专利名称：一种过敏性反应抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种过敏性反应抑制剂，特别是涉及由于过敏源引起人或动物变态反应或导致过敏性疾病，尤其针对跳蚤过敏性皮炎的一种抑制剂。
背景技术：
跳蚤无宿主特异性，可在任何哺乳类及鸟类动物身上吸血寄生。猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)主要寄生于猫和犬，而犬栉首蚤(Ctenocephalidescanis)只限于家犬和野生犬科动物。跳蚤过敏性皮炎(Flea Allergy Dermatitis，FAD)是猫犬最常见的皮肤病。跳蚤过敏性皮炎，是由于跳蚤寄生于猫犬，叮咬时其唾液刺激引起的过敏性反应，被噬咬部位出现红肿骚痒，自行抓痒往往引起外伤使皮肤溃烂，进一步引起其它的细菌或真菌感染，对猫犬造成很大的危害，而目前缺乏有效的药物治疗或预防这一疾病。
一般跳蚤抗原指来自跳蚤抗原引起过敏反应的多种大小不同的蛋白质，也有部分文献称之为猫跳蚤唾液过敏原蛋白FSA1，猫跳蚤主要过敏源蛋白Fel dI，及狗过敏源蛋白一唾液脂肪促成素Can f 1和2。目前，GeneBank公布了来自猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)的唾液腺的一种蛋白，其序列如表中序列5所示；具有次级B分泌肽序列的主要过敏源蛋白Fel dI，其416bp mRNA编码序列为GeneBankM74953的自5′端第1位碱基至第416位碱基，其开放阅读框架为GeneBank M74953的自5′端第26位碱基至第292位碱基，编码88个氨基酸残基；主要过敏源蛋白Fel dI，其410bp mRNA编码序列为GeneBank M74952的自5′端第1位碱基至第410位碱基，其开放阅读框架为GeneBank M74952的自5′端第8位碱基至第286位碱基，编码92个氨基酸残基；狗过敏源蛋白抗原Can f 1，其525bp mRNA编码序列为GeneBankAF027177的自5′端第1位碱基至第525位碱基，其开放阅读框架为GeneBankAF027177的自5′端第1位碱基至第525位碱基，编码174个氨基酸残基；狗过敏源蛋白抗原Can f 2，其791bp mRNA编码序列为GeneBank AF027178的自5′端第1位碱基至第791位碱基，其开放阅读框架为GeneBank AF027178的自5′端第195位碱基至第737位碱基，编码180个氨基酸残基。
其它过敏源也会引起动物或人变态反应，导致动物和人病害。如，螨虫过敏源蛋白抗原Der P 1，其1099bp mRNA编码序列为GeneBank DPU11695的自5′端第1位碱基至第1099位碱基，其开放阅读框架为GeneBank DPU11695的自5′端第50位碱基至第1012位碱基，编码320个氨基酸残基；花生过敏源蛋白抗原Ara h II，的开放阅读框架为GeneBank L77197的自5′端第141位碱基至第473位碱基，编码110个氨基酸残基；花生过敏源蛋白抗原Ara h 5，其743bp mRNA编码序列为GeneBankAF059616的自5′端第1位碱基至第743位碱基，其开放阅读框架为GeneBankAF059616的自5′端第17位碱基至第412位碱基，编码131个氨基酸残基；日本雪松过敏源蛋白抗原Cry j 1.1，其1313bp mRNA编码序列为GeneBank B081310的自5′端第1位碱基至第1313位碱基，其开放阅读框架为GeneBank B081310的自5′端第46位碱基至第1170位碱基，编码374个氨基酸残基；日本雪松过敏源蛋白抗原Cry j1.1，其1295bp mRNA编码序列为GeneBank AB081309的自5′端第1位碱基至第1295位碱基，其开放阅读框架为GeneBank AB081309的自5′端第62位碱基至第1186位碱基，编码374个氨基酸残基；日本雪松过敏源蛋白抗原Cry j 1.2，其1295bp mRNA编码序列为GeneBank B081310的自5′端第1位碱基至第1295位碱基，其开放阅读框架为GeneBahk B081310的自5′端第62位碱基至第1186位碱基，编码374个氨基酸残基；热带无爪螨过敏源蛋白抗原Blo t 5，其537bp mRNA编码序列为GeneBankU59102的自5′端第1位碱基至第537位碱基，其开放阅读框架为GeneBank U59102的自5′端第33位碱基至第437位碱基，编码134个氨基酸残基。
发明内容
本发明的宗旨是提供一种针对跳蚤过敏性皮炎，和由于其它过敏源引起家畜动物及其它动物变态反应所导致病害的抑制剂。
本发明所提供的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，包括含有跳蚤唾液过敏原蛋白(felis salivary antigen 1，FSA1)或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和下述任一种物质所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽，跳蚤抗原和所述跳蚤唾液过敏原蛋白。
所述跳蚤唾液过敏原蛋白具有序列表中序列5的氨基酸残基序列。
所述跳蚤唾液过敏原蛋白可在大肠杆菌或真核细胞(如酵母、CHO细胞)中表达，如通过分子克隆的方法将所述跳蚤唾液过敏原蛋白的编码基因连接入相应的表达载体中，使FSA1产物经大肠杆菌、酵母菌或CHO细胞系统表达，经纯化而得到此跳蚤唾液过敏原蛋白抗原。
所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽具有序列表中序列1的氨基酸残基序列或具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的多肽命名为pep66，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的多肽命名为pep100。
pep66的编码基因可具有序列表中序列3的核苷酸序列，pep100的编码基因可具有序列表中序列4的核苷酸序列。
将具有序列表中序列3的核苷酸序列的pep66编码基因命名为FAD66，具有序列表中序列4的核苷酸序列的pep100编码基因命名为FAD100。
所述真核细胞表达载体可为质粒表达载体、病毒或噬菌体表达载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的表达载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的表达载体等基因工程领域中常用的表达载体。
所述真核细胞表达载体中，调控所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其表位多肽编码基因表达的启动子可为RSV(肉瘤病毒)、CMV(巨细胞病毒)或SV40病毒的启动子。
所述跳蚤抗原可购买于美国Greer Laboratory公司(Lenoir，北卡，美国)，也可按照以下方法制备根据Lee et al.(Parasite Immunology 1913-19，1997)所述系统饲养跳蚤。从成年未获得食物的雌性跳蚤中分离到2000个唾液腺，将其置于SDS-还原缓冲液中，在涡流振荡器振荡30秒，粉碎腺体，得到跳蚤抗原，可储存在-20℃。
所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂包括含有所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽；所述真核细胞表达载体中的所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因与跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1(摩尔比为1-20∶100,000；优选为15∶100,000)。
所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂包括含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和跳蚤抗原；所述跳蚤抗原和所述真核细胞表达载体中的跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1(摩尔比为100,000∶1-20；优选为100,000∶15)。
所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂包括跳蚤唾液过敏原蛋白和含有所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体；所述跳蚤唾液过敏原蛋白和所述真核细胞表达载体中的跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1(摩尔比为100,000∶1-20；优选为100,000∶15)。
所述含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体为pcDF66或pcDF100。
所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂的用量一般为1250μg/kg体重/次，每7-14天给药一次，一般共需2-3次。
昆明白，Balb/c和C57BL/6三种小鼠免疫实验证明，由含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体(如pcDF66或pcDF100)和跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽(pep66或pep100)或跳蚤抗原(跳蚤唾液过敏原蛋白)组成的跳蚤过敏性皮炎抑制剂可有效地抑制跳蚤过敏性皮炎，其效果优于含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体或跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽或跳蚤抗原(跳蚤唾液过敏原蛋白)单独免疫。不同表位的DNA序列在抑制程度上有一定的差异，FAD100似乎有更好的抑制效果。三种不同品系的小鼠得到基本一致的结果，表明免疫抑制不受MHC遗传背景的限制。由上述内容可以直接推导出，由含有跳蚤唾液过敏原蛋白编码基因的真核细胞表达载体和跳蚤唾液过敏原蛋白、跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽或跳蚤抗原组成的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，也可有效地抑制跳蚤过敏性皮炎。
免疫小鼠T细胞增殖实验和相关细胞因子扩增实验证明由含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽或跳蚤抗原(跳蚤唾液过敏原蛋白)组成的跳蚤过敏性皮炎抑制剂可以抑制抗原特异性的T细胞增殖，从而抑制过敏反应。免疫抑制可能是由IL-10诱导，从而抑制IL-5和IL-13等其他细胞因子的表达水平。本发明的跳蚤过敏性皮炎抑制剂可有效预防和/或治疗跳蚤过敏性皮炎，特别是由猫栉首蚤引起的跳蚤过敏性皮炎。
更进一步说明，本发明的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，还可包括编码抗原的质粒DNA和该抗原表位多肽；或包括编码抗原的质粒DNA和该抗原蛋白质。
本发明提供的治疗由于抗原引发的猫、犬以及人过敏性疾病的药物，包括编码抗原的质粒DNA和该抗原表位多肽；或包括编码抗原的质粒DNA和该抗原蛋白质。
所述抗原表位多肽或抗原蛋白质包括但不限于尘螨过敏蛋白Der pl，Der f l和Blot t 5；猫过敏蛋白Fel d 1；狗过敏源蛋白Can f 1，Can f 2；花生过敏蛋白Ara h II，Ara h 5；日本雪松花粉过敏蛋白Cry j l和Cry j 2；热带无爪螨过敏原蛋白抗原B1o t 5。
本发明的抑制剂和药物可用于调节免疫系统，尤其是抑制T细胞免疫所引起的自身免疫性疾病，可进行基因治疗、免疫和免疫预防等。这种候选抗原有引起人和动物诱发变态反应导致疾病的过敏源，如类似蚤的唾液蛋白、犬过敏源、猫过敏源、尘螨过敏源、花生过敏源、日本雪松花粉等。这些抗原蛋白质具有激发机体产生免疫反应的序列，或只含有它们的抗原决定族序列部分。
本发明的抑制剂和药物能有效的预防和治疗这种由于过敏源导致的诸如跳蚤过敏皮炎等变态反应性疾病，其应用将十分广泛而有益。
图1是pcDF66构建过程示意图。
图2a是pcDF66-GFP和pcDF100-GFP的酶切鉴定图谱。
图2b是pcDF66和pcDF100的酶切鉴定图谱。
图3a是一张pcDF100-GFP在CV1细胞中表达的照片。
图3b是一张pcDF66-GFP在CV1细胞中表达的照片。
图4a为昆明白小鼠的皮试结果。
图4b为Balb/c小鼠的皮试结果。
图4c为C57B/6小鼠的皮试结果。
图5a为Balb/c小鼠的T细胞增殖结果。
图5b为C57B/6小鼠的T细胞增殖结果。
图6为三种免疫小鼠细胞因子RT-PCR结果。
图7a为昆明白小鼠的IgE检测结果。
图7b为Balb/c小鼠的IgE检测结果。
图7C为C57B/6小鼠的IgE检测结果。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽的合成和含有该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体的构建
1、跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽pep66和pep100及其编码基因的合成通过Epitlot软件对跳蚤唾液过敏原蛋白进行MHC class II表位分析，确定表位多肽序列，并化学合成表位多肽Peptide66-80QEKEKCMKFCKKVCK(序列1)，称为pep66；Peptide100-114GPDWKVSKECKDPNN(序列2)，称为pep100。
人工合成pep66和pep100的编码基因序列FAD66和FAD100FAD66CAAGAGAAAG AAAAATGTAT GAAATTTTGC AAAAAAGTTT GCAAA(序列3)FAD 100GGTCCTGATT GGAAAGTAAG CAAAGAATGC AAAGATCCCA ATAAC(序列4)2、FAD66和FAD100表达载体的构建以pGFP(购自Clonetech公司)为模板，以P66F和PR为引物PCR扩增GFP基因，以P100F和PR为引物PCR扩增GFP基因。其中，P66F5’-AAGCTTGCCATGCAAGAGAA AGAAAAATGT ATGAAATTTT GCAAAAAAGT TTGCAAAGGTACC GCCATGGTGAGCAAGGG CGAGGA-3’(该序列中自5′端第13位-57位碱基为FAD66，自5′端第58位-63位碱基为Kpn I识别位点，自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点)，PR5’-TTA GGTACCTTAC TTGTAC AGCTCGTCCAT-3’(该序列中自5′端第4位-9位碱基为KpnI识别位点)，P100F5’-AAGCTTGCCA TG GGTCCTGATTGGAAAGTA AGCAAAGAAT GCAAAGATCC CAATAACGGT ACC GCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(该序列中自5′端第13位-57位碱基为FAD66，自5′端第58位-63位碱基为Kpn I识别位点，自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点)，PR5’-TTAGGTACCTTAC TTGTAC AGCTCGTCCAT-3’(该序列中自5′端第4位-9位碱基为KpnI识别位点)。利用BamHI和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pcDNA3(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有FAD66和GFP基因的质粒pcDF66-GFP和含有FAD100和GFP基因的质粒pcDF100-GFP。将pcDF66-GFP和pcDF100-GFP用KpnI消化后，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收大片段，再进行自连接，最后将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶KpnI酶切鉴定得到阳性克隆(如图2a和图2b所示)，即得到FAD66表达载体pcDF66(构建过程如图1所示)和FAD100表达载体pcDF100。
图2a中，1为DL 15000(15000、10000、7500、5000、2500、1000和250bp)，2为pcDF66-GFP酶切片段5.4kb和0.7kb，3为pcDF100-GFP酶切片段5.4kb和0.7kb；图2b中，1为DL 15000(15000、10000、7500、5000、2500、1000和250bp)，2为pcDF66酶切片段5.4kb，3为pcDF100酶切片段5.4kb。
3、pcDF66-GFP和pcDF100-GFP的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对各质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转然24h后，在荧光显微镜下观察，结果如图3a和图3b所示，表明pcDF100-GFP(图3a)和pcDF66-GFP(图3b)可以在真核细胞中表达。证明pcDF100-GFP和pcDF66-GFP也可以在真核细胞中表达。
实施例2、本发明的跳蚤过敏性皮炎抑制剂对跳蚤过敏性皮炎的抑制1、昆明白小鼠实验取360只雌性昆明白小鼠，均分为12组，每组30只，第1组每只分别免疫含100微克pcDF66的0.9％NaCl水溶液100微升，第2组每只分别免疫含100微克pep66的0.9％NaCl水溶液100微升，第3组每只分别免疫含50微克pcDF66和50微克pep66的0.9％NaCl水溶液100微升，第4组每只分别免疫含100微克pcDF100的0.9％NaCl水溶液100微升，第5组每只分别免疫含100微克pep100的0.9％NaCl水溶液100微升，第6组每只分别免疫含50微克pcDF100和50微克pep100的0.9％NaCl水溶液100微升，第7组每只分别免疫含50微克pcDF66和50微克pep100的0.9％NaCl水溶液100微升，第8组每只分别免疫含50微克pcDF100和50微克pep66的0.9％NaCl水溶液100微升，第9组每只分别免疫含100微克跳蚤抗原(购自Greer Lab公司，美国北卡，灭活的跳蚤抗原)的0.9％NaCl水溶液100微升，第10组每只分别免疫含50微克跳蚤抗原(购自Greer Lab公司，美国北卡，灭活的跳蚤抗原)和50微克pcDF66的0.9％NaCl水溶液100微升，第11组每只分别免疫含50微克跳蚤抗原(购自Greer Lab公司，美国北卡，灭活的跳蚤抗原)和50微克pcDF100的0.9％NaCl水溶液100微升，第12组每只分别免疫含100微克pcDNA3的0.9％NaCl水溶液100微升作为对照。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第7天按如下方法进行皮试小鼠胸腔腹侧脱毛，皮内注射30ul 1ug/ul跳蚤抗原(10只)，同时注射等体积的组胺(浓度为0.01％)和PBS分别作为阳性对照(10只)和阴性对照(10只)，20分钟后用千分尺测水疱直径的大小。水疱直径如图4a(1-12表示第1-12组)所示。t检验结果表明，pcDF100和pep100联合免疫(第6组)与pcDF100单独免疫(第4组)或pep100单独免疫(第5组)都有显著差异(P＜0.05)；pcDF66和pep66联合免疫(第3组)与pcDF66单独免疫(第1组)有显著性差异(P＜0.05)，而与pep66单独免疫(第2组)不具有显著性差异。跳蚤抗原和pcDF66(第10组)或pcDF100(第11组)联合免疫与跳蚤抗原(第9组)单独免疫都有显著性差异(P＜0.05)，与pcDF66(第1组)或pcDF100(第4组)单独免疫相比不具有显著性差异。而表达载体和表位多肽交叉联合免疫(第7组和第8组)与表达载体或表位多肽分别单独免疫(第1组，第2组，第3组和第4组)都没有差异。图4a中，1-12表示1-12组，PBS表示用PBS进行皮试，Histamine表示用组胺皮试，Ag表示用跳蚤抗原皮试。
根据以上皮试结果，可以得出一个初步结论含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽，或者含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白联合免疫可以抑制或减轻皮肤的过敏，而且这一抑制或减轻作用是抗原特异性的。这说明抑制或减轻皮肤的过敏反应可能是由免疫抑制引起的。
2、Balb/c和C57B/6小鼠皮试结果为了进一步证实在昆明白小鼠上得到的结果，在两种纯系，即有不同的MHC遗传背景的Balb/c和C57B/6，检测免疫抑制是否有MHC限制性。实验方法与昆明白小鼠相同。Balb/c皮试结果如图4b(1-12表示第1-12组)所示。t检验结果表明，pcDF100和pep100联合免疫(第6组)与pcDF100单独免疫(第4组)或pep100单独免疫(第5组)都有显著差异(P＜0.05)；跳蚤抗原和pcDF100联合免疫(第11组)与跳蚤抗原(第9组)或pcDF100(第4组)单独免疫相比都有极显著差异(P＜0.01)；跳蚤抗原和pcDF66联合免疫(第10组)与跳蚤抗原单独免疫(第9组)相比或pcDF66单独免疫(第1组)相比都没有显著性差异；pcDF100和pep66联合免疫(第8组)与pcDF100单独免疫(第4组)或pep66单独免疫(第2组)都不具有显著性差异。图4b中，1-12表示1-12组，PBS表示用PBS进行皮试，Histamine表示用组胺皮试，Ag表示用跳蚤抗原皮试。以上结果说明抗过敏的免疫抑制是抗原特异性的，如pcDF100和pep100联合免疫组与pcDF100单独免疫组或pep100单独免疫组的比较，跳蚤抗原和pcDF100联合免疫组与单独免疫组的比较；免疫抑制程度上存在差别，如跳蚤抗原和pcDF100联合免疫组与单独免疫组的比较。
C57B/6皮试结果如图4c(图4c中1-12表示第1-12组)所示。t检验结果表明，pcDF100和pep100联合免疫(第6组)与pcDF100单独免疫(第4组)或pep100单独免疫(第5组)都有显著差异(P＜0.05)；pcDF100和pep66联合免疫(第8组)与pcDF100单独免疫(第4组)或pep66单独免疫(第2组)都有显著差异(P＜0.05)；跳蚤抗原和pcDF100联合免疫(第11组)与跳蚤抗原(第9组)或pcDF100单独免疫(第4组)相比都有极显著差异(P＜0.01)。图4c中，1-12表示1-12组，PBS表示用PBS进行皮试，Histamine表示用组胺皮试，Ag表示用跳蚤抗原皮试。说明a)抗过敏的免疫抑制是抗原特异性的，如pcDF100和pep100联合免疫组与pcDF100单独免疫组或pep100单独免疫组；b)pep66和pep100表位可能有某些交叉反应。如pcDF100和pep66联合免疫组与pcDF100单独免疫组或pep66单独免疫组；c)而跳蚤抗原和pcDF66联合免疫没有产生明显的免疫抑制，这一结果与Balb/c上得到的结果一致；d)尽管存在某些差异，根据三种不同品系小鼠的实验结果，可以得出一个结论含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽，或者含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白联合免疫可以产生抗过敏的免疫抑制。
实施例3、免疫小鼠的T细胞增殖实验取360只Balb/c和360只C57B/6小鼠，每种小鼠均分为12组，每组30只，按照实施例2的方法进行免疫，于第二次免疫后第7天取脾脏T细胞测定其T细胞扩增活性，具体方法为在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，将每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加入100μl ConA(有丝分裂原)至终浓度为5μg/ml，一份加入相应的特异性抗原(跳蚤抗原)作为刺激物至终浓度为5μg/ml，一份不加刺激物，一份加入100μl BSA至终浓度为2μg/ml作为无关抗原，37℃，CO2培养箱孵育48h后，每孔加入100μl MTS至终浓度为5mg/ml，孵育4h后，在酶标仪上读取492nm处的OD值，计算刺激指数(SI＝实验OD÷非刺激OD)。Balb/c小鼠的T细胞增殖结果如图5a所示，表明a)含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽联合免疫可以产生显著的抗原特异性的免疫抑制，如pcDF100和pep100联合免疫组(第6组)、跳蚤抗原和pcDF100联合免疫组(第11组)与相应的单独免疫组的比较；b)而pcDF66和pep66联合免疫组(第3组)、跳蚤抗原和pcDF66联合免疫组(第10组)与相应的单独免疫组比较，没有显著的免疫抑制；c)pcDF100和pep100联合免疫组和跳蚤抗原和pcDF100联合免疫组的结果与皮试结果一致；d)pcDF100和pep66联合免疫组(第8组)与相应的单独免疫组相比具有极显著差异(P＜0.01)。图5a中，ConA表示阳性对照；BSA表示阴性对照，1-12表示第1-12组。
C57B/6鼠的的T细胞增殖结果如图5b所示，表明a)含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽可以产生显著的抗原特异性的免疫抑制，如pcDF66和pep66联合免疫组(第3组)与相应的单独免疫组(第1组和第2组)相比具有显著差异(P＜0.05)、pcDF100和pep100联合免疫组(第6组)与相应的单独免疫组(第4组和第5组)相比具有极显著差异(P＜0.01)、跳蚤抗原和pcDF66联合免疫组(第10组)与相应的单独免疫组(第9组和第1组)相比具有显著差异(P＜0.05)、跳蚤抗原和pcDF100联合免疫组(第11组)与相应的单独免疫组(第9组和第4组)相比具有极显著差异(P＜0.01)；b)两表位之间存在交叉反应，如pcDF66和pep100联合免疫组(第7组)与相应的单独免疫组(第1组和第5组)相比具有显著差异(P＜0.05)，pcDF100和pep66联合免疫组(第8组)与相应的单独免疫组(第4组和第2组)相比具有显著差异(P＜0.05)；c)pcDF100和pep100联合免疫组、pcDF100和pep66联合免疫组和跳蚤抗原和pcDF100联合免疫组的结果与皮试结果一致。图5b中，ConA表示阳性对照；BSA表示阴性对照，1-12表示第1-12组。
实施例4、免疫小鼠的细胞因子水平变化取360只昆明白小鼠，360只Balb/c小鼠和360只C57B/6小鼠，每种小鼠均分为12组，每组30只，按照实施例2的方法进行免疫，于第二次免疫后第7天取脾脏，提取总RNA(TRIZOL，鼎国生物公司)，反转录为cDNA，反转录依照大连宝生物公司RNA RT-PCR操作指南，取纯化的1μg总RNA置250μL离心管中，然后依次加入相关试剂4μl MgCl2，2μl 10×缓冲液，8.5μl DEPC水，2μl dNTP混合物，0.5μl RNase inhibitor，0.5μl M-MLV反转录酶(Promaga)，0.5μL Oligo(dT)12引物；反应条件为42℃30min，99℃5min，5℃5min。用持家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)为内源表达标准，将各组cDNA浓度调为一致，然后取2μl的cDNA进行PCR扩增以下三种细胞因子基因IFN-γ基因，IL-4基因和IL-10基因。其中，反应所需引物和PCR反应条件如表1所示。(由于持家基因HPRT在体内恒定表达，以它为内源表达标准的模板对照)
表1.HPRT，IFN-γ，IL-4和IL-10的引物序列及PCR反应参数
电泳检测PCR产物结果如图6所示(泳道1-12分别为第1-12组)，将电泳图用Bio-Rad Image软件(Quantity One 4.2.0)分析作图，昆明白、Balb/c和C57/6小鼠各细胞因子检测后，得出结果基本一致。IL-10的表达水平，pcDF66和pep66联合免疫(第3组)较pcDF66单独免疫(第1组)或pep66单独免疫(第2组)高；pcDF100和pep100联合免疫(第6组)较pcDF100单独免疫(第4组)或pep100单独免疫(第5组)高；跳蚤抗原和pcDF66联合免疫(第10组)较跳蚤抗原(第9组)或pcDF66单独免疫(第1组)高；跳蚤抗原和pcDF66联合免疫(第11组)较跳蚤抗原(第9组)或pcDF100单独免疫(第4组)高。而对于IL-4和IFN-γ的表达水平，各组间无明显差别。结果表明含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白或该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽联合免疫提高了IL-10的表达水平。
此外，对三种小鼠的IL-5，IL-13进行了检测，结果表明含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白或该跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽联合免疫组(第3组，第6组，第10组和第11组)IL-5和IL-13的量都明显低于分别单独免疫组。
实施例5、免疫小鼠的血清IgE水平检测取360只Balb/c和360只C57B/6小鼠，每种小鼠均分为12组，每组30只，按照实施例2的方法进行免疫。分别于免疫前、一免后14天眼眶后静脉丛采血，分离血清，采用ELISA检测其IgE水平。其中，用于包被的抗原为跳蚤抗原购买于美国GreerLaboratory公司(Lenoir，北卡，美国)。一抗为分离的血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgE；反应终止后酶标仪上读取492nm处的OD值。昆明白小鼠的IgE检测结果如图7a所示，Balb/c小鼠的IgE检测结果如图7b所示，C57B/6小鼠的IgE检测结果如图7C所示，1-12表示第1-12组。三种小鼠的结果一致，除跳蚤抗原单独免疫组(第9组)外，其它各组IgE水平都较低。跳蚤抗原单独免疫组(第9组)IgE水平最高，而跳蚤抗原和pcDF66(第10组)或跳蚤抗原和pcDF100(第11组)联合免疫IgE水平较跳蚤抗原单独免疫组(第9组)有很大降低。表明含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和该跳蚤唾液过敏原蛋白联合免疫可以降低IgE水平。
实施例6、猫过敏原蛋白抗原Fel d I.1(Fel d I with the minor B leader)编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Fel d I.1引物的合成人工合成引物Fel d I.1 P1 5’primerAAGCTTGGATGTTAGACGCFel d I.1 P2 3’primerGGTACCTTAACACAGAGGAC2、Fel d I.1表达载体的构建以Fel d I.1CDNA为模板，以Fel d I.1P1和Fel d I.1P2为引物PCR扩增Feld I.1基因。其中，Fel d I.1 P15’-AAGCTTGGATGTTAGACGC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第9位-11位即原有起始密码子)，Fel dI.1 P2 5’-GGTACCTTAACACAGAGGAC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。
利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Fel d I.1基因的质粒pVAX1-Fel d I.1。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Fel d I.1表达载体pFeldI.1。
3、pFeldI.1的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pFeldI.1转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的eDNA为模板，Fel d I.1 P1和Fel d I.1 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Fel d I.1阳性带。结果证明Fel d I.1可以在真核细胞中表达。
实施例7、猫过敏原蛋白抗原Fel d I.2编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Fel d I.2引物的合成人工合成引物Fel d I.2 P1 5’primerAAGCTTGGATGAAGGGGGCTCFel d I.2 P2 3’primerGGTACCTTAACACAGAGGAC2、Fel d I.2表达载体的构建以Fel d I.2cDNA为模板，以Fel d I.2 P1和Fel d I.2 P2为引物PCR扩增Feld I.2基因。其中，Fel d I.2 P1 5’-AAGCTTGGATGAAGGGGGCTC -3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第9位-11位即原有起始密码子)，Fel d I.2 P2 5’-GGTACCTTAACACAGAGGAC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。
利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Can f 1基因的质粒pVAX1-Fel d I.2。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Fel d I.2表达载体pFeldI.2。
3、pFeldI.2的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pFeldI.2转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Fel d I.2 P1和Fel d I.2 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Fel d I.2阳性带。结果证明Fel d I.2可以在真核细胞中表达。
实施例8、犬过敏原蛋白抗原Can f 1编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Can f 1引物的合成人工合成引物Can f 1 P1 5’primerAAGCTTATGAAGACCCTGCTCCTCACCan f 1 P2 3’primerGGTACCCTACTGTCCTCCTGGAGAGC2、Can f 1表达载体的构建以Can f 1CDNA为模板，以Can f 1 P1和Can f 1 P2为引物PCR扩增Can f 1基因。其中，Can f 1 P1 5’-AAGCTTATGAAGACCCTGCTCCTCAC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第7位-9位即原有起始密码子)，Can f 1P2 5’-GGTACCCTACTGTCCTCCTGGAGAGC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。
利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Fordoge)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Can f 1基因的质粒pVAX1-Can f 1。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Can f 1表达载体pCanf1。
3、pCanf1的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pCanf1转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Can f 1P1和Can f 1P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Can f 1阳性带。结果证明Can f 1可以在真核细胞中表达。
实施例9、犬过敏原蛋白抗原Can f 2编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Can f 2引物的合成人工合成引物Can f 2 P1 5’primerAAGCTT ATGCAGCTCCTACTGCT6Can f 2 P2 3’primerGGTACCCTAGTCTCTGGAACCC2、Can f 2表达载体的构建以Can f 2CDNA为模板，以Can f 2 P1和Can f 2 P2为引物PCR扩增Can f 2基因。其中，Can f 2 P1 5’-AAGCTT ATGCAGCTCCTACTGCTG-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第7位-9位即原有起始密码子)，Can f 2P2 5’-GGTACCCTAGTCTCTGGAACCC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Can f 2基因的质粒pCanf2。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Can f 2表达载体pCanf2。
3、pCanf2的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pCanf2转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Can f 2 P1和Can f 2 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Can f 2阳性带。结果证明Can f2可以在真核细胞中表达。
实施例10、尘螨过敏原蛋白抗原Der p 1编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Der p 1引物的合成人工合成引物Der p 1 P1 5’primerAAGCTTAACATGAAAATTGTTTTGGDer p 1 P2 3’primerGGTACCGTTTAGAGAATGACAACAT2、Der p 1表达载体的构建以Der p 1CDNA为模板，以Der p 1 P1和Der p 1 P2为引物PCR扩增Der p 1基因。其中，Der p 1 P1 5’-AAGCTTAACATGAAAATTGTTTTGG-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第10位-12位即原有起始密码子)，Der p1 P2 5’-GGTACCGTTTAGAGAATGACAACAT-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第9位-11位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶KpnI和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Der p 1基因的质粒pVAX1-Der p 1。经序列分析(AugctCo.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Der p 1表达载体pDerp1。
3、pDerp1的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pDerp1转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Der p 1 P1和Der p 1 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Der p 1阳性带。结果证明Der p 1可以在真核细胞中表达。
实施例11、花生过敏原蛋白抗原Ara h II编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Ara h II引物的合成人工合成引物Ara h II P1 5’primerAAGCTTCTCATGCAGAAGATAra h II P2 3’primerGGTACCTTAGTAT CTGTCTC2、Ara h II表达载体的构建以Ara h IICDNA为模板，以Ara h II P1和Ara h II P2为引物PCR扩增Ara h II基因。其中，Ara h IIP1 5’-AAGCTTCTCATGCAGAAGAT-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第10位-12位即原有起始密码子)，Ara h II P25’-GGTACCTTAGTATCTGTCTC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Ara h II基因的质粒pVAX1-Ara h II。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Ara h II表达载体pArahII。
3、pArahII的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pArahII转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Ara h II P1和Ara h II P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Ara h II阳性带。结果证明Ara h II可以在真核细胞中表达。
实施例12、花生过敏原蛋白抗原Ara h 5编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Ara h 5引物的合成人工合成引物Ara h 5 P1 5’primerAAGCTTATGTCGTGGCAAACAra h 5 P2 3’primerGGTACCTAAAGACCCGTATC2、Ara h 5表达载体的构建以Ara h 5CDNA为模板，以Ara h 5 P1和Ara h 5 P2为引物PCR扩增Ara h 5基因。其中，Ara h 5 P1 5’-AAGCTTATGTCGTGGCAAAC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第7位-9位即原有起始密码子)，Ara h 5 P2 5’-GGTACCTAAAGACCCGTATC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Ara h 5基因的质粒pVAX1-Ara h 5。经序列分析(Augct Co.Ltd，BeijingChina)进一步鉴定正确，即得到Ara h 5表达载体pArah5。
3、pArah5的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pArah5转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Ara h 5 P1和Ara h 5 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Ara h 5阳性带。结果证明Ara h 5可以在真核细胞中表达。
实施例13、日本雪松花粉过敏原蛋白抗原Cry j 1.1编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Cry j 1.1引物的合成人工合成引物Cry j 1.1 P1 5’primerAAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAT
Cry j 1.1 P2 3’primerGGTACCATCAACAACGTTTAGAG2、Cry j 1.1表达载体的构建以Cry j 1.1CDNA为模板，以Cry j 1.1 P1和Cry j 1.1 P2为引物PCR扩增Cry j 1.1基因。其中，Cry j 1.1 P1 5’-AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAT-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第7位-9位即原有起始密码子)，Cry j 1.1 P2 5’-GGTACCATCAACAACGTTTAGAG-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Cry j 1.1基因的质粒pCryj1.1。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Cry j 1.1表达载体pCryj1.1。
3、pCryj1.1的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pCryj 1.1转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Cry j 1.1P1和Cry j 1.1 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Cry j1.1阳性带。结果证明Cry j 1.1可以在真核细胞中表达。
实施例14、日本雪松花粉过敏原蛋白抗原Cry j 1.2编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Cry j 1.2引物的合成人工合成引物Cry j 1.2 P1 5’primerAAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAGCry j 1.2 P2 3’primerGGTACCTCAACAACGTTTAGAGAGAG
2、Cry j 1.2表达载体的构建以Cry j 1.2CDNA为模板，以Cry j 1.2 P1和Cry j 1.2 P2为引物PCR扩增Cry j 1.2基因。其中，Cry j 1.2 P1 5’-AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAG-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第7位-9位即原有起始密码子)，Cry j 1.2 P2 5’-GGTACCTCAACAACGTTTAGAGAGAG-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-9位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Cry j 1.2基因的质粒pCryj1.2。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Cry j 1.2表达载体pCryj1.2。
3、pCryj1.2的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pCryj 1.2转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Cry j 1.2P1和Cry j 1.2 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Cry j1.2阳性带。结果证明Cry j 1.2可以在真核细胞中表达。
实施例15、热带无爪螨过敏原蛋白抗原Blo t 5编码基因的克隆及真核表达的鉴定1、Blo t 5引物的合成人工合成引物Blo t 5 P1 5’primerAAGCTTACAATGAAGTTCGCBlo t 5 P2 3’primerGGTACCAATTTTTATTGGGT
2、Blo t 5表达载体的构建以Blo t 5CDNA为模板，以Blo t 5 P1和Blo t 5 P2为引物PCR扩增Blo t 5基因。其中，Blo t 5 P1 5’-AAGCTTACAATGAAGTTCGC-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为HindIII识别位点，第10位-12位即原有起始密码子)，Blo t 5 P25’-GGTACCAATTTTTATTGGGT-3’(该序列中自5′端第1位-6位碱基为Kpn I识别位点，第12位-14位即原有终止密码子)。利用Kpn I和HindIII分别酶切PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)，再用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，提取质粒，限制性内切酶Kpn I和HindIII酶切鉴定得到阳性克隆，即得到含有Blo t 5基因的质粒pVAX1-Blo t 5。经序列分析(Augct Co.Ltd，Beijing China)进一步鉴定正确，即得到Blo t 5表达载体pBlot5。
3、pBlot5的真核表达用含10％胎牛血清的DMEM，在37℃5％CO2条件下培养正常猴肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞所)。pBlot5转染时CV1细胞以2.5×105个/ml接种于35mm的培养皿中，每皿2ml。按照分子克隆实验指南(第三版)(中译版)(黄培堂等译.科学出版社。2002年9月出版)中的方法，对质粒进行纯化，然后通过阳离子脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介导转染培养好的CV1细胞。具体转染步骤参见产品说明书(Invitrogen，CA，USA)。转染24h后，收集细胞，通过RNA提取试剂盒(Dingguo Co.Ltd，Beijing China)获得细胞的总RNA。为避免污染，提取的总RNA应分装到几个EP管中。用微量移液器小心吸取2ul提取的总RNA并由RT-PCR试剂盒扩增细胞总的cDNA。加样后，在42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟取出待用。以得到的cDNA为模板，Blo t 5 P1和Blo t 5 P2为引物进行PCR，得到PCR产物经低熔点琼脂糖检测得到Blo t 5阳性带。结果证明Blo t 5可以在真核细胞中表达。
序列表<160>5<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gln Glu Lys Glu Lys Cys Met Lys Phe Cys Lys Lys Val Cys Lys1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Gly Pro Asp Trp Lys Val Ser Lys Glu Cys Lys Asp Pro Asn Asn1 5 10 15<210>3<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>3caagagaaag aaaaatgtat gaaattttgc aaaaaagttt gcaaa 45<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ggtcctgatt ggaaagtaag caaagaatgc aaagatccca ataac 45<210>5<211>176<212>PRT<213>猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)<400>5Met Asn Tyr Cys Phe Leu Val Phe Leu Val Tyr Leu Val Phe Ala Val1 5 10 15Asn Gly Glu Asp Ile Trp Lys Val Asn Lys Lys Cys Thr Ser Gly Gly20 25 30Lys Asn Gln Asp Arg Lys Leu Asp Gln Ile Ile Gln Lys Gly Gln Gln35 40 45Val Lys Ile Gln Asn Ile Cys Lys Leu Ile Arg Asp Lys Pro His Thr50 55 60Asn Gln Glu Lys Glu Lys Cys Met Lys Phe Cys Lys Lys Val Cys Lys
65 70 75 80Gly Tyr Arg Gly Ala Cys Asp Gly Asn Ile Cys Tyr Cys Ser Arg Pro85 90 95Ser Asn Leu Gly Pro Asp Trp Lys Val Ser Lys Glu Cys Lys Asp Pro100 105 110Asn Asn Lys Asp Ser Arg Pro Thr Glu Ile Val Pro Tyr Arg Gln Gln115 120 125Leu Ala Ile Pro Asn Ile Cys Lys Leu Lys Asn Ser Glu Thr Asn Glu130 135 140Asp Ser Lys Cys Lys Lys His Cys Lys Glu Lys Cys Arg Gly Gly Asn145 150 155 160Asp Ala Gly Cys Asp Gly Asn Phe Cys Tyr Cys Arg Pro Lys Asn Lys165 170 17权利要求
1.跳蚤过敏性皮炎抑制剂，包括含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和下述任一种物质所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽，跳蚤抗原和所述跳蚤唾液过敏原蛋白。
2.根据权利要求1所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。
3.根据权利要求1所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
4.根据权利要求2所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽的编码基因具有序列表中序列3的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽的编码基因具有序列表中序列4的核苷酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述真核细胞表达载体中，调控所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因表达的启动子为RSV、CMV或SV40病毒的启动子。
7.根据权利要求1至5中任一所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂包括含有所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽；所述真核细胞表达载体中的所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因与跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1。
8.根据权利要求1至5中任一所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂包括含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和跳蚤抗原；所述跳蚤抗原和所述真核细胞表达载体中的跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1。
9.根据权利要求1至5中任一所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述跳蚤过敏性皮炎抑制剂包括跳蚤唾液过敏原蛋白和含有所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体；所述跳蚤唾液过敏原蛋白和所述真核细胞表达载体中的跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1。
10.根据权利要求1至5中任一所述的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，其特征在于所述含有跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体为pcDF66或pcDF100。
11.跳蚤过敏性皮炎抑制剂，包括编码抗原的质粒DNA和该抗原表位多肽；或包括编码抗原的质粒DNA和该抗原蛋白质。
12.治疗由于抗原引发的猫、犬以及人过敏性疾病的药物，包括编码抗原的质粒DNA和该抗原表位多肽；或包括编码抗原的质粒DNA和该抗原蛋白质。
13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于所述抗原表位多肽或抗原蛋白质包括尘螨过敏蛋白Der p 1，Der f 1和Blot t 5；猫过敏蛋白Fel d 1；狗过敏源蛋白Can f 1，Can f 2；花生过敏蛋白Ara h II，Arah 5；日本雪松花粉过敏蛋白Cry j 1和Cry j 2；热带无爪螨过敏原蛋白抗原Blo t 5。
全文摘要
本发明公开了一种跳蚤过敏性皮炎抑制剂，以及由于另外过敏源导致的猫、犬等家畜过敏反应性疾病的抑制剂。本发明所提供的跳蚤过敏性皮炎抑制剂，包括含有跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和下述任一种物质所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽，或跳蚤抗原和所述跳蚤唾液过敏原蛋白。本发明的跳蚤过敏性皮炎抑制剂可有效预防和/或治疗跳蚤过敏性皮炎。本发明的过敏源抑制剂包括含有所述跳蚤唾液过敏原蛋白或其抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体和所述跳蚤唾液过敏原蛋白抗原表位多肽，和下述任一种物质过敏原蛋白抗原表位多肽，抗原和过敏原蛋白。
文档编号A61P37/08GK1824291SQ20051013238
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者王宾, 俞庆龄, 金华利, 赵琳, 吴加亮, 朱贤主 申请人:中国农业大学