专利名称：封闭TGF－β1的反义寡核苷酸及其在制备治疗纤维化相关疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体说是一种针对转化生长因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN)的序列和结构及其成为预防纤维化产生、治疗纤维化相关疾病的新型药物。
背景技术：
组织纤维化是过多的细胞外基质在特定组织的聚集，最终可导致受累组织器官功能减低或丧失。在很多疾病中均可以观察到组织纤维化的发生，例如，肺尘埃沉着病(包括矽肺、煤肺等)，其共同的发病机制是尘埃被吸入肺泡诱导巨噬细胞释放出一些纤维化因子促进纤维母细胞增生和胶原形成，导致纤维化；在病毒性、酒精性、药物性肝炎中均可观察到纤维组织增生，尤以肝硬化最为明显，此时肝组织已被增生的纤维组织改建，不易从形态结构上完全恢复正常；以手术区瘢痕形成为特征的并发症使青光眼滤过术的失败率高达15％～25％。减少纤维化的发生是临床医学需要解决的重要问题之一。
目前，临床上抗组织纤维化的常用药是皮质类固醇、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素-C、钙通道阻滞剂(如，维拉帕米、尼卡地平、三氟拉嗪)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等。但使用中存在一些问题，例如皮质类固醇对成纤维细胞作用有双重性，低浓度时反而促进成纤维细胞增殖；5-氟尿嘧啶、丝裂霉素-C有很大的毒副作用；钙通道阻滞剂能抑制成纤维细胞的增生和粘附，但并不能完全抑制胶原和细胞外基质的合成；t-PA是分子量70kD的大分子蛋白，在体内容易被降解且有免疫原性。所以，迫切需要开发特异高效的抗纤维化药物。
纤维化病变的发生及发展有始动因素和效应因素两种因素的协同作用，由于始动因素常不清楚，所以对纤维化病变的治疗常以对抗效应因素为主。对抗效应因素的措施包括1)抑制炎性细胞的粘附、迁移、集聚和释放致纤维化介质。2)采用影响胶原合成及代谢的药物。虽然体外研究中相关药物能对胶原合成及代谢的各个环节进行干预，但在体内这些药物往往因毒性过大而达不到理想的抗纤维化效果。3)阻断致纤维化因子如PDGF、FGF、VEGF、TGF-β1等的活性。特别是封阻TGF-β1的活性是抗纤维化研究中最活跃的领域。
TGF-β1是具有多种生物学活性调节功能的细胞因子，除在胚胎发育、器官形成、免疫反应等生理过程中发挥重要的正向调控作用外，还是创伤后组织修复及组织纤维化过程中关键的早期调控分子，且与瘢痕形成关系密切(IhnH.Pathogenesis of fibrosisrole of TGF-beta and CTGF.Curr Opin Rheumatol，2002，14681-685)。TGF-β1是种具多种生物学活性调节功能的细胞因子，至少有5种异构体，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3较为多见，存在于大多数哺乳动物的所有组织中，尤其在骨、肺、肾及胎盘组织中含量丰富。人TGF-β1的mRNA全长序列长2745nt，编码区长1176nt(包括信号肽及112个氨基酸的成熟肽)。已证实无论何种诱发因素导致的器官纤维化病变，其共同特征是病灶局部有大量的TGF-β1持续存在(Branton MH，Kopp JB.TGF-beta and fibrosis.Microbes Infect，1999，11349-1365.Wells RG.Fibrogenesis.V.TGF-betasignaling pathways.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279G845-850)。TGF-β1作用于病灶处的靶细胞，通过以下途径促进过量基质聚集1)增强细胞外基质分子如纤连蛋白、胶原及蛋白聚糖的生物合成。2)抑制金属蛋白酶分泌并诱导蛋白酶抑制物合成，阻断基质降解。3)调节作为细胞外基质受体粘附分子整合素的表达，促进细胞与基质的粘附和基质的沉积。4)通过自分泌作用方式诱导自身合成进一步放大上述生物学效应。
研究证明，组织器官的纤维化病变均与TGF-β1聚集相关。例如，慢性心肌纤维化时TGF-β1表达明显增加且与纤维化病变呈正相关(Hao J，Ju H，Zhao S，et al.Elevation of expression of Smads 2，3，and 4，decorin and TGF-betain the chronic phase of myocardial infarct scar healing.J Mol Cell Cardiol，1999，31667-678)；TGF-β1在血管成形术后再狭窄的形成过程中呈持续的高表达，并且促进了损伤的血管平滑肌细胞增殖，细胞外基质的合成、分泌，使之在血管内膜大量沉积，从而导致血管内膜的增厚，再狭窄的形成(Kaji T，Yamada A，Miyajima S，et al.Cell density-dependent regulation of proteoglycansynthesis by transforming growth factor-beta(1)in cultured bovine aorticendothelial cells.J Biol Chem，2000，2751463-1470.Chen YM，Wu KD，TsaiTJ，et al.Pentoxifylline inhibits PDGF-induced proliferation of andTGF-beta-stimulated collagen synthesis by vascular smooth muscle cells.J MolCell Cardiol，1999，31773-783)；TGF-β1促进肾小球系膜细胞I型胶原的合成，诱导肾纤维化的发生(Poncelet AC，de Caestecker MP，Schnaper HW，et al.Thetransforming growth factor-beta/SMAD signaling pathway is present andfunctional in human mesangial cells.Kidney Int，1999，561354-1365)；TGF-β1曾被认为有利于伤口愈合、是伤口愈合中必不可少的调控因子，而最新的研究结果显示伤口局部内源性TGF-β1活性的丧失，并未阻碍伤口愈合，而是使愈合组织的显微结构向着无瘢痕化方向演变，有利于伤口愈合，TGF-β1并不是伤口愈合过程中必不可少的、发挥正向调控作用的启动因子，而是阻碍上皮化进程、导致瘢痕形成的负向因子(Davison SP，McCaffrey TV，PorterMN，Manders E.Improved nerve regeneration with neutralization of transforminggrowth factor-betal.Laryngoscope，1999，109631-635)。我们的研究结果显示，使用TGF-β1抑制剂可降低伤口部位胶原的合成，并且使胶原的排列接近正常，减少瘢痕的形成(刘韧，朱旭东，谢琳，肖南.外源性装饰蛋白(Decorin)在组织修复中对胶原形成的抑制作用.中国生化药物杂志，2002，23126-128)。
综上所述，对抗TGF-β1在促进伤口愈合、减少瘢痕形成及防止组织纤维化病变中有着极其重要的意义。封阻TGF-β1活性现有的策略包括1)干预配体TGF-β1水平及活性。2)利用受体拮抗剂阻断TGF-β1与其II型受体的结合，阻止TGF-β1信号传入靶细胞。3)干预TGF-β1受体后信号传递途径。在动物模型和体外实验中应用上述策略，封阻TGF-β1活性已取得一些效果。除TGF-β1单克隆抗体外，只识别并结合TGF-β1的其他分子还未见报道。
ASODN通过与特定基因按碱基互补原则结合即杂交，可在基因水平上特异性地阻断基因的表达，被认为是一种很有希望的高选择性和高效率的潜在的疾病治疗药物。1998年FDA已批准一种ASODN药物在美国进入临床(治疗AIDS病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的fomivivsen)，另有5-6种ASODN药物在进行临床实验。随着人类基因组计划的深入，特别是后基因组计划的实施，将会有越来越多的疾病相关基因及药物作用靶标被发现。ASODN药物作为基因为靶的新一代药物将会发挥其更大的优势。与大分子药物或蛋白类药物相比较，ASODN分子量较低，与靶分子结合时空间位阻小，无免疫原性，经修饰后稳定性良好，组织渗透能力强，显示出诱人的临床应用前景。
通过计算机联网检索，从1995年至今仅几篇文献涉及以ASODN封阻TGF-β1，在动物模型中成功地阻断TGF-β1mRNA，使单侧输尿管梗阻部位的间质纤维化减少(Isaka Y，Tsujie M，Ando Y，et al.Transforming growthfactor-beta 1 antisense oligodeoxynucleotides block interstitial fibrosis in unilateralureteral obstruction.Kidney Int，2000，581885-1892)，以及促进皮肤伤口愈合减少瘢痕形成(Choi BM，Kwak HJ，Jun CD，et al.Control of scarring in adultwounds using antisense transforming growth factor-beta 1 oligodeoxynucleotides.Immunol Cell Biol，1996，74144-150)。国内研究者刘小菁和梁志清围绕肝纤维化进行了一些工作，但是与国外同行一样，他们使用的ASODN是针对TGF-β1mRNA编码区的一段15-25mer的随机序列，并不一定是靶基因上的最佳作用靶点(刘小菁.TGF-β1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的抑制作用.华西医科大学学报，2000，1342-45.梁志清.反义核酸对大鼠肝纤维化转化生长因子β受体表达的调节作用.中华实验外科杂志，1999，1644-45)。研究发现，虽然碱基的组成可能会影响杂交双链的形成，但是杂交双链的理论自由能不同并不能解释ASODN活性的巨大差别。RNA分子内碱基配对形成的二、三级结构会造成大部分的分子不能与互补核酸相互作用；其他一些结构，如茎环结构、末端序列没有分子内相互作用，但易与其它核酸结合。这证明互补的ASODN与靶基因结合的主要影响因素不是碱基组成，而是RNA的二、三级结构。要详细预测RNA的这些结构仍很困难，另外，细胞性因素对其影响也知之甚少。近几年来，为减少ASODN的毒性、减少非特异性作用以及降低费用等，发展了许多方法以更详尽地研究mRNA中的最佳靶点，从而寻找更有潜力和更有效的反义药物。
SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术即通过指数型富集达到配基的系统性进化，由Tuerk和Gold于1990年首次发明使用(Tuerk C，Gold L.systematic evolution of ligands by exponential enrichment，RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science，1990，249505-510)。SELEX技术是应用大容量的随机寡核苷酸库，该寡核苷酸库可为任何靶分子(包括蛋白、核酸、病毒、细菌、甚至金属离子)提供足够量的、且包纳了所有可能空间结构的底物，并结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸配基。利用随机寡核苷酸库寻找靶分子的封阻剂或ASODN药物已取得令人鼓舞的结果。
发明内容
本发明的目的在于即本发明的目的是提供对靶向TGF-β1基因具有良好抑制活性的ASODN以及能够改善其生物学活性的化学修饰衍生物。本发明的另一个目的是提供所述封闭TGF-β1的反义寡核苷酸的化学修饰物在制备治疗纤维化相关疾病药物中的用途。
为实现上述目的采用的技术方案首先进行全长TGF-β1基因的制备、克隆及体外转录，其次构建随机寡核苷酸库，然后以TGF-β1mRNA为模板对随机寡核苷酸库进行多轮筛选，通过对筛选的寡核苷酸进行测序，确定了18条ASODN序列(见表1)。采用自动DNA合成仪合成上述序列并在合成时进行硫代修饰，通过抑制KB细胞的TGF-β1活性，对上述ASODN进行评价。发现其中8条序列即TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312在200nmol/L浓度时，对基因具有特异性的抑制活性，抑制率均在50％以上。进一步的药效学研究表明，TGF554、TGF982、TGF1312的IC50分别为176.2nmol/L、140.2nmol/L、185.1nmol/L，大大低于文献报道的序列。
表1 反义寡核苷酸序列及性质
A反义根据本发明，靶向TGF-β1编码区的TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312能特异性地抑制TGF-β1基因的功能，有可能成为预防及治疗纤维化相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312的长度均为20个核苷酸。ASODN的长度与其细胞穿膜性、与靶序列结合的亲和性及作用特异性等有关，TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312的长度根据实验确定，本发明包含了与TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312具有相同序列的任何长度的寡核苷酸。
根据本发明，为增强ASODN的核酸酶耐受性、生物利用度、组织靶向性等，本发明包含了TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312的各种化学修饰，例如硫代修饰、半乳糖修饰、亲脂分子或靶向脂质体修饰等。
根据本发明，本发明优选的抗纤维化ASODN序列TGF982。
根据本发明，本发明的ASODN及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药制剂。
根据本发明，本发明的ASODN及其修饰物可单独使用或组成组合物形式包括联合其它ASODN及衍生物形式。
根据本发明，本发明的治疗组成，依具体情况包括特定药物的药代动力学、给药模式、给药途径、受者年龄、体重、肝肾功能状态、疾病性质、程度及治疗时限等，以合适的剂量用药。
根据本发明，本发明的ASODN及其修饰物可用于制备应用于实验室和临床的TGF-β1检测试剂盒。
本发明的实施对严重危害人类健康的纤维化相关疾病的预防及治疗具有重要的社会效益核经济效益。
结合附表
本发明的具体实施方法图1为TGF-β1cDNA电泳图谱；图2为TGF-β1表达质粒构建示意图；图3为反义寡核苷酸的SELEX筛选过程；图4为18条反义寡核苷酸序列对TGF-β1的抑制活性。
具体实施例方式
本发明的ASODN筛选及活性验证方法的一些举例性但非限制性的例子见下。
实施例一
1、TGF-β1mRNA的制备RT-PCR扩增含成熟TGF-β1蛋白及信号肽的cDNA片段，该cDNA长度为1.3kb，其5’端含Hind III酶切位点，3’端含XbaI酶切位点。经克隆至A/T载体中测序验证为正确序列。分别对含目的片段的载体进行Hind III-Xba I双酶切，回收基因片段；pSP64(polyA)载体(Promega)进行Hind III-Xba I双酶切，回收后与上述基因片段进行连接过夜，得到含SP6启动子的TGF-β1cDNA(811-2170)体外表达质粒pSP64-TGF-β1(见图1)。该表达质粒的构建如图2所示。以EcoR I酶切的线性化pSP64-TGF-β1为模板进行体外转录，回收mRNA后-70℃保存备用。
2、ssDNA随机库的设计及合成设计合成了1个ssDNA随机库，随机序列长20个碱基，翼长32个碱基；由日本Espec Oligo Service Corp.公司合成，合成规模大于6nmol，全长序列98％以上。其具体组成为5’-accagcggactcgtgc-N20-cagacgactcgcccga-3’3、靶向TGF-β1mRNA的寡核苷酸筛选杂交反应体系总体积50μl，mRNA终浓度0.2-0.25μmol/L，随机寡核苷酸库的终浓度40μmol/L。随机寡核苷酸库预先100℃处理5min，迅速置于冰浴中至少10min。mRNA与随机寡核苷酸库在42℃杂交30min。柱吸附法回收mRNA(RNeasy Mini Kit，Qiagen)，洗涤5次后以50μl水洗脱。反义寡核苷酸的SELEX筛选过程见图3。
4、ssDNA富集库的制备以洗脱液为模板进行PCR扩增，上游引物为5’-accagcggactcgtgc-3’，下游引物为5’-Bio-Bio-Bio-tcgggcgagtcgtctg-3’。PCR反应体系总体积50μl，上下游引物终浓度为2μmol/L，加入洗脱液8μl，采用HotStar Taq(Qiagen)。反应条件95℃预变性15min，94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环。8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶纯化52bp的扩增产物，作为ssDNA富集库进行下一轮筛选。
5、反义寡核苷酸序列的聚类分析筛选4-6轮后，以洗脱液为模板进行PCR扩增，上游引物为5’-accagcggactcgtgc-3’，下游引物为5’-tcgggcgagtcgtctg-3’。PCR反应体系及扩增条件同(4)。取4μl PCR产物与T-easy Vector(Promega)在4℃连接过夜，转化JM 109感受态菌，在涂有IPTG/x-gal的LB琼脂板(Amp+)上培养12-18h。挑取分隔良好的白色菌落至5ml LB培养基(Amp+)中，37℃摇床培养18h。离心收集菌体，用质粒提取试剂盒进行质粒提取及纯化。紫外定量后进行测序。采用聚类分析软件就测序结果与mRNA序列进行比对分析，确定反义寡核苷酸序列。
实施例二1、TGF-β1mRNA的制备同实施例一。
2、ssDNA随机库的设计及合成设计合成了2个ssDNA随机库，随机序列长17、26个碱基，翼长20、32个碱基；由日本Espec Oligo Service Corp.公司合成，合成规模大于6nmol，全长序列98％以上。
其具体组成为5’-accagcggactcgtgc-N26-cagacgactcgcccga-3’5’-accagcggac-N17-actcgcccga-3’3、靶向TGF-β1mRNA的寡核苷酸筛选同实施例一。
4、反义寡核苷酸序列的聚类分析同实施例一。
5、反义寡核苷酸的优化通过3个随机寡核苷酸库的筛选，发现随机序列长20个碱基，翼长32个碱基的ssDNA库结合效率最高，对TGF-β1mRNA的结合位点最明确。在对3次筛选进行比较分析后，确定了18条寡核苷酸序列，其中2条序列位于转录起始区，11条位于信号肽区，5条位于成熟肽编码区。具体序列组成见表1。
实施例三1、合成硫代修饰的反义寡核苷酸序列自动DNA合成仪合成并在合成过程中进行硫代修饰，合成规模15OD，PAGE变性凝胶电泳后切胶纯化。
2、反义寡核苷酸活性评价人口腔表皮癌细胞(KB)接种于96孔板，4×103细胞/孔，37℃、5％CO2孵育18-20h。60-80％细胞融合后，采用Opti-MEMI Reduced Serum Medium(Gibco)在无血清状态下，脂质体Oligofectamin(Invitrogen)进行细胞转染，总体积100μl，反义寡核苷酸终浓度为200nmol/L。将上述18条序列分别转染KB细胞，作用5h后加50μl含6％胎牛血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium继续培养24h。以单加培养基的细胞为空白对照，以单加脂质体的细胞为阴性对照，以单加文献报道的靶向TGF-β1mRNA序列(5’-agggcggcatgggggaggc-3’)为阳性对照(Han DC，Hoffman BB，Hong SW，et al.Therapy with antisense TGF-β1 oligodeoxynucleotides reduceskidney weight and matrix mRNAs in diabetic mice.Am J Physiol Renal Physiol，2000，278F628-F634)。每次实验中每1条硫代反义寡核苷酸序列均重复3孔，结果取其平均值。TGF-β1活性检测采用Human TGF-β1Immunoassay Kit(R&D)，按说明书进行操作。在酶标仪(BioRad)上检测450nm处的吸收值。
3、结果表明18条反义寡核苷酸序列封阻TGF-β1活性的效率各不相同(见图4)，其中8条序列经细胞学验证活性好，3条序列活性较好，7条序列无效。结果提示封阻TGF-β1活性好的8条序列是TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312。
实施例四1.ASODN的设计及合成根据实施例三的实验结果，选择设计了8条硫代反义寡核苷酸及8条相应的正义寡核苷酸(见表2)。所有ASODN的合成及纯化同前。
表2 硫代寡核苷酸的结构及性质
2.细胞培养及转染KB细胞接种于96孔板，4×103细胞/孔，37℃、5％CO2孵育18-20h。60-80％细胞融合后，采用Opti-MEM I Reduced Serum Medium在无血清状态下，脂质体Lipofectamin(Invitrogen)进行细胞转染，总体积100μl，寡核苷酸终浓度为50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L、800nmol/L。将8条硫代反义寡核苷酸序列及8条硫代正义寡核苷酸序列分别转染KB细胞，其余操作同实施例三。每次实验中每1条硫代序列的每个浓度均重复3孔，结果取其平均值。TGF-β1活性检测采用Human TGF-β1Immunoassay Kit(R&D)，按说明书进行操作。在酶标仪(BioRad)上检测450nm处的吸收值。结果表明，正义寡核苷酸的最大抑制率＜20％，而反义寡核苷酸的抑制率呈剂量依赖地增加。当浓度为800nmol/L时，TGF554、TGF982、TGF1210的抑制率分别达到82.2％、83.4％、74.1％，结果见表3。
表3 反义寡核苷酸序列封阻TGF-β1活性
权利要求
1.与人转化生长因子基因编码区互补的寡核苷酸及其化学修饰物，其中，所述寡核苷酸的长度为10-30个碱基并包含下列序列的寡核苷酸反义寡核苷酸序列及性质
2.根据权利要求书1所述的寡核苷酸，其特征是，其最佳序列为TGF554、TGF982及TGF1210。
3.根据权利要求书1所述的寡核苷酸的化学修饰物可以是硫代修饰、半乳糖修饰、亲脂分子或靶向脂质体修饰的修饰物。
4.如权利要求书1或3所述的寡核苷酸化学修饰物在制备用于预防及治疗纤维化相关疾病非肠道给药药物制剂上的用途。
全文摘要
本发明针对转化生长因子基因序列，采用SELEX技术筛选、合成的18种反义寡核苷酸，可用于抑制转化生长因子的基因表达，达到预防及治疗纤维化相关疾病的目的。本发明采用体外培养的高表达转化生长因子的人口腔表皮癌细胞，对18条互补于转化生长因子编码区的反义寡核苷酸进行了活性筛选及评价，首次发现寡核苷酸TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312及其化学修饰物在培养细胞中能有效地抑制转化生长因子基因的表达。故本发明涉及到针对转化生长因子的反义寡核苷酸的序列与结构及其成为预防纤维化产生、治疗纤维化相关疾病的新型药物。
文档编号A61P1/16GK1718585SQ20051005701
公开日2006年1月11日 申请日期2005年4月12日 优先权日2005年4月12日
发明者刘韧, 朱旭东, 谢琳, 王正国 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所