
然后，在Nunc的8室载玻片上每室接种5×103个来自法布莱病患者的培养的皮肤成纤维细胞(F377)，然后培养24小时，加入α-半乳糖苷酶达到1μg/ml。作为对照，用来自一名健康人的培养的皮肤成纤维细胞(F592)进行同样程序。培养18小时或5天后，使用针对累积的globotriosylceramide(CTH)作为第一抗体，进行免疫荧光染色(图11)。
通过免疫染色检查在所述培养物中加入α-半乳糖苷酶对来自法布莱病患者的培养的皮肤成纤维细胞中CTH积累的效应(图11的右边酶(+))。通过用抗CTH抗体作为第一抗体处理，然后用FITC-抗鼠IgG抗体作为第二抗体染色，检测CTH，显色为绿色。通过用抗α-半乳糖苷酶抗体作为第一抗体和Cy3-抗兔IgG抗体作为第二抗体进行处理，检测细胞内α-半乳糖苷酶，显色为红色。两种颜色合并的区域表现为黄色。为进行比较，在左边(酶(-))显示来自一名健康人的培养的皮肤成纤维细胞的染色，以及来自法布莱病患者的未受处理的培养的皮肤成纤维细胞的α-半乳糖苷酶的染色。
结果，加入用甘露糖苷酶处理的α-半乳糖苷酶使得用抗CTH抗体的染色5天后明显降低。此外，由于α-半乳糖苷酶在添加后18小时被摄入细胞中，并且染色甚至在5天后仍然存在，因此推断其高度稳定。累计的CTH被降解的事实提示，依照本发明产生的α-半乳糖苷酶作为溶酶体病的治疗剂是有效的。
工业应用性根据本发明通过使用酵母的遗传工程的方法允许大量和高纯度地生产具有包含磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白，其中所述糖链可以作为转运进入哺乳动物细胞如人的溶酶体中的标记性标记。依照本发明的具有包含磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白可以用作有效治疗例如人类溶酶体酶缺陷的药物。
在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用完整地结合到本文中。
序列表<110>National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research<120>药用组合物及其制备方法<130>PH-1592-PCT<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增MNN1基因3′区的引物A<400>1ggatccgaag aaaacctaat acattgaagt 30<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增MNN1基因3′区的引物B
<400>2gcatgccctt tggtttaata taaatctccg gagtgc36<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增MNN1基因5′区的引物C<400>3gcatgctaca taactccaat cagcagcaaa tatgtc36<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增MNN1基因5′区的引物D<400>4gcggccgcgt gttctgttcg ggtaacgttt aaaccaat 38<210>5<211>1306<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(17)(1306)
<400>5tccggtcacc gtgacaatgc agctgaggaa cccagaacta catctgggct gcgcgcttgc 60gcttcgcttc ctggccctcg tttcctggga catccctggg gctagagcac tggacaatgg 120attggcaagg acgcctacca tgggctggct gcactgggag cgcttcatgt gcaaccttga 180ctgccaggaa gagccagatt cctgcatcag tgagaagctc ttcatggaga tggcagagct 240catggtctca gaaggctgga aggatgcagg ttatgagtac ctctgcattg atgactgttg 300gatggctccc caaagagatt cagaaggcag acttcaggca gaccctcagc gctttcctca 360tgggattcgc cagctagcta attatgttca cagcaaagga ctgaagctag ggatttatgc 420agatgttgga aataaaacct gcgcaggctt ccctgggagt tttggatact acgacattga 480tgcccagacc tttgctgact ggggagtaga tctgctaaaa tttgatggtt gttactgtga 540cagtttggaa aatttggcag atggttataa gcacatgtcc ttggccctga ataggactgg 600cagaagcatt gtgtactcct gtgagtggcc tctttatatg tggccctttc aaaagcccaa 660ttatacagaa atccgacagt actgcaatca ctggcgaaat tttgctgaca ttgatgattc 720ctggaaaagt ataaagagta tcttggactg gacatctttt aaccaggaga gaattgttga 780tgttgctgga ccagggggtt ggaatgaccc agatatgtta gtgattggca actttggcct 840cagctggaat cagcaagtaa ctcagatggc cctctgggct atcatggctg ctcctttatt 900catgtctaat gacctccgac acatcagccc tcaagccaaa gctctccttc aggataagga 960cgtaattgcc atcaatcagg accccttggg caagcaaggg taccagctta gacagggaga 1020caactttgaa gtgtgggaac gacctctctc aggcttagcc tgggctgtag ctatgataaa 1080ccggcaggag attggtggac ctcgctctta taccatcgca gttgcttccc tgggtaaagg 1140agtggcctgt aatcctgcct gcttcatcac acagctcctc cctgtgaaaa ggaagctagg 1200gttctatgaa tggacttcaa ggttaagaag tcacataaat cccacaggca ctgttttgct 1260tcagctagaa aatacaatgc agatgtcatt aaaagactta ctttaa 1306<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物SPF1
<400>6agagtttgat cctggctcag 20<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物SPR1<400>7ggttaccttg ttacgactt 19<210>8<211>619<212>DNA<213>纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)<400>8ggatgaaggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgcaa gtgacggtac 60ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaac 120gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tggtgtgaaa 180actcgaggct caacctcgag cttgcatcgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag 240actggaattc ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa 300ggcaggtctc tgggccgcaa ctgacgctga ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt 360agataccctg gtagtccatg ccgtaaacgt tgggcactag gtgtggggct cattccacga 420gttccgtgcc gcagcaaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa 480aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc 540aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat gcacgggaag ccaccagaga tggtggtctc 600tttggacact cgtgcacag 619
权利要求
1.一种使用酵母生产活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链。
2.权利要求1的方法，其中所述具有甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链可以结合甘露糖-6-磷酸酯受体。
3.一种使用酵母生产活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖链，其中所述高甘露糖型糖链显示于下面结构式I到VIII
4.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述酵母包含酸性糖链，并且使用的所述酵母菌株中至少α-1，6-甘露糖基转移酶基因已经被破坏。
5.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述酵母包含酸性糖链，并且使用的所述酵母菌株中至少α-1，6-甘露糖基转移酶基因和α-1，3-甘露糖基转移酶基因已经被破坏。
6.权利要求4或5的方法，其中所述α-1，6-甘露糖基转移酶基因是酿酒酵母(S.cerevisiae)的OCH1基因，所述α-1，3-甘露糖基转移酶基因是酿酒酵母的MNN1基因。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述酵母是含高度磷酸化糖链的突变体。
8.权利要求7的方法，其中所述酵母是酿酒酵母菌株HPY21。
9.权利要求1到8中任一项的方法，其中所述具有携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链的活性形式糖蛋白是一种溶酶体酶。
10.权利要求9的方法，其中所述溶酶体酶是α-半乳糖苷酶。
11.权利要求10的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的结构基因是来自人类的基因。
12.权利要求11的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的结构基因具有SEQ.ID.No5表示的核苷酸序列。
13.权利要求10到12中任一项的方法，其中生产所述α-半乳糖苷酶的酵母是菌株HPY21G。
14.权利要求1到13中任一项的方法，所述方法允许α-甘露糖苷酶作用于由权利要求4到8中任一项定义的酵母产生的糖蛋白，从而从糖链中的甘露糖-1-磷酸酯键除去甘露糖残基。
15.权利要求14的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有从甘露糖-1-磷酸酯键除去甘露糖残基的活性。
16.权利要求14或15的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有非特异性破坏α-1，2-甘露糖苷键、α-1，3-甘露糖苷键和α-1，6-甘露糖苷键的活性。
17.权利要求16的方法，其中所述α-甘露糖苷酶活性是外切型活性，并且不包含内切型活性。
18.权利要求17的方法，其中所述α-甘露糖苷酶是来自纤维单胞菌属(Cellulomonas)细菌的α-甘露糖苷酶。
19.权利要求18的方法，其中所述纤维单胞菌属细菌是纤维单胞菌SO-5。
20.一种糖蛋白，所述糖蛋白由酵母产生而且具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链。
21.权利要求20的糖蛋白，所述糖蛋白是一种溶酶体酶。
22.权利要求20或21的糖蛋白，所述糖蛋白是用权利要求1到19中任一项的方法产生获得的。
23.权利要求21或22的糖蛋白，所述糖蛋白是α-半乳糖苷酶。
24.权利要求23的糖蛋白，所述糖蛋白是由人类基因编码的α-半乳糖苷酶。
25.权利要求20的糖蛋白，所述糖蛋白具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖链结构的糖链，其中所述糖链显示于下面结构式I到VIII
26.一种用于治疗和/或预防溶酶体病的药用组合物，所述组合物包含依照权利要求20到25中任一项的糖蛋白。
27.权利要求26的药用组合物，所述药用组合物用于治疗法布莱病，其中所述糖蛋白是人α-半乳糖苷酶。
全文摘要
一种生产具有包含甘露糖－6－磷酸酯的酸性糖链的溶酶体酶的方法，所述方法的特征在于包括在培养基中培养通过将溶酶体酶引入酵母糖链合成酶变体而获得的酶细胞，从所述培养物收集具有包含磷酸酯的糖链的溶酶体酶，然后用α－甘露糖苷酶处理所述酶；以及用所述方法产生的用于治疗人类溶酶体酶缺陷的药用组合物。使用上述酶，利用遗传工程技术可大量和高纯度生产具有包含磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白，所述酸性糖链可以用作转运进入哺乳动物例如人的细胞内溶酶体的标记性标志。可以利用上述具有包含磷酸酯的酸性糖链的糖蛋白作为有效治疗人类溶酶体酶缺陷等的药物。
文档编号A61P43/00GK1541275SQ0281580
公开日2004年10月27日 申请日期2002年6月14日 优先权日2001年6月14日
发明者竹内诚, 典, 千叶靖典, 地神芳文, 文, 樱庭均, 男, 小林和男 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所, 财团法人东京都医学研究机构