专利名称：染料木素－3'－磺酸钠、双甲基化大豆甙元－3'－磺酸钠及其制备方法和药物用途的制作方法
技术领域：
本发明属于杂环化合物技术领域，具体涉及到杂环不氢化的含六节环，有一个氧原子作为仅有环杂原子，与其他环稠合的杂环化合物。
背景技术：
大豆异黄酮是大豆的天然提取物，具有与雌激素受体结合，并诱导产生弱雌激素样作用的一类植物化学物质，其中起到生理功效的主要是染料木素和大豆苷元。染料木素具有明显地抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化及改善妇女更年期症状的作用。近年来染料木素也是受到广泛研究的营养成分，它在人体中具有预防肿瘤、调节月经和其它有益健康的作用。流行病学研究已显示东亚地区乳腺癌和前列腺癌的发病率远低于西方工业化国家，这种差异与东亚地区食用较多的染料木素豆制品有一定关系。美国国家癌症研究中心于1996年已将染料木素列入肿瘤化学预防药物临床发展计划之中，主要预防目标是乳腺癌和前列腺癌。大豆苷元具有抗心率失常、抗缺氧缺血、解痉挛、雌性激素，抗衰老和抑制癌细胞生长作用，目前在临床上作为治疗心、脑血管疾病的药物应用。染料木素和大豆苷元属于异黄酮化合物，水溶性和脂溶性都很低，在作为药用时，只能制成口服药剂而不能制成注射剂，由于它们的水溶性很低，影响到药物利用度和显效时间，为了达到治疗目的，临床使用时，患者服用量大，服药1～2周后才能观察到治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述染料木素和大豆苷元的缺点，提供两种水溶性高的具有药用价值的新化合物染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠。
本发明的另一个目的在于提供一种制备上述两个化合物的方法。
本发明的进一步目的在于提供一种治疗心、脑血管疾病的药物和组合物。
本发明的第四个目的在于提供一种上述化合物和组合物在制备治疗心、脑血管疾病的药物中的应用。
本发明染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的化学名称分别为4′，5，7-三羟基异黄酮-3′-磺酸钠和7，4′-二甲氧基异黄酮-3′-磺酸钠，它们的化学结构分别用下述式(1)和式(2)表示 式(1)，染料木素-3′-磺酸钠R1＝R3＝H R2＝OH式(2)，双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠R1＝R3＝CH3R2＝H采用化学反应制备本发明的染料木素-3′-磺酸钠的方法如下(1)在反应釜中加入溶剂和下式(3)染料木素，搅拌下使染料木素完全溶解在溶剂中，再加入磺化剂，使染料木素与磺化剂进行化学反应，所用染料木素与磺化剂的摩尔比为1∶1～1∶10，用调温装置使反应液的温度为20～100℃，反应5分钟～10小时，得染料木素-3′-磺酸与未反应物的混合物。
式(3)染料木素(2)将(1)反应后的混合物冷却至室温，加入反应物总体积1～5倍量10～20％的氯化钠溶液，充分搅拌，静置生成沉淀，用常规分离方法，将化合物(1)分离出来，得到粗品，再加入粗品量的1～5倍量10～20％氯化钠溶液使其纯化，得到化合物式(1)的纯品。
式(3) 式(1)以大豆苷元为先导化合物制备本发明的双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的方法如下(1)反应釜中加入5％ NaOH溶解为溶剂和下式(4)大豆苷元， 式(4)大豆苷元搅拌下使大豆苷元完全溶解在溶剂中，再加入甲基化剂(CH3)2SO4，使大豆苷元与甲基化剂进行反应，所用大豆苷元与甲基化剂的摩尔比为1∶2～1∶5，用调温装置使反应液的温度为20～50℃，反应4～10小时，得双甲基大豆苷元-7，4′-二甲氧基异黄酮与未反应物的混合物。将反应后的混合物倒入蒸馏水中，过滤出沉淀，并用蒸馏水洗涤至中性、真空干燥，得下式(5)双甲基大豆苷元。
式(5)双甲基大豆苷元(2)在反应釜中加入溶剂和式(5)双甲基大豆苷元，搅拌下使双甲基大豆苷元完全溶解在溶剂中，再加入磺化剂，使双甲基大豆苷元与磺化剂进行化学反应，所用双甲基大豆苷元与磺化剂的摩尔比为1∶1～1∶10，用调温装置使反应液的温度为20～100℃，反应5分钟～10小时，得双甲基大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物。
(3)将(2)反应后的混合物冷却至室温，加入反应物总体积1～5倍量10～20％的氯化钠溶液，充分搅拌，静置生成沉淀，用常规分离方法，化合物分离出来，得到粗品，再加入粗品量的1～5倍量10～20％氯化钠溶液使其纯化，得到化合物式(2)纯品。
式(2)本发明染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的制备方法中，化学反应所用的溶剂是70～98％硫酸，所用的磺化剂可以是浓硫酸或氯磺酸或发烟硫酸或三氧化硫。
本发明染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的制备方法中，磺化反应的优选温度为20～100℃，化学反应的优选时间为2～8小时。
本发明染料木素-3′-磺酸钠的制备方法中，化学反应的最佳温度为50℃，化学反应的最佳时间为3小时；双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的制备方法中，化学反应的最佳温度为60℃，化学反应的最佳时间为4小时。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述式(1)或式(2)为活性成份，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的化合物和药物组合物可用于制备治疗心、脑血管疾病药物中的应用。
本发明有效成分染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠制备治疗心、脑血管疾病药物用常规药用制剂的形式来使用；所述的常规药用制剂含作为活性成分的染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于胃肠内和胃肠外给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合。该药用制剂可以是固体形式如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂；也可以是液体形式如注射剂、悬浮剂、糖浆剂和乳剂等。
上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂，润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因和抗坏血酸等。
上述制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5～95％的活性成分。
本发明的活性成分染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠制成各种剂型的口服药物，成人口服，药物中染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的含量应为每天150mg，一日三次，每次药物中染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的含量为50mg，14天为一个疗程，治疗2～3个疗程。成人肌肉注射，药物中染料木素-3′磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠含量应为每天80mg，一日两次，14天为一个疗程，治疗2个疗程；静脉点滴，成人用量，药物中染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的含量应为每天80mg，一日一次，14天为一个疗程，治疗2个疗程。口服药物或注射药物，儿童用药酌情减量。
发明人将本发明的活性成分染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠委托试验单位进行了药效试验，试验结果表明本发明的活性成分染料木素-3′-磺酸钠对小白鼠具有较好的抗缺氧作用；双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠对小白鼠具有明显的抗缺氧、抗缺血作用，显效速度和显效时间均快于大豆苷元。若将染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠用于临床试验，预期将会有较好的治疗效果。本发明的制备方法采用亲电取代反应法，具有工艺简便，所用的设备简单、产品的收率高和生产成本低等优点。
图1是本发明染料木素-3′-磺酸钠的红外光谱图。
图2是本发明染料木素-3′-磺酸钠的氢核磁共振图。
图3是本发明双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的红外光谱图。
图4是本发明双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的氢核磁共振图。
在图1和图3中，横坐标为波数，纵坐标为吸收率。在图2和图4中，横坐标为化学位移，单位为ppm，纵坐标为峰高度。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
一、染料木素-3′-磺酸钠制备实施例实施例1在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂80％硫酸直到使染料木素充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，染料木素与磺化剂摩尔比为1∶5，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为60℃，反应5小时，得到染料木素-3′-磺酸和未反应原料的混合物，冷却至室温，加入反应物总体积5倍的10％氯化钠水溶液，充分搅拌，静置析出白色沉淀，过滤，得到染料木素-3′-磺酸钠粗品；用重结晶法在染料木素-3′-磺酸钠粗品中加入5倍量的10％氯化钠水溶液进行纯化，得到染料木素-3′-磺酸钠精品(产率85％)。采用本实例制备的染料木素-3′-磺酸钠，经测试，其理化性能如下白色针状晶体，熔点为295℃(分解)；在水中的溶解度为10.5％，易溶于水；薄层显示淡篮色荧光。
参见图1，本实施例的染料木素-3′-磺酸钠分子结构经红外光谱仪测试结果如下IRν(cm-1；KBr)3155，1663，1507，1441，1364，1190，1093，1035，905，828，712，630。
参见图2，本实施例的染料木素-3′-磺酸钠的H用核磁共振仪测试结果如下1H NMR[DSMO/TMS，δ(ppm)]8.34(s，1H，H-C2)，6.34(s，1H，H-C6)，6.43(s，1H，H-C8)，7.81(s，1H，H-C2’)，6.88(d，1H，J＝8.6Hz，H-C5’)，7.41(d，1H，J＝8.6Hz，H-C6’)，12.89(s，1H，HO-C5)，11.10(s，1H，HO-C7)，10.52(s，1H，HO-C4’)。
实施例2在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂70％硫酸直到使染料木素充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，染料木素与磺化剂的摩尔比为1∶8，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为100℃，反应5分钟，得到染料木素-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色染料木素-3′-磺酸钠沉淀，随后分离染料木素-3′-磺酸钠，并使其纯化，分离和纯化所用原料为反应物总体积1倍的20％氯化钠水溶液，其它工艺过程与实施例1相同。
实施例3
在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂85％硫酸直到使染料木素充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，染料木素与浓硫酸的摩尔比为1∶3，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为20℃，反应10小时，得到染料木素-3′-磺酸与未反应物的混合物，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色染料木素-3′-磺酸钠沉淀，随后分离染料木素-3′-磺酸钠，并使其纯化，分离和纯化所用原料及配比与实施例1相同。
实施例4在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂98％硫酸直到使染料木素充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，染料木素与浓硫酸的摩尔比为1∶1，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为80℃，反应30分钟，得到染料木素-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色大豆苷元-3′-磺酸钠沉淀，随后分离大豆苷元-3′-磺酸钠并使其纯化，分离和纯化所用原料及配比与实施例1相同。
实施例5在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂75％硫酸直到使染料木素充分溶解，再通入磺化剂三氧化硫，染料木素与三氧化硫摩尔比为1∶3，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为20℃，反应8小时，得到染料木素-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色染料木素-3′-磺酸钠沉淀，随后分离染料木素-3′-磺酸钠并使其纯化，分离和纯化所用原料及配比与实施例1相同。
实施例6在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂75％硫酸直到使染料木素充分溶解，再加入磺化剂发烟硫酸，染料木素与发烟硫酸的摩尔比为1∶2，用搅拌机搅拌后，升温至50～55℃，反应1小时，得到染料木素-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加10％氯化钠水溶液，得到染料木素-3′-磺酸钠粗品，并使其纯化。分离和纯化所用原料以及配比和操作与实施例1相同。
实施例7在本实施例中，先将染料木素加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂75％硫酸直到使染料木素充分溶解，然后滴加磺化剂氯磺酸，染料木素与氯磺酸的摩尔比为1∶1。滴加完后，用搅拌机搅拌后，升温至45～50℃，反应2小时，将反应物的混合物冷却至室温，加10％氯化钠水溶液加热后并冷却，得到染料木素-3′-磺酸钠粗品。分离和纯化所用原料以及配比和操作与实施例1相同。
二、双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠制备实施例实施例8反应釜中加入5％NaOH溶解为溶剂和大豆苷元，5％NaOH和大豆苷元的重量比为5∶1，搅拌下使大豆苷元完全溶解在溶剂中，再加入甲基化剂(CH3)2SO4，大豆苷元与甲基化剂的摩尔比为1∶2，用调温装置使反应液的温度为45℃，反应4小时，得双甲基大豆苷元-7，4′-二甲氧基异黄酮与未反应物的混合物。将反应后的混合物倒入蒸馏水中，过滤出沉淀，并用蒸馏水洗涤至中性、真空干燥，得到双甲基大豆苷元，产率93％。
在本实施例中，先将双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂80％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，双甲基大豆苷元与浓硫酸的摩尔比为1∶5，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为60℃，反应5小时，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸和未反应原料的混合物，冷却至室温，加入反应物总体积5倍的10％氯化钠水溶液，充分搅拌，静置析出白色沉淀，过滤，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠粗品；用重结晶法在双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠粗品中加入5倍量的10％氯化钠水溶液进行纯化，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠精品(产率92％)。
采用本实例制备的双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠，经测试，其理化性能如下白色针状晶体，熔点为300℃(分解)；在水中的溶解度为8.8％，易溶于水；薄层显示淡兰色荧光。
参见图3，本实施例的双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的分子结构经红外光谱仪测试结果如下IRν(cm-1；KBr)2977，2907，2834，1628，1596，1508，1436，1293，1248，1173，1095，1029，838，779，541。
参见图4，本实施例的双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠分子结构式中的H用核磁共振仪测试结果如下1H NMR[D2O/TMS，δ(ppm)]7.64(d，1H，J＝2.6Hz，H-C2’)，7.63(s，1H，H-C2)，7.42(d，1H，J＝8.8Hz，H-C5)，7.01(dd，J＝8.8Hz，2.6Hz，H-C6’)，6.78(d，1H，J＝8.8Hz，H-C5’)，6.55(dd，J＝8.8Hz，2.2Hz，H-C6)，6.35(d，1H，J＝2.2Hz，H-C8)，3.72(s，3H，H3CO-C7)，3.44(s，3H，H3CO-C4’)。
实施例9反应釜中加入5％NaOH溶解为溶剂和大豆苷元，5％NaOH和大豆苷元的重量比为5∶1，搅拌下使大豆苷元完全溶解在溶剂中，再加入甲基化剂(CH3)2SO4，大豆苷元与甲基化剂的摩尔比为1∶5，用调温装置使反应液的温度为20℃，反应10小时，得双甲基大豆苷元-7，4′-二甲氧基异黄酮与未反应物的混合物。将反应后的混合物倒入蒸馏水中，过滤出沉淀，并用蒸馏水洗涤至中性、真空干燥，得到双甲基大豆苷元，产率90％。
在本实施例中，先将上述制备的双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂75％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，双甲基大豆苷元与浓硫酸的摩尔比为1∶8，用调温装置使反应液的温度为100℃，反应10分钟，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠沉淀，随后分离双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠，并使其纯化，分离和纯化所用原料为反应物总体积1倍的20％氯化钠水溶液，其它工艺过程与实施例8相同。
实施例10反应釜中加入5％NaOH溶解为溶剂和大豆苷元，5％NaOH和大豆苷元的重量比为5∶1，搅拌下使大豆苷元完全溶解在溶剂中，再加入甲基化剂(CH3)2SO4，大豆苷元与甲基化剂的摩尔比为1∶4，用调温装置使反应液的温度为30℃，反应7小时，得双甲基大豆苷元-7，4′-二甲氧基异黄酮与未反应物的混合物。将反应后的混合物倒入蒸馏水中，过滤出沉淀，并用蒸馏水洗涤至中性、真空干燥，得到双甲基大豆苷元，产率88％。
先将上述制备制备的双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂85％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，双甲基大豆苷元与浓硫酸的摩尔比为1∶3，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为20℃，反应10小时，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠沉淀，随后分离双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠，并使其纯化，分离和纯化所用原料及配比与实施例8相同。
实施例11在本实施例中，先将实施例8中制备的双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂85％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再通入磺化剂三氧化硫，双甲基大豆苷元与三氧化硫的摩尔比为1∶3，用搅拌机搅拌后，用调温装置使反应液的温度为40℃，反应7小时，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加5倍体积10％氯化钠水溶液，放置，得到白色双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠沉淀，随后分离双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠并使其纯化，分离和纯化所用原料及配比与实施例8相同。
实施例12在本实施例中，先将实施例8中制备的双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂80％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再通入磺化剂发烟硫酸，双甲基大豆苷元和发烟硫酸分摩尔比为1∶4。用搅拌机搅拌后，升温至50～55℃，反应1小时，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加10％氯化钠水溶液，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠粗品，并使其纯化。分离和纯化所用原料以及配比和操作与实施例8相同。
实施例13在本实施例中，先将实施例8中制备的双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂90％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再加入磺化剂氯磺酸，双甲基大豆苷元与氯磺酸的摩尔比为1∶1。滴加完后，用搅拌机搅拌后，升温至45～50℃，反应2小时，将反应物的混合物冷却至室温，加10％氯化钠水溶液并加热，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠粗品。分离和纯化所用原料以及配比和操作与实施例8相同。
实施例14在本实施例中，先将实施例8中制备的双甲基大豆苷元加入反应釜中，用搅拌机搅拌并逐渐加入溶剂98％硫酸直到使双甲基大豆苷元充分溶解，再加入磺化剂浓硫酸，双甲基大豆苷元与浓硫酸的摩尔比为1∶2。滴加完后，升温至55～60℃，反应1小时，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物，冷却至室温，加10％氯化钠水溶液并加热，得到双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠粗品。分离和纯化所用原料以及配比和操作与实施例8相同。
三、染料木素-3′-磺酸钠和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠制剂实施例实施例15以制备本发明染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠片剂1000片为例所用的原料和辅料配比如下染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠 50g淀粉 250g淀 粉 浆(10％) 85g硬 脂 酸 镁15g采用常规片剂的制备工艺制成，每片重0.4g，每片染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的含量为50mg。用法成人一日三次，每次1片口服，儿童酌情减量。
实施例16以制备本发明染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠散剂1000袋为例所用的原料和辅料配比如下染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠 40g
乳糖 2800g淀 粉 浆(10％) 60g采用常规散剂的制备工艺制成，每袋重3g，每片染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的含量为40mg。用法成人一日三次，每次1袋口服，儿童酌情减量。
实施例17以制备本发明染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠1000ml注射剂为例，所用的原料和辅料配比如下染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠50g注 射 用 水 加至1000ml采用常规法注射剂的制备工艺制成，每瓶2ml，含染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠100mg。用法肌肉注射，一日两次，每次1支，静脉点滴，一日一次，每次2支。
发明人将本发明的有效成分染料木素-3′-磺酸钠或双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠委托试验单位进行了药效试验，例举下列实验内容及其试验结果，证明用本发明制备的药物治疗心、脑血管疾病的有效性。
一、染料木素-3′-磺酸钠药效试验ICR小鼠由陕西省中医药研究院实验动物中心提供，体重20～22g，鼠龄6-7周，动物合格证为医动字08-24号。
1.抗缺氧、抗缺血作用(1)动物分组及处理实验动物随机分为空白对照组，阳性药对照组，染料木素大剂量组和小剂量组，染料木素-3′-磺酸钠大剂量组和小剂量组共六组，每组12只小鼠。空白组每日灌胃给予等体积溶媒(羧甲基纤维素钠悬浊液)，染料木素大剂量和小剂量分别为150mg·kg-1·d-1和50mg·kg-1，染料木素-3′-磺酸钠大剂量和小剂量分别为150mg·kg-1·d-1和50mg·kg-1·d-1’，灌胃给药，连续给药7天后处理动物。
(2)各指标的测试方法急性脑缺氧试验按(1)所述方法分组，以尼莫地平为阳性药，剂量为120mg·kg-1·d-1，最后一次给药1h后，自小鼠耳后部迅速断头，记录小鼠从断头开始到最后一次喘气时间。
化学性缺氧试验按(1)所述方法分组，以尼莫地平为阳性药，剂量为120mg·kg-1·d-1，最后一次给药1h后，各组均腹腔注射亚硝酸钠200mg·kg-1，立即开始记录小鼠存活时间。
心肌特异性缺氧试验在(1)所述方法分组基础上，再增加模型对照组，空白对照组与模型对照组皆给予等体积溶媒，以盐酸普萘洛尔为阳性药，剂量为120mg·kg-1·d-1，最后一次给药40min后，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射给予10mg·kg-1的异丙肾上腺素，给予异丙肾上腺素15min后，将各组小鼠置于体积为200mL装有10g钠石灰的广口平中，密封，记录小鼠死亡时间。
(3)实验结果染料木素-3′-磺酸钠对急性脑缺血小鼠的作用、对化学性缺氧小鼠的作用和对心肌特异性缺氧小鼠的作用分别见表1、表2和表3。
表1染料木素-3′-磺酸钠对急性脑缺血小鼠的作用(x±s，n＝12)组别 剂量(mg·kg-1·d-1，) 存活时间(s)空白对照组 - 20.28±1.96尼莫地平对照组 12023.45±1.89**染料木素大剂量组 15023.60±2.07*染料木素小剂量组 50 22.28±1.11**染料木素-3′-磺酸钠大剂量组15023.08±0.41*染料木素-3′-磺酸钠小剂量组50 22.33±1.72*注*表示与模型对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01，下同表2染料木素-3′-磺酸钠对化学性缺氧小鼠的作用(x±s，n＝12)组别 剂量(mg·kg-1·d-1，) 存活时间(min)空白对照组 - 11.93±1.31尼莫地平对照组 120 14.95±2.45**染料木素大剂量组 150 14.59±1.41**染料木素小剂量组 5015.84±1.82**染料木素-3′-磺酸钠大剂量组150 14.42±1.76**染料木素-3′-磺酸钠小剂量组5013.25±2.30表3染料木素-3′-磺酸钠对心肌特异性缺氧小鼠的作用(x±s，n＝12)组别 剂量(mg·kg-1·d-1，) 存活时间(min)空白对照组 -40.83±6.98模型对照组 -21.93±2.90**尼莫地平对照组 120 27.76±4.83**染料木素大剂量组 150 30.28±4.70**染料木素小剂量组 50 31.23±5.53**染料木素-3′-磺酸钠大剂量组150 27.82±6.18*染料木素-3′-磺酸钠小剂量组50 29.41±3.99**2.结论小鼠断头后，由于脑供血终止，在短时间内脑中原有的血液和营养物质尚能使脑功能维持短暂时间，小鼠显示有规律的张口喘气，凡能使脑耗氧量降低的药物，均能延长小鼠喘气时间；亚硝酸钠进入体内后，可以和血红蛋白结合，使其失去携带氧的能力，从而造成组织缺氧，引起动物死亡；给予异丙肾上腺素后，心率加快，心肌收缩力增强，心肌耗氧量上升，在缺氧时，心肌细胞最先受到伤害，从而引起动物死亡。具有降低组织耗氧量，扩张血管，促进血流速度，提高组织中氧的利用率，扩张冠状动脉，降低心肌耗氧量等功能的药物均可以延长动物缺氧致死时间。本试验可以看出，染料木素-3′-磺酸钠、染料木素均可以有效地延长缺氧动物死亡时间，具有较明显的抗缺氧作用。染料木素具有抗氧化、抗癌、雌激素样作用等多种生物活性，但染料木素水溶性差，使其在临床应用时剂型设计受到较大限制，染料木素磺酸化后，显著的提高了其水溶性，其抗缺氧能力与染料木素基本一致。
二、双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠药效试验受试动物ICR小鼠，体重20～22g，由陕西省中医药研究院提供，颗粒饲料喂养。室温18℃～29℃，相对湿度45-55％。
1.药物显效时间的确定取84只小鼠，分为两组，每组42只。一组腹腔注射给予大豆甙元剂量35mg/kg，另一组腹腔注射给予双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠剂量35mg/kg，分别于给药后15分钟、20分钟、25分钟、35分钟、45分钟、55分钟、65分钟各取6只小鼠观察断头后张口喘气时间。结果显示双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠在给药后20分钟时药效最明显，大豆甙元在给药后45分钟时效果最显著。
2.抗缺氧、抗缺血作用(1)小鼠的分组及预处理192只小鼠，按体重随机分为四组即KCN中毒实验组、NaNO2中毒实验组、断头后张口喘气实验组、常压抗缺氧实验组。每个实验组再分成四个小组分别为正常(生理盐水)对照组、溶媒(羧甲基纤维素钠)对照组、阳性(大豆苷元)对照组和双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠实验组，见表4。每组按表2所示的药物及剂量腹腔注射，20分钟之后对双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠与正常对照组进行实验，45分钟之后对阳性对照组与溶媒对照组进行实验。
表4小鼠的分组及处理生理盐水羟甲基纤维素钠 大豆甙元大豆甙元-3′-磺酸钠正常对照组 0.3mL溶媒对照组0.3mL阳性对照组 35mg/Kg体重双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠35mg/Kg体重
(2)各指标的测试方法KCN中毒时间将经预处理后的KCN中毒实验组小鼠腹腔注射KCN10mg/kg体重，以心脏停止跳动为指标，记录存活时间。
NaNO2中毒时间将经预处理后的NaNO2中毒实验组小鼠腹腔注射NaNO2400mg/kg体重，以心脏停止跳动为指标，记录存活时间。
断头后张口喘气时间将经预处理后的断头后张口喘气实验组小鼠沿耳后缘迅速断头，立即用秒表记录其断头张口喘气时间。
常压耐缺氧将经预处理后的常压抗缺氧实验组小鼠置于150ml的磨口广口瓶中，用凡士林涂抹瓶口，盖严，使不漏气，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡时间。
(3)实验结果双甲基大豆苷元-3′-磺酸钠的抗缺氧、抗缺血作用结果见表5。
表5双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠药效实验结果KCN中毒(min)NaNO2中毒(min) 断头张口喘气(s)常压耐缺氧(min)正常对照组8.46±1.72 9.48±0.9715.58±3.15 16.79±4.34溶媒对照组9.02±1.85*9.56±1.47*16.19±3.57*16.77±3.22*阳性对照组11.19±3.43***12.01±2.76****26.53±2.42****1.82±2.78**双甲基大豆甙 13.96±4.55****14.97±3.03****22.34±1.76****23.26±4.37****元-3’-磺酸钠 ΔΔ ΔΔ ΔΔΔ注*表示与正常对照组相比较*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01；****P＜0.001Δ表示与正常对照组相比较ΔP＞0.05；ΔΔP＜0.05；ΔΔΔP＜0.013.结论通过给药后效果观察说明双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠药效作用速度和显效时间明显快于大豆甙元。双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠具有极其显著的抗缺氧作用，在细胞内呼吸方面(NaNO2、KCN中毒)双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠的药效要明显优于大豆甙元，差异显著，在细胞外呼吸(常压抗缺氧)，大豆甙元-3′-磺酸钠的作用与大豆甙元相当，在脑缺血缺氧(断头张口呼吸)，大豆甙元优于双甲基大豆甙元-3′-磺酸钠。
权利要求
1.下述式(1)和式(2)化合物 式(1)R1＝R3＝H R2＝OH式(2)R1＝R3＝CH3R2＝H
2.一种权利要求式(1)和式(2)化合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)反应釜中加入溶剂和下式(3)染料木素或式(4)双甲基化大豆苷元， 式(3)R1＝R3＝H R2＝OH式(4)R1＝R3＝CH3R2＝H染料木素或双甲基化大豆苷元溶解在溶剂中，再加入磺化剂，染料木素或双甲基化大豆苷元与磺化剂进行化学反应，所用染料木素或双甲基化大豆苷元与磺化剂的摩尔比为1∶1～1∶10，用调温装置使反应液的温度为20～100℃，反应5分钟～10小时，得染料木素-3′-磺酸或双甲基化大豆苷元-3′-磺酸与未反应物的混合物。(2)将(1)反应后的混合物冷却至室温，倒入总体积为反应混合物1～5倍量10～20％的氯化钠溶液，充分搅拌，静置生成沉淀，用常规分离方法，将式(1)或式(2)的化合物分离出来，得到粗品，再加入粗品量的1～5倍量10～20％氯化钠溶液使其纯化，得到式(1)或式(2)的化合物纯品。 式(3)R1＝R3＝H R2＝OH 式(1)R1＝R3＝H R2＝OH式(4)R1＝R3＝CH3R2＝H式(2)R1＝R3＝CH3R2＝H
3.按照权利要求2所述的权利要求式(1)和式(2)的制备方法，其中式(3)和式(4)化合物与磺化剂的反应温度为20℃～100℃，化学反应时间为5分钟～10小时。
4.按照权利要求2所述的权利要求式(1)和式(2)化合物的制备方法，其中式(3)和式(4)分别与磺化剂的反应温度为50℃和60℃，化学反应时间分别为3小时和4小时。
5.按照权利要求2所述的权利要求式(1)和式(2)化合物的制备方法，其特征在于所说的溶剂为70～98％硫酸；所说的磺化剂为浓硫酸或氯磺酸或发烟硫酸或三氧化硫。
6.一种治疗心、脑血管疾病的药物组合物，其中有治疗有效量的权利要求式(1)或式(2)化合物和药学上可接受的载体。
7.权利要求式(1)和式(2)化合物在制备治疗心、脑血管疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于杂环化合物技术领域，具体涉及到杂环不氢化的含六节环，有一个氧原子作为仅有环杂原子，与苯环稠合有芳环仅连在位置2的杂环化合物。本发明提供了一种染料木素－3′－磺酸钠和双甲基化大豆甙元－3′－磺酸钠及其制备方法，其工艺包括在溶剂中加入反应物染料木素或双甲基化大豆甙元，再加入磺化剂，反应物与磺化剂进行化学反应，得到本发明化合物与未反应物的混合物，用常规分离方法并使其纯化，得到本发明的化合物纯品。还提供了一种治疗心、脑血管疾病的药物和组合物，其中有治疗有效量的染料木素－3′－磺酸钠或双甲基化大豆甙元－3′－磺酸钠和药学上可接受的载体；以及染料木素－3′－磺酸钠和双甲基化大豆甙元－3′－磺酸钠在制备治疗心、脑血管疾病的药物中的应用。
文档编号A61P9/10GK1594306SQ200410026270
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者张尊听, 刘谦光, 郑建斌, 索志荣, 薛东, 李发荣 申请人:陕西师范大学