专利名称：人参皂苷Rb的制作方法
技术领域：
本发明涉及人参皂苷Rb3在制备治疗或预防脑血管疾病的药物中的应用。
背景技术：
随着人口老龄化进程的加速以及生活方式的改变，心脑血管疾病已成为一个全球性的健康问题，脑血管意外的死亡率在世界范围分别居第3位，极大的危害人民的健康。新型有效的防治脑血管病药物的开发已是临床亟需。
人参皂苷Rb3是从西洋参茎叶或三七叶中分离提取的四环三萜类人参二醇型皂苷单体。
人参皂苷Rb3结构式(R1-glu-glu；R2-glu-xyl)据报道，人参皂苷Rb3对培养小鼠皮层神经细胞缺血损伤具有明显的保护作用李爱红，柯开富.人参皂苷Rb1、Rb3、Rg1对培养小鼠皮层细胞缺血损伤的保护作用及浓度—效应关系.脑与神经疾病杂志.2003，11(2)72～76；可以抑制正常培养心肌细胞AP及自发性搏动(江岩，钟国赣，陈龙，等.人参皂甙Rb1、Rb2和Rb3对正常与致损的培养心肌细胞电位与收缩活动的影响.中国药理学报.1992，13(5)403～406)，可降低麻醉大鼠在体心脏的MAP、±dp/dtmax和LVSP(杨世杰，陈霞，李红，等.西洋参茎叶皂甙单体Rb3对大鼠血流动力学及单钙通道活动的影响.中国药理学通报.1995，11(1)39～42)。但关于人参皂苷Rb3在体内具有预防或治疗脑血管疾病的作用未见报道；鉴于此，本发明人通过大量的实验研究，发现人参皂苷Rb3具有预防或治疗脑血管疾病的医药用途。
发明内容
本发明提供了人参皂苷Rb3在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
本发明提供了人参皂苷Rb3在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
本发明提供了人参皂苷Rb3在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
本发明提供了由人参皂苷Rb3和药学上可接受的载体组成的用于治疗脑血管疾病的药物组合物。
本发明所述的人参皂苷Rb3在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为10mg～1000mg天，优选100mg～500mg/天。
本发明中使用的人参皂苷Rb3按文献孟勤，尹建元，赵俊艳，等.西洋参叶三萜皂苷的分离与鉴定.中国药学杂志.2003，37(3)175～177所述方法制备。
本发明中使用的人参皂苷Rb3可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物包括作为活性成分的人参皂苷Rb3及药用载体。该药物组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉途径给药。药物组合物可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液的形式存在。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。
本发明人通过下列试验证实了人参皂苷Rb3具有治疗或预防脑血管疾病的作用，下面的实施例用来更详细的说明本发明，但并不意味着本发明仅限于此。试验所用的人参皂苷Rb3由山东省天然药物工程技术研究中心现代中药研究室按文献孟勤，尹建元，赵俊艳，等.西洋参叶三萜皂苷的分离与鉴定.中国药学杂志.2003，37(3)175～177所述方法制备，经HPLC检测含量＞95％。
具体实施例方式制备实施例1人参皂苷Rb3冻干粉针的制备精密称取人参皂苷Rb3原料20.0g及药用甘露醇40.0g，溶于1000ml注射用水中，充分搅拌使溶解，用0.1N氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，补加注射用水至2000ml，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30分钟，碳棒过滤，滤液经0.25μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1000支西林瓶中，装量2.0ml/支，冷冻干燥，即得。每支含人参皂苷Rb320mg。
制备实施例2人参皂苷Rb3注射液的制备精密称取人参皂苷Rb3原料20.0g，溶于1000ml注射用水中，充分搅拌使溶解，用0.1N氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，补加注射用水至2000ml，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30分钟，碳棒过滤，滤液经0.25μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1000支西林瓶中，装量2.0ml/支，封口，灭菌，即得。每支含人参皂苷Rb320mg。
试验例1人参皂苷Rb3对大鼠局部脑缺血损伤的影响(1)材料人参皂苷Rb3注射剂按制备例1方法制备。红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。实验动物普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
(2)方法与结果动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，人参皂苷Rb31mg/kg组，人参皂苷Rb35mg/kg组，人参皂苷Rb310mg/kg组，人参皂苷Rb325mg/kg组，人参皂苷Rb350mg/kg组，人参皂苷Rb3100mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果如表1所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的人参皂苷Rb3，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
人参皂苷Rb350mg/kg抗脑缺血作用强于25mg/kg(P＜0.05)，但是与100mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。
表1 人参皂苷Rb3对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与50mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05。
试验例2人参皂苷Rb3对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响(1)材料人参皂苷Rb3注射剂按制备例2方法制备。红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。实验动物普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
(2)方法与结果动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，人参皂苷Rb31mg/kg组，人参皂苷Rb35mg/kg组，人参皂苷Rb310mg/kg组，人参皂苷Rb325mg/kg组，人参皂苷Rb3100mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，按实验例1所述方法造成左侧大脑中动脉缺血；术后10min各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。缺血2小时后，抽出尼龙线，造成大鼠脑缺血/再灌注损伤；再灌22小时后，按按实验例1所述方法进行行为评分、脑片染色。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果如表2所示，缺血2小时再灌22小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的人参皂苷Rb3，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
人参皂苷Rb350mg/kg抗脑缺血/再灌损伤作用强于25mg/kg(P＜0.05)，但是与100mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。
表2 人参皂苷Rb3对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响(n＝10，X±s)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与50mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05。
试验例3人参皂苷Rb3对小鼠闭合性脑外伤的保护作用(1)材料人参皂苷Rb3注射剂按制备例方法2制备。清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。
(2)方法与结果取小鼠70只，随机分为正常对照组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，人参皂苷Rb32mg/kg组，人参皂苷Rb310mg/kg组，人参皂苷Rb320mg/kg组，人参皂苷Rb350mg/kg组，人参皂苷Rb3100mg/kg组，人参皂苷Rb3200mg/kg组，每组10只。按文献王超云，蒋王林，智红英，等.黄芩苷对脑损伤的保护作用.中草药，2004，35(2)188~190所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型，各组静脉给药，24小时后剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿。
结果如表3所示，闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的人参皂苷Rb3，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，且呈剂量依赖性。
人参皂苷Rb3100mg/kg降低脑水肿作用强于50mg/kg(P＜0.05)，但是与200mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥100mg/kg时，药效并没有继续增加。
中国科学院成都分院分析测试中心分析、测试结果报告单表4
溴化率的计算1、二氢青蒿素(DHA)分子量为284.34，溴原子(Br)分子量为79.90，氢原子(H)分子量为1；2、二氢青蒿素的一个氢原子被溴原子取代后，溴代二氢青蒿素的分子量为(284.34-1)+79.90＝363.243、溴化率的计算79.90÷363.24＝21.996％≈22.0％。
检验报告上22.90％属正常值。
具体实施例方式
权利要求
1.人参皂苷Rb3在制备治疗或预防脑血管疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，人参皂苷Rb3在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述应用，人参皂苷Rb3在制备治疗或预防脑缺血/再灌注的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，人参皂苷Rb3在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
5.根据权利要求1～4任一所述的应用，人参皂苷Rb3的使用剂量范围为10mg～1000mg/天。
6.根据权利要求5所述的应用，人参皂苷Rb3的使用剂量优选为100mg～500mg/天。
7.由人参皂苷Rb3和药学上可接受的载体组成的用于治疗或预防脑血管疾病的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，该组合物可以通过静脉、口服、舌下、经皮、经肌肉、皮下或皮肤粘膜途径给药。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆或注射剂形式存在。
全文摘要
本发明提供了人参皂苷Rb
文档编号A61P9/00GK1679598SQ20041002387
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月6日 优先权日2004年4月6日
发明者田京伟, 马成俊, 蒋王林, 任召言, 傅风华, 刘珂 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司