专利名称：一种双效肿瘤细胞疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤细胞疫苗的制备方法，具体的讲，它是一种由肿瘤抗原和血管内皮细胞共同组成的联合疫苗，同时兼具刺激机体抗肿瘤免疫反应和抗肿瘤血管生成的双重效应。
背景技术：
到目前为止，人类还没有攻克癌症。但生物医学领域里，治疗性肿瘤疫苗和抗血管生成治疗给治疗肿瘤带来了新的希望。治疗性肿瘤疫苗的理论基础在于肿瘤组织含有与正常组织不同的肿瘤相关抗原(TAA)，这些抗原作为免疫原能够激起机体的抗肿瘤免疫反应，包括体液免疫(生成抗体)和细胞免疫(产生肿瘤特异的细胞毒性T杀伤细胞——CTL)，从而杀伤肿瘤细胞。抗血管生成治疗是通过破坏肿瘤组织的血管系统，或抑制肿瘤新生血管，从而使肿瘤在不断增长的过程中，因得不到足够的营养物质和氧而死亡。
治疗性的肿瘤疫苗可以采用多种形式，包括自体、异体的肿瘤细胞、发现的肿瘤相关抗原的蛋白、多肽、DNA、RNA等，或它们的组合形式，这些方式都在动物试验或临床试验中可以诱导抗肿瘤的免疫反应(Current Developments in Cancer Vaccines and CellularImmunotherapy.Ribas A，Butterfield L H.，Glaspy J A，et al.Economou J Clin Oncol，2003；21(12)2415-2432)。
肿瘤细胞或肿瘤相关抗原，虽然能够激发机体的抗肿瘤免疫反应，但由于肿瘤的抗原性很弱，在绝大多数情况下，其诱导的免疫反应不足以清除体内的肿瘤细胞，于是，人们通过各种办法来提高肿瘤的抗原性，主要包括1)增加一种或几种免疫佐剂(如BCG、细菌细胞壁等)；2)加入增强免疫的细胞因子或导入能够表达细胞因子(如GM-CSF、IL-18、IL-12等)的基因；3)导入与抗原呈递有关的细胞表面分子(如B7、MHC II、等)的基因；4)与抗原呈递细胞(APC)联合使用，如以细胞裂解物、RNA、多肽、DNA、基因载体携带等多种形式体外刺激APC，或将肿瘤细胞与APC融合，此外，还可以将前述增强免疫的细胞因子、细胞表面抗原的基因导入APC。以上这些方法都在一定程度上提高了肿瘤的抗原性，但仍然未能显著的提高疗效。
在正常成年人体内，血管生成(angiogenesis)的过程只存在于妊娠、炎症、损伤修复、和肿瘤这几种情况，新生的血管内皮细胞表面会表达不同于成熟血管内皮细胞的抗原，或过量表达促进新生血管的表面抗原，如VEGFR等。大量实验和临床资料证实，针对新生血管抗原的抗血管内皮细胞抗体和一些靶向性小分子化合物可以抑制肿瘤新生血管的生成，而对于正常的成熟血管内皮细胞则没有明显的副作用(Sandler AB，Johnson DH，Herbst RS.Anti-vascular endothelial growth factor monoclonals in non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res.200415；10(12 Pt 2)4258s-4262s.)，因此抗血管生成的治疗策略在肿瘤治疗中是安全和有效的(Benouchan M，Colombo BM.Anti-angiogenic strategies for cancer therapy.Iht J Oncol.2005；27(2)563-71)。除了抗体和小分子外，微血管内皮细胞也可以作为免疫原，通过激起机体的抗血管内皮细胞免疫反应来抑制肿瘤血管生成，同样达到治疗肿瘤的目的(Okaji Y，Tsuno N H，Kitayama J，et al.Vaccination with autologous endothelium inhibits angiogenesis and metastasis ofcolon cancer through autoimmunity.Cancer Sci 2004 95(1)85-90；Wei YQ，Wang QR，Zhao X，et al.Immunotherapy of tumors with xenogeneic endothelial cells as a vaccine.Nature Med 20006(10)1160-1166；血管内皮细胞异种免疫疫苗及其制备方法(中国)公开(公告)号1276245申请(专利)号99114912.2)。
实验发现，在治疗肿瘤的过程中，肿瘤抗原诱导的免疫反应与抗血管生成治疗之间具有协同效应，两者同时使用，可以明显增强疗效。这可能是由于血管内皮细胞除了形成血管的功能外，还具有重要的免疫功能，它能够呈递抗原(Cook-Mills JM，Deem TL.Activeparticipation of endothelial cells in inflammation.J Leukoc Biol.2005；77(4)487-95.Epub 2005Jan 3.Review.)，诱导免疫反应，因此与肿瘤抗原混合后，可以进一步提高肿瘤抗原的抗原性。
肿瘤疫苗中，常常使用自体肿瘤细胞作为肿瘤抗原，因为，肿瘤是一种异质性疾病，每个患者的肿瘤都不同，即使临床诊断相同，其含有的肿瘤抗原也不完全相同，自体肿瘤细胞的特点在于提供患者的全部肿瘤抗原，因此最大限度的诱导针对患者肿瘤的免疫反应，自体肿瘤细胞的缺点在于数量有限，不可以大量传代培养，不可以进行稳定的基因修饰，更重要的是为了增强疫苗的疗效，往往需要对细胞进行基因修饰等处理，而自体细胞的个体差异导致基因修饰等处理的效果相差很远，例如，基因修饰后外源基因的表达量可以相差数百倍，甚至上千倍，这种差异导致疫苗的质量和疗效极不稳定。为了解决这个问题，在修饰基因的表达产物为分泌型的情况下，往往可以使用一种bystander细胞株，例如K562、人成纤维细胞等，并可以对这些细胞进行基因修饰等复杂，而对于自体的原代肿瘤细胞则只需要分散成单细胞即可，然后将两者混合，这样做的好处在于既可以进行基因修饰等复杂的处理以提高疗效，又可以最大限度的减少对自体肿瘤细胞的操作，从而保障疫苗质量的稳定性，进而保障疗效的稳定(Emens LA，Armstrong D，Wolff A，et al.A phase I vaccine safety andchemotherapy dose-finding trial of an allogeneic GM-CSF-secreting breast cancer vaccine given ina specifically timed sequence with immunomodulatory doses of cyclophosphamide and doxorubicin.Hum Gene Ther.2004；15(3)313-37.)。
发明内容
本专利公开的发明在于一种将血管内皮细胞和肿瘤抗原混合后作为肿瘤疫苗的方法，其中肿瘤抗原的形式可以有多种，包括灭活的自体、异体肿瘤细胞、肿瘤相关抗原多肽、DNA、RNA、肿瘤细胞裂解物、抗原蛋白质等；本发明使用的血管内皮细胞为人或其他哺乳动物的血管内皮细胞(如人皮肤微血管内皮细胞，原代的或永生化的)，经过灭活后丧失继续增殖能力，其在疫苗中具有三方面的作用，其一为诱导机体的抗血管内皮免疫反应，破坏肿瘤血管，或抑制肿瘤的新生血管生成；其二为与肿瘤抗原混合使用的过程中，呈递肿瘤抗原，增强特异性抗肿瘤细胞的免疫反应。其三永生化的血管内皮细胞株，可以传代扩增和规模化生产，因此可以作为Bystander细胞株，用于进行基因修饰等复杂处理，从而减少对肿瘤细胞的操作，保障疫苗质量和疗效的稳定性。因此内皮细胞与肿瘤抗原之间具有协同作用。
为了进一步增强疗效，在本发明所述的肿瘤疫苗中，还可以添加免疫佐剂、细胞因子，或导入增强免疫的细胞因子或免疫细胞表面分子的基因。这些基因或蛋白质可以先与肿瘤抗原结合或与血管内皮细胞结合，须根据基因的功能特点而决定。例如，GM-CSF是在疫苗设计中常用的细胞因子，它可以趋化注射部位附近的树突细胞，并促使其分化成熟，从而增加抗原的呈递，增强免疫反应；因此可以将分泌型GM-CSF基因导入血管内皮细胞或肿瘤细胞，或与肿瘤抗原肽结合成融合蛋白。
也可以将GM-CSF基因通过药物加压的方式压入永生化的人微血管内皮细胞株，再与适量的原代肿瘤细胞分别灭活、混合后制成疫苗。这种疫苗的优势在于1)联合抗血管生成和抗肿瘤免疫反应的治疗策略，获得协同效应；2)血管内皮细胞在刺激抗血管生成的免疫反应的同时，呈递肿瘤细胞抗原，增强免疫效果；3)血管内皮细胞分泌的GM-CSF，可以趋化注射部位附近的树突细胞，并促使其分化成熟，进一步增强抗原呈递功能；4)基因修饰的方法与直接应用蛋白质相比，可以有效延长GM-CSF的表达和作用时间，从而延长疫苗的作用时间；5)与自体的树突细胞疫苗方案相比，导入基因的血管内皮细胞株可以工业化生产，有利于疫苗的质量控制和标准化。
本发明所述的新型肿瘤疫苗，不但能够显著的诱导CD4+和CD8T+细胞依赖的抗肿瘤免疫反应，以及大量的肿瘤抗原特异的CD8+T杀伤细胞，同时还能显著抑制肿瘤新生血管的生成，抑制肿瘤的发生、发展。这种疫苗在治疗现有肿瘤、预防肿瘤复发和转移方面作用明显，同时不会引起严重的不良反应。
本发明中使用的血管内皮细胞可以有多种来源，包括但不限于以下几种患者自体的肿瘤组织内的血管内皮细胞、患者自体的皮肤微血管内皮细胞、同种异体的原代血管内皮细胞、同种异体的永生化的血管内皮细胞株(为肿瘤基因，如SV40大T抗原，或端粒酶永生化的人血管内皮细胞)、异种原代血管内皮细胞、异种血管内皮细胞株。
本发明对使用的肿瘤抗原没有特别的限制包括从患者肿瘤组织中新鲜分离的自体原代肿瘤细胞、体外培养的肿瘤细胞株；经过基因或半抗原(如hapten)修饰的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、体外表达的肿瘤相关抗原、如CEA、PSA等，或这些抗原多肽片断、融合蛋白(多种多肽、或与细胞因子融合)；包含肿瘤相关抗原基因或融合基因的质粒DNA，RNA.
本发明对疫苗使用的佐剂没有特别的限制包括BCG、GM-CSF、细菌细胞壁成分、半抗原、痘病毒、新城疫鸡瘟病毒。
本发明对导入血管内皮细胞或肿瘤细胞的免疫增强基因没有特别的限制，包括但不限于IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，IFN.alpha.，IFN.beta.，IFN.gamma.，TNF，TGF，GM-CSF，B7.1，B7.2，CD40，Light，Ox40，4.1.BB，Icos L，SLAM，ICAM 1，LFA-3，B7.3，CD70，HSA，CD84，CD7，B7RP-1L，MAdCAM-1，VCAM-1，CS-1，CD82，CD30，CD120a，CD120b and TNFR-RP，CD40L.或它们的组合。
对血管内皮细胞和/或肿瘤细胞进行的基因修饰可以采用多种常规使用的方法，例如重组腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、非病毒载体、质粒DNA；其中质粒DNA通过脂质体、基因枪、电穿孔等方法导入细胞，并可以通过dhfr-MTX、neo-G418、HPH-潮霉素B、TK或ADA系统中的一种或几种，进行药物加压，筛选得到稳定表达导入基因的细胞株。
血管内皮细胞或/和肿瘤细胞在经过修饰、处理后，在注射人体之前，通常需要经过灭活的步骤。在本发明中，常用的灭活方法均可以采用，包括化学灭活法，如丝裂霉素、福尔马林；物理灭活法，如加热法、射线照射法，射线的剂量一般在1000-100,000Rad，以10,000-50,000Rad最佳。
疫苗的效果可以通过检测抗原四聚体(tetramer)的方法来评估疫苗诱导产生的抗原特异的T杀伤细胞的量。四聚体是由抗原肽、标记生物素的MHC-I分子、微球蛋白和辣根酶组成的。
经过上述一种或几种处理的血管内皮细胞，一般保存在冷冻的环境(液氮或超低温冰箱中)，使用前将其从冷冻环境取出，迅速在室温～40℃的环境中融化，再与肿瘤抗原混合后注射人体，用于治疗或预防肿瘤。
经过上述一种或几种处理的肿瘤抗原，如为细胞、可溶性蛋白、多肽、DNA、RNA，一般也保存在冷冻环境，使用前将其从冷冻环境取出，迅速在室温～40℃的环境中融化，再与内皮细胞混合。如果抗原的形态是冻干制剂，在使用前需要用注射用水或其他溶剂溶解后使用。
血管内皮细胞也可以与肿瘤抗原在制备的过程中事先混合，然后冷冻保存(液氮或超低温冰箱中)，使用前取出融化即可。
疫苗的有效剂量是指能够产生治疗、改善、预防肿瘤的效果的疫苗剂量，精确的剂量与患者的体重、健康状况、疾病状态、治疗组合密切相关，因此无法实现统一规定，临床医生可以依据常规经验和患者使用后的疗效、反应来调整后续治疗的剂量。
在本发明中，血管内皮细胞的剂量一般在每次注射105～108细胞，以106～107细胞为更佳，确定患者的血管内皮细胞用量后，再根据肿瘤抗原与血管内皮细胞的比例，确定肿瘤抗原的剂量。例如以患者自体的肿瘤细胞为肿瘤抗原，则肿瘤细胞与血管内皮细胞的比例应在10∶1～0.1∶1之间，其中以5∶1～1∶1之间为佳。
疫苗的制剂组成包括治疗或预防剂量的血管内皮细胞、肿瘤抗原、基因表达载体、付型剂、佐剂、基因、蛋白质或多肽等辅助成分。
制剂的辅助成分包括1)载体成分，如基因修饰过程中使用的基因载体的残余成分；2)付型剂，如缓慢代谢的大分子蛋白质、多糖；3)溶液中的盐、冷冻保护剂(如DMSO、甘油)、白蛋白、蔗糖、乳化剂成分。制剂的最终形式是可注射的含有细胞的液态形式。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中有有关哪些辅助成分可以用于临床的详细讨论。
本发明所述的新型双效肿瘤疫苗可以用于人体，或其他哺乳动物；不但可以用于治疗多种肿瘤，也可以用于预防肿瘤的复发和转移。
本发明所述的新型双效肿瘤疫苗可以单独使用，或与放疗、化疗、手术及其他生物治疗联合应用以取得最佳的疗效。
使用方法疫苗一旦制成，既可以即刻注射，也可以冷冻保存，在需要使用的时候，融化后注射。由于疫苗中含有完整细胞成分，因此，注射器的针头应大于20G，以防止注射的过程中损伤细胞。
注射的途径没有特殊的限制，包括但不限于以下几种皮内、皮下、胸腔、腹腔、静脉、淋巴管、肌肉、肿瘤内注射，其中以腋窝、腹股沟附近的皮内注射为佳，也可以直接口服。
本发明所述的新型双效肿瘤疫苗可以直接使用，也可以在体外刺激细胞毒性T淋巴细胞，间接使用。
图1、双效疫苗预防Lewis肺癌肺转移实验中，各实验组小鼠肺表面结节计数G1PBS对照组；G2双效肿瘤疫苗治疗组；G3单纯内皮细胞+BCG治疗组。
图中纵坐标为肺表面结节数，与模型对照组(112±9，P＜0.01)相比，双效疫苗治疗组小鼠的肺表面几乎没有肿瘤结节形成(7±5，P＜0.01)，而单纯血管内皮细胞+BCG组只能抑制80％的结节形成(25±11，P＜0.01)。
图2、双效疫苗预防Lewis肺癌肺转移实验中，各实验组小鼠肺脏大体病理和显微病理。
A为PBS对照组(G1)的肺脏大体标本，可见大量白色的肿瘤结节；B为双效疫苗治疗组(G2)的肺脏大体标本，几乎没有见到结节；C为单纯血管内皮细胞+BCG治疗组(G3)的肺脏大体标本，可见少量的肿瘤结节。D、E、F分别为上述各组(G1-3)小鼠肺脏的显微病理，镜下显示各组小鼠肺内肿瘤结节的数量与大体标本相符，其中大图为HE染色(100×)，小图为吉尔森胶原纤维染色(200×)。
图3、双效疫苗预防Lewis肺癌肺转移实验中，各实验组小鼠血清中的抗肿瘤细胞抗体、抗血管内皮细胞蛋白抗体、和抗OVA抗体。
G1PBS对照组；G2双效肿瘤疫苗治疗组；G3单纯内皮细胞+BCG治疗组。
图A为各组血清中的抗血管内皮细胞蛋白抗体，可见双效肿瘤疫苗治疗组(G2)和单纯血管内皮细胞+BCG治疗组(G3)都产生了抗血管内皮细胞蛋白抗体。
图B为各组血清中的抗B16F10细胞蛋白抗体，可见只有双效肿瘤疫苗治疗组(G2)产生了抗B16F10细胞蛋白抗体。
图C为各组血清中的抗OVA抗体，同样只有双效肿瘤疫苗治疗组(G2)产生了抗OVA蛋白抗体。
图4、双效疫苗预防B16肿瘤转移实验中，各实验组小鼠肺表面结节计数G1PBS对照组；G2单纯B16细胞裂解物治疗组；G3双效肿瘤疫苗治疗组。
图中纵坐标为小鼠肺表面结节数。可见双效疫苗治疗组，与模型对照组和单纯B16细胞裂解物治疗组进行比较，肺表面结节数仅为13±6，明显少于模型对照组(136±32，P＜0.01)和单纯B16细胞裂解物治疗组(128±30，P＜0.01)，差异具有显著性，而单纯B16细胞裂解物则几乎没有治疗作用(P＞0.05)。
图5、双效疫苗治疗小鼠B16F10移植瘤模型中，各实验组的平均肿瘤体积、肿瘤发生率。
▲——G1PBS对照组；●——G2单纯血管内皮细胞治疗组；◆——G3血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组；○——G4双效疫苗治疗组。
图A为各实验组平均瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标为各组平均瘤体积(mm3)，比较可见PBS对照组(G1)＞单纯血管内皮细胞治疗组(G2)＞血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)＞双效疫苗治疗组(G4)。
图B为各实验组肿瘤发生率随时间变化的曲线，横坐标为肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标为各组的肿瘤发生率(％)，比较可见PBS对照组(G1)＞单纯血管内皮细胞治疗组(G2)＞血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)＞双效疫苗治疗组(G4)。
图6、双效疫苗治疗小鼠移植瘤模型中，各实验组小鼠脾淋巴细胞的CTL检测。
▲——G1PBS对照组；●——G2单纯血管内皮细胞治疗组；◆——G3血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组；○——G4双效疫苗治疗组。
图中横坐标为效应细胞和靶细胞的比例，纵坐标为采用51Cr释放试验检测CTL的杀伤率(％)，可见PBS对照组(G1)和单纯血管内皮细胞治疗组(G2)都未能诱导针对B16F10的特异性CTL，而双效疫苗治疗组(G4)和血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)有效诱导了针对肿瘤细胞B16F10的特异性CTL反应，其中双效疫苗治疗组(G4)的作用明显优于血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)。
图7、双效疫苗治疗小鼠移植瘤模型中，各实验组小鼠背部皮下埋植的海藻酸钙胶囊照片。
图A为PBS对照组(G1)，可见海藻酸钙胶囊上大量的新生血管；图B为单纯血管内皮细胞治疗组(G2)，可见海藻酸钙胶囊上新生血管明显减少；图C血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)，可见海藻酸钙胶囊上新生血管明显减少；图D为双效疫苗治疗组(G4)，可见海藻酸钙胶囊上几乎没有新生血管。
图8、双效疫苗治疗小鼠CT26移植瘤模型中，各实验组的平均肿瘤体积、肿瘤发生率。
◆——G1PBS对照组；■——G2单纯CT26肿瘤细胞治疗组；▲——G3双效疫苗治疗组。
图A为各实验组肿瘤发生率随时间变化的曲线，横坐标为肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标为各组的肿瘤发生率(％)，比较可见PBS对照组(G1)与单纯肿瘤细胞治疗组(G2)的发生率类似，而双效疫苗治疗组(G3)的发生率则明显低于前两组。
图B为各实验组平均瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标为各组平均瘤体积(mm3)，比较可见PBS对照组(G1)与单纯肿瘤细胞治疗组(G2)的瘤体积类似，而双效疫苗治疗组(G3)的瘤体积则明显低于前两组。
图9、双效疫苗体外刺激淋巴细胞过继治疗A549移植瘤实验中，各组的平均瘤体积。
◆——G1PBS对照组；■——G2单纯A549细胞刺激的淋巴细胞治疗组；▲——G3双效疫苗刺激的淋巴细胞治疗组。
图中所示为各实验组平均瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标为各组平均瘤体积(mm3)，比较可见PBS对照组(G1)的瘤体积略大于单纯A549细胞刺激的淋巴细胞治疗组(G2)的瘤体积，而双效疫苗刺激的淋巴细胞治疗组(G3)的瘤体积则明显小于前两组。
具体实施例方式
以下实施例中将进一步具体说明这种双效疫苗的制备和使用方法，本发明包括但不限于以下实施例中列举的具体方法。
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
实施例1添加免疫佐剂的血管内皮细胞的制备体外培养(DMEM+10％FBS)的小鼠淋巴结微血管内皮细胞——SVEC4-10，扩增至1×108，以PBS清洗细胞2遍，收集细胞至离心管中，以DMEM重悬至1×107/ml，20000rad照射灭活。加入浓度为1×108/ml的BCG悬液，两者比例为v∶v＝4∶1，混合后血管内皮细胞的浓度为8×106/ml，BCG的浓度为2×107/ml，然后置于冰上，逐滴加入等体积的冻存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分装至0.1ml/支，-70℃保存。
实施例2细胞裂解物形态的肿瘤抗原的制备方法在C57小鼠腋下接种Lewis肺癌细胞1×106个，一周后，小鼠腋下形成1cm3瘤块，切下瘤块，以眼科剪剪成1mm3酱状，机械挤压通过200目细胞筛，或采用Peters等人发表的酶消化法(Cancer Research，391353-1360，1979)，获得肿瘤单细胞悬液，以PBS清洗细胞2遍。计数，以生理盐水重悬细胞至1×107/ml，至于-70℃无水乙醇域中20min，取出后，迅速置于37℃水域中10min，取出后振荡1min，如此往复循环3-6次，至细胞完全破裂，4000rpm离心后取上清，即为肿瘤细胞裂解物。为了便于在实验中检测是否形成针对特异抗原的免疫反应，在细胞裂解物中混入OVA 0.1mg/ml，混匀后，分装成0.1ml/支，冻存在-70℃保存。同样方法也可以制备B16(黑色素瘤)细胞的裂解物。
实施例3新型双效疫苗的制备之一每一支双效疫苗是由一支冻存的内皮细胞(见实施例1)和一支冻存的肿瘤细胞裂解物(见实施例2)在37℃水域融化后混合，然后可以直接用于注射，或在体外刺激CTL。
实施例4新型双效疫苗预防Lewis肺癌细胞的肺转移6周龄雄性SPF级C57小鼠30只，随机分为3组(G1-3)，每组10只，G1PBS对照组；G2双效疫苗治疗组；G3单纯血管内皮细胞+BCG治疗组；在小鼠右腋窝皮下注射疫苗，每周注射一次，每次一支，连续6周。然后尾静脉注射Lewis肺癌细胞1×105/只，建立肺转移肿瘤模型，12天后处死小鼠，取下小鼠肺脏，计数肺表面肿瘤结节，检测肺脏病理。
实验结果显示，见图1，与模型对照组(112±9，P＜0.01)相比，双效疫苗治疗组小鼠的肺表面几乎没有肿瘤结节形成(7±5，P＜0.01)，而单纯血管内皮细胞+BCG组可以抑制80％的结节形成(25±11，P＜0.01)。图2显示各组小鼠的肺脏大体和显微病理。
实施例5新型双效疫苗刺激产生抗体ELISA法检测实施例4中各组小鼠血清中抗SVEC4-10细胞和抗Lewis肺癌细胞可溶性蛋白的抗体、抗OVA抗体。提取SVEC4-10细胞和Lewis肺癌细胞的可溶性蛋白，分别加入ELISA板中，4℃包被过夜，以2.5％BSA室温封闭30min，洗板三次，风干，保存于4℃，使用时加入小鼠血清100ul，37℃孵育1小时，洗板三次，加入辣根酶标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育30min，洗板三次，加入底物，室温避光反应10-30min，450nm检测OD值。检测OVA抗体的方法与之相同，只是在ELISA板中包被OVA蛋白。
单纯内皮细胞疫苗和双效疫苗注射后均可刺激机体产生抗血管内皮细胞可溶性蛋白的抗体、双效疫苗同时还可以刺激产生抗肿瘤细胞可溶性蛋白抗体和抗OVA抗体(见图3)。
实施例6新型双效疫苗预防B16黑色素瘤细胞的肺转移采用与实施例4同样的方法建立B16细胞的肺转移模型，然后以双效疫苗预防肺转移，与模型对照组和单纯B16细胞裂解物治疗组进行比较(见图4)，双效疫苗治疗组的肺表面结节数为13±6，明显少于模型对照组(136±32，P＜0.01)和单纯B16细胞裂解物治疗组(128±30，P＜0.01)，差异具有显著性。
实施例7基因修饰的血管内皮细胞的制备体外培养经SV40大T抗原转化的人皮肤微血管内皮细胞(HMEC-1)，培养条件是MCDB131(Gibco/BRL 10372)，添加10％FBS、10ng/ml EGF(表皮生长因子)、1ug/ml氢化可的松。
利用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因扩增系统，可以建立稳定、高水平表达外源基因的细胞株。以质粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)为骨架，插入hGM-CSF(人粒单细胞集落刺激因子)基因，成为pSV2-GM。以脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen 11668-027)将pSV2-GM质粒转染HMEC-1细胞，操作方法参见Invitrogen公司说明书。以含有MTX的选择培养基筛选阳性克隆。使用ELISA试剂盒检测各阳性克隆细胞的上清中hGM-CSF的表达量。逐步增加MTX的含量至800nM，获得表达量为1.2ug/106cell/24hr的细胞株。
撤去MTX，该细胞株仍然稳定表达hGM-CSF。将该细胞株培养扩增至1×108，以PBS清洗细胞2遍，收集细胞至离心管中，以DMEM重悬至8×106/ml，20000rad照射灭活。然后将细胞置于冰上，逐滴加入等体积的冻存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分装至0.1ml/支，-70℃保存。
实施例8肿瘤细胞形态的肿瘤抗原的制备方法在C57小鼠腋下接种B16F10(黑色素瘤)细胞1×106个，一周后，小鼠腋下形成1cm3瘤块，切下瘤块，以眼科剪剪成1mm3酱状，通过200目细胞筛，以PBS清洗细胞2遍。计数，以DMEM重悬至2×107/ml，20000rad照射灭活。将细胞置于冰上，逐滴加入等体积的冻存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分装至0.1ml/支，-70℃保存。同样方法也可以制备CT26结肠癌细胞的细胞形态肿瘤抗原。
实施例9新型双效疫苗的制备之二每一支双效疫苗是由一支冻存的内皮细胞(见实施例7)和一支冻存的肿瘤细胞(见实施例8)在37℃水域融化后混合，然后可以直接用于注射，或在体外刺激CTL。
实施例10新型双效疫苗治疗B16F10细胞的移植瘤6周龄雄性SPF级C57小鼠40只，左腋下注射B16F10细胞1×105/只，建立移植瘤模型。将小鼠随机分为4组，每组10只，G1PBS对照组；G2单纯血管内皮细胞治疗组；G3血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组；G4双效疫苗治疗组(见实施例9)。从左腋下注射B16F10细胞，建立移植瘤模型的第3天，在小鼠右腋窝皮下注射疫苗，每周注射一次，每次一支，连续5周，其中G3组小鼠在右腋窝和右侧腹股沟皮下分别注射一支内皮细胞(见实施例7)和一支肿瘤细胞(见实施例8)。每隔三天测量各组小鼠肿瘤体积，记录肿瘤发生率。
实验结果显示，双效疫苗治疗组的疗效好于其他治疗组(见图5)，肿瘤不发生或生长非常缓慢，比较各组的瘤体积(图A)G1＞G2＞G3＞G4；比较各组的肿瘤发生率可见(图B)G1＞G2＞G3＞G4。
实施例11新型双效疫苗刺激肿瘤特异的细胞毒T淋巴细胞杀伤功能细胞毒T淋巴细胞杀伤功能检测(CTL试验)，采用4h51Cr释放试验检测，参照Asada H等人的方法(J Gen Virol，1988，692179-2188)实施例10中，各组小鼠完成疫苗治疗后1周，每组随机取2只小鼠。无菌条件下解剖小鼠，取脾，剪碎后，加少量Hank′s液，于100目铜网上碾磨分散脾细胞，用淋巴细胞分离液分离制备脾淋巴细胞，用含2μg/ml的ConA、20U/ml IL-2的1640培养液(10％FBS)，37℃5％CO2培养1～2天。
将分离的1×107淋巴细胞与5×105经过照射灭活的B16F10细胞混合培养5天，37℃5％CO2用含20U/ml IL-2的1640培养液(10％FBS)，调节细胞浓度为1×107/ml。使淋巴细胞活化，此即为效应细胞。
收集体外培养的B16F10细胞，用DMEM调细胞浓度为4×106/ml，取0.5ml细胞，加入100uci Na251CrO4，37℃孵育2h进行标记，洗3次后调浓度为1×105cells/ml，此即为51Cr标记的靶细胞。
将靶细胞悬液加入园底96孔培养板中，每孔100μl，设3个复孔，以不同比例加入效应细胞(参照表1)表1
每孔加入100μl，最大释放组加入100μl 1％ Triton X-100，自然释放组加入100μl培养基。96孔板水平转头500r/min离心5min，37℃5％CO2培养4h～6h；1000r/min离心5min，每孔取100μl上清，Backmen550B型γ计数仪测cpm值。结果以CTL杀伤率表示，按如下公式计算杀伤率％＝(实验组cpm-自然释放cpm)×100/(最大释放cpm-自然释放cpm)。特异性CTL活性必须满足如下条件自然释放cpm值不能大于最大释放cpm值的30％；对照组的杀伤率在20％以下。各组以每份标本平均值±SD进行统计学处理，以每组最终的平均值作为结果。
51Cr释放试验显示，双效疫苗能够有效诱导针对肿瘤细胞的CTL反应，而且作用明显优于血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(见图6)。
实施例12新型双效疫苗刺激细胞毒T淋巴细胞的细胞因子的表达实施例11中，各组小鼠脾淋巴细胞与B16F10细胞共孵育5天后，取细胞上清100μl，用ELISA法检测上清中IFN-γ和TNF-α的表达量，操作方法参见试剂盒说明书。
ELISA检测结果显示双效疫苗组的脾淋巴细胞经抗原刺激后，分泌的IFN-γ和TNF-α明显高于其他各组(见表2)。
表2
G1PBS对照组；G2单纯血管内皮细胞治疗组；G3血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组；G4双效疫苗治疗组。
各组小鼠的脾淋巴细胞经肿瘤细胞B16F10抗原刺激后，分泌IFN-γ和TNF-α，比较各组的分泌量，可见双效疫苗治疗组(G4)＞血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)＞单纯血管内皮细胞治疗组(G2)和PBS对照组(G1)。
实施例13新型双效疫苗抑制肿瘤新生血管的生产以1.5％的海藻酸钠溶液重悬B16F10细胞至1×106/ml待用，250mM氯化钙溶液加热至37℃，并以磁力搅拌器搅拌，逐滴加入混有细胞的海藻酸钠溶液，形成海藻酸钙胶囊。实施例10中，疫苗注射后一周，每组取2只小鼠，麻醉后，无菌条件下切开背部皮肤，皮下埋植海藻酸钙胶囊后缝合。14天后，手术取出埋植的海藻酸钙胶囊，可见单纯血管内皮细胞治疗组(G2)和血管内皮细胞与肿瘤细胞抗原分离治疗组(G3)的胶囊表面新生血管与对照组(G1)相比明显减少，而双效疫苗治疗组(G4)则几乎没有血管生成(见图7)。
实施例14新型双效疫苗治疗CT26细胞的移植瘤采用同样方法建立CT26结肠癌细胞的移植瘤模型，然后以双效疫苗治疗已经建立的移植瘤，与模型对照组和单纯CT26结肠癌细胞治疗组进行比较，肿瘤的发生率明显降低，瘤体积也明显减小(见图8)。
实施例15新型双效疫苗的制备之三体外培养的A549(人肺腺癌)细胞，收集至离心管中，计数，以DMEM重悬至2×107/ml，20000rad照射灭活。将细胞置于冰上，逐滴加入等体积的冻存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分装至0.1ml/支，-70℃保存。由一支冻存的内皮细胞(见实施例7)和一支冻存的A549细胞在37℃水域融化后混合而成一支双效疫苗。
实施例16双效疫苗体外刺激淋巴细胞按照常规的方法体外培养人外周血淋巴细胞，以含10％FBS的1640培养基调整细胞浓度为1×106/ml，37℃培养2天。
每100ml淋巴细胞悬液加入一支双效疫苗(见实施例15)或单纯A549细胞进行刺激，轻柔混匀，加入IL-220u/ml，37℃继续培养10-14天。收集细胞，离心后重悬于生理盐水，可以直接用于静脉注射。
实施例17双效疫苗体外刺激的淋巴细胞治疗A549移植瘤4周龄雄性SPF级SCID小鼠30只，左腋下注射A549细胞1×106/只，建立移植瘤模型。将小鼠随机分为3组，每组10只，G1PBS对照组；G2单纯A549细胞刺激的淋巴细胞治疗组；G3双效疫苗刺激的淋巴细胞治疗组。从左腋下注射A549细胞，建立移植瘤模型的第2天，经尾静脉注射实施例16中的刺激后的淋巴细胞，每只小鼠每天注射5×106细胞，连续3天。每隔三天测量各组小鼠肿瘤体积。
实验结果显示，双效疫苗治疗组的疗效明显好于其他治疗组(见图9)，肿瘤不发生或生长非常缓慢，比较各组的肿瘤体积可见G1＞G2＞G3。
权利要求
1.一种用于治疗肿瘤和预防肿瘤转移和复发的疫苗，该疫苗包含二个组分a)血管内皮细胞；b)肿瘤抗原。通过刺激机体产生针对肿瘤抗原的免疫反应和抗肿瘤血管生成两个方面抑制肿瘤，并且两者之间具有协同作用。
2.根据权利要求1的疫苗，其特征在于，所述的血管内皮细胞是患者自体的肿瘤组织内的血管内皮细胞、患者自体的皮肤微血管内皮细胞、异体的原代血管内皮细胞、同种异体的永生化的血管内皮细胞、异种原代血管内皮细胞或异种血管内皮细胞株。
3.根据权利要求1的疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原是来自患者肿瘤组织中新鲜分离的自体原代肿瘤细胞、体外培养的肿瘤细胞株、经过基因或抗原修饰的肿瘤细胞。
4.根据权利要求1的疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原是肿瘤细胞裂解物、体外表达的肿瘤相关抗原、抗原多肽片断、多种多肽片段的融合蛋白、多肽与细胞因子组成的融合蛋白，肿瘤抗原DNA、肿瘤组织中提取的RNA或体外转录的肿瘤抗原RNA。
5.根据权利要求2和权利要求3的疫苗，其特征在于，对血管内皮细胞和/或肿瘤细胞进行基因修饰。
6.根据权利要求5的疫苗，所述的用于基因修饰的免疫增强基因为IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，IFN.alpha.，IFN.beta.，IFN.gamma.，TNF，TGF，GM-CSF，B7.1，B7.2，CD40，Light，Ox40，4.1.BB，Icos L，SLAM，ICAM 1，LFA-3，B7.3，CD70，HSA，CD84，CD7，B7RP-1L，MAdCAM-1，VCAM-1，CS-1，CD82，CD30，CD120a，CD120b，TNFR-RP，CD40L中的至少一种。
7.根据权利要求5的疫苗，所述基因修饰的方法是通过重组腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体、非病毒载体、质粒DNA中的至少一种。
8.根据权利要求2和权利要求3的疫苗，其特征在于，疫苗中血管内皮细胞的剂量为每次注射105～108细胞，肿瘤细胞与血管内皮细胞的比例在10∶1～0.1∶1之间。
9.根据权利要求1-8的疫苗，其特征在于，所述的肿瘤疫苗用于治疗人类或其他哺乳动物的肿瘤，或预防其肿瘤的复发和转移。
10.根据权利要求1-8的疫苗，其特征在于，所述的肿瘤疫苗直接使用，或在体外刺激淋巴细胞，间接使用，或与放疗、化疗、手术及其他生物治疗联合使用。
11.根据权利要求1-8的疫苗，其特征在于，所述的肿瘤疫苗的给药途径包括皮内、皮下、胸腔、腹腔、颅腔、静脉、淋巴管、肌肉、肿瘤内、肿瘤周围注射或口服。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤细胞疫苗的制备方法，旨在提供一种治疗肿瘤或预防肿瘤转移和复发的肿瘤疫苗的制备方法，这种肿瘤疫苗不但能够刺激机体产生抗肿瘤的免疫反应，同时抑制肿瘤的血管生成，从两个方面协同抑制肿瘤的发生发展，因此称为双效肿瘤细胞疫苗。该疫苗由肿瘤抗原和血管内皮细胞两个组分组成。本发明的主要用途是制备自体或异体肿瘤细胞疫苗；体外诱导制备特异性抗肿瘤CTL，间接刺激免疫反应。
文档编号A61K45/00GK1899607SQ20051008408
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月18日 优先权日2005年7月18日
发明者康禹 申请人:康禹