专利名称：载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法和用途。
背景技术：
动物消化道中存在着各种各样的细菌，有些可消耗营养物质，有些则可产生毒素和细菌酶，后者能直接或间接破坏肠粘膜的形态和功能，从而降低畜禽的饲料效率和生长性能。如果肠道病原菌数量超过一定值，轻者消化不良、腹泻，重者可能会发生肠源性全身感染，甚至危及生命，这使得抗生素和抗菌药物在畜牧养殖中得到大量使用。而抗生素的大量使用，虽然在一定程度上起到了促进畜禽生长，防病抗病的作用。但长期使用和滥用抗生素，造成诸如细菌抗药性、耐药基因转移、畜产品中药物残留、生态平衡失调等不良后果，直接或间接威胁人类健康。近年来，一些国家和地区已制定了相应的法律、法规，以严格控制或制止在畜禽养殖中使用抗生素。因此，研发安全无公害的新型抗菌材料已迫在眉睫。
以硅酸盐类化合物为载体，担持抗菌金属离子或金属氧化物而制成的无机抗菌剂，具有抗菌谱广、细菌不易产生耐药性、使用安全等特点，引起了人们的极大关注。目前，国内外在陶瓷、有机纤维、塑料、涂料、食品、医药等领域的研究与应用均有报道，但均未见广泛推广应用，主要原因是目前所研制的无机抗菌材料，其抗菌活性相对较低，还不能广泛地应用于预防和临床治疗。因此，如何提高无机抗菌材料的抗菌活性，是研制和开发该类抗菌剂的关键所在。
目前普遍使用的无机抗菌剂多为Ag+型，Ag+对各种致病细菌都有强烈的杀灭效果，而且所需浓度极低，一般用量为10-6(质量分数)即可灭菌。但产品成本高，而且Ag+在见光、受热条件下极易还原成金属银；Ag+还能与水介质中的Cl-、HS-、S2-和SO42-等多种阴离子反应，形成不溶于水的AgCl和Ag2S，从而失去抗菌活性。另一方面，铜的无机化合物也是常用的无机杀菌剂，如硫酸铜、氢氧化铜等。与银相比，铜价格低廉，又由于其半径小、电价高，若将其载于无机材料基体中，将具有比银离子更高的稳定性，可克服银系抗菌剂的缺点。而且，铜是动物机体必需的微量元素，铜具有类似抗生素的作用，饲粮中添加高剂量铜对猪有促生长作用。
蒙脱石是一种双八面体层状结构的天然纳米级铝硅酸盐矿物，具有良好的分散性与阳离子交换能力，十分适合于用作各种无机抗菌剂的载体。而且，蒙脱石层间纹状的表面结构和非均匀性电荷分布使对消化道内的病毒、病原菌及其产生的毒素等有优良的吸附能力，蒙脱石通过与黏液糖蛋白识别、结合、定位，可在消化道形成胶体保护膜，加强、修复、保护消化道粘膜屏障，提高粘膜屏障对攻击因子的防御功能。
甲壳素是自然界仅次于纤维素第二大天然生物高聚物，化学名称为(1，4)-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，化学结构是由2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖通过β-1，4糖苷键形式连接而成的多糖。甲壳素经浓碱水解脱乙酰基后产物为壳聚糖(2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖)。壳聚糖具有独特的生物活性，能调节动物机体免疫，有较强的抗菌活性，并能调节动物体内胆固醇与脂质代谢。壳聚糖作为饲料添加剂、重金属螯合剂、吸附剂、药物缓释剂等多种功能性材料已应用于农业、工业及医药等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法和用途。
载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法包括以下步骤1)将蒙脱石矿物，连同相当于矿物重量5％～15％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为10％～20％的悬浮液矿浆，室温钠化10～15小时，水洗5～7次，用水重新制成浓度为10％～20％的矿浆；2)将相当于蒙脱石矿物重量0.5％～5％的壳聚糖溶解在体积分数为1～5％的醋酸或盐酸水溶液中，配成壳聚糖含量(按重量比)为0.1～5g/100mL的壳聚糖酸溶液，于搅拌下将壳聚糖酸溶液缓慢加入步骤1)的矿浆中，连续搅拌反应5～10小时，反应温度为20℃～70℃；3)将含铜量为蒙脱石矿物重量1～6％的铜盐，于搅拌下缓慢加入步骤2)的矿浆中，检测并调节矿浆的pH值为3.5～6.5，室温反应5～10小时；4)检测步骤3)矿浆的pH值，用碱性溶液调节，使浆液pH值为7.0～8.5；水洗3～7次，过滤或离心脱水；5)将步骤4)所得的滤饼烘干、粉碎至大于300目，得到一种载铜硅酸盐抗菌剂。
发明中使用的壳聚糖为分子量为2～80kDa、脱乙酰度为80～95％的壳聚糖。使用的铜盐可为氯化铜、硝酸铜、硫酸铜或者其水合物。使用的碱性溶液为浓度为0.5～10moL/L的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或者碳酸氢钾的水溶液。
制备方法的浆液脱水工艺，可因地制宜，选用离心或过滤等方法进行脱水。脱水后所得的滤饼可使用常规烘干设备干燥。烘干后的一种载铜硅酸盐抗菌剂为块状，可选用常规粉碎设备粉碎至粒度大于300目。
载铜硅酸盐抗菌剂用作畜禽、水产动物、牛羊的饲料添加剂。
本发明通过吸附、离子交换反应，利用蒙脱石壳聚糖复合物负载铜，制成铜～壳聚糖～蒙脱石复合抗菌剂，使用的材料蒙脱石、壳聚糖均为天然物质，属安全、无毒的环境友好材料，基本不会造成二次污染。
本发明之载铜硅酸盐抗菌剂具有抗菌作用强、细菌不易产生耐药性、使用安全等特点，作为动物保健剂和生长促进剂在饲料中应用能有效抑制动物肠道病原菌的增殖，保护肠粘膜免受病原菌的侵袭，使肠粘膜始终处于健康状态，以益于消化酶的分泌和饲料养分的消化；可提高机体免疫力和抗病力、降低动物腹泻率、提高生产性能；可替代抗生素和抗菌药物，生产无抗生素残留的动物产品，推动养殖业的绿色化进程。
具体实施例方式
本发明结合以下实例作进一步的说明。
实施例11)将浙江安吉产的蒙脱石矿物，连同相当于矿物重量5％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为10％的悬浮液矿浆，室温钠化10小时，水洗5次，用水重新制成浓度为10％的矿浆；2)将相当于蒙脱石矿物重量0.5％的分子量为2kDa、脱乙酰度为80％的壳聚糖溶解在体积分数为1％的醋酸水溶液中，配成壳聚糖含量(按重量比)为0.1g/100mL的壳聚糖酸溶液，于搅拌下将壳聚糖酸溶液缓慢加入步骤1)的矿浆中，连续搅拌反应5小时，反应温度为20℃；3)将含铜量为蒙脱石矿物重量6％的氯化铜，于搅拌下缓慢加入步骤2)的矿浆中，检测并调节矿浆的pH值为3.5，室温反应5小时；4)检测步骤3)矿浆的pH值，用0.5moL/L的氢氧化钠水溶液调节，使浆液pH值为7.0；水洗3次，过滤脱水；5)将步骤4)所得的滤饼烘干、粉碎至300目，得到一种载铜硅酸盐抗菌剂。
采用美国国立临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的肉汤稀释法测定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的结果表明，载铜硅酸盐抗菌剂对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为100，100，50mg/L，最小杀菌浓度分别为300、400、150mg/L。以1日龄AA商品代混合雏鸡为试验动物，饲喂0.05％载铜硅酸盐抗菌剂的玉米-豆粕型日粮49天，发现载铜硅酸盐抗菌剂具有明显促生长和改善饲料利用效率的作用；可使小肠和盲肠大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌数减少；能有效抑制肠道β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶的活性；能改善小肠绒毛高度和绒毛密度，提高小肠粘膜麦芽糖酶、氨基肽酶N和碱性磷酸酶的活性，使饲料干物质、粗蛋白、粗脂肪等养分的表观消化率得以提高。上述结果提示载铜硅酸盐抗菌剂通过抑制肠道病原菌的增殖，降低细菌酶的活性，改善肠道内环境和粘膜形态结构，以益于消化酶的分泌和饲料养分的消化，从而提高肉鸡的生长性能。
实施例21)将产自内蒙古的蒙脱石，连同相当于矿物重量15％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为20％的悬浮液矿浆，室温钠化15小时，水洗7次，用水重新制成浓度为20％的矿浆；2)将相当于蒙脱石矿物重量5％的分子量为80kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖溶解在体积分数为5％的盐酸水溶液中，配成壳聚糖含量(按重量比)为5g/100mL的壳聚糖酸溶液，于搅拌下将壳聚糖酸溶液缓慢加入步骤1)的矿浆中，连续搅拌反应10小时，反应温度为70℃；
3)将含铜量为蒙脱石矿物重量1％的六水硝酸铜(Cu(NO3)2·6H2O)，于搅拌下缓慢加入步骤2)的矿浆中，检测并调节矿浆的pH值为6.5，室温反应10小时；4)检测步骤3)矿浆的pH值，用10moL/L的氢氧化钾水溶液调节，使浆液pH值为8.5；水洗7次，离心脱水；5)将步骤4)所得的滤饼烘干、粉碎至400目，得到一种载铜硅酸盐抗菌剂。
载铜硅酸盐抗菌剂对嗜水气单胞菌粘附鱼上皮细胞的影响采用鱼上皮细胞培养模型，观察嗜水气单胞菌对鳃上皮、皮肤上皮、肠上皮细胞的粘附率，研究载铜硅酸盐抗菌剂对细菌粘附的阻断作用及其对细菌粘附引起鱼上皮细胞膜生物特性变化的影响。结果如下嗜水气单胞菌对鱼上皮细胞的粘附率和载铜硅酸盐抗菌剂对粘附的阻断率见表1。嗜水气单胞菌与鱼上皮细胞均有不同程度的粘附作用，其中对鳃上皮细胞的粘附率显著大于肠上皮细胞(P＜0.05)。与空白组相比，载铜硅酸盐抗菌剂均显著降低了嗜水气单胞菌对鳃、皮肤和肠上皮细胞的粘附率(P＜0.05)，但是对不同上皮细胞的粘附阻断率无显著差异。
表1 嗜水气单胞菌对鱼上皮细胞的粘附率和载铜硅酸盐抗菌剂对粘附的阻断率
注结果以平均数±标准差表示；n＝3。同一列中肩标小写字母不同者表示细菌粘附率差异显著(P＜0.05)；同一列中肩标大写字母不同者表示粘附阻断率差异显著(P＜0.05)。
载铜硅酸盐抗菌剂对细菌粘附引起鱼上皮细胞膜生物特性变化的影响见表2。由表2可见，嗜水气单胞菌粘附鱼上皮细胞后，胞浆游离钙和细胞膜PLA2浓度显著上升。与细菌侵入组相比，细菌+载铜硅酸盐抗菌剂组鳃、皮肤和肠上皮细胞胞浆游离钙浓度和细胞膜PLA2显著降低(P＜0.05)，而与正常对照组无显著差异(P＞0.05)。
表2 载铜硅酸盐抗菌剂对细菌粘附引起鱼上皮细胞膜生物特性变化的影响
注结果以平均数±标准差表示；n＝3。同一列中肩标字母不同者差异显著(P＜0.05)。
实施例3
1)将产自河北的蒙脱石，连同相当于矿物重量10％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为15％的悬浮液矿浆，室温钠化12小时，水洗6次，用水重新制成浓度为15％的矿浆；2)将相当于蒙脱石矿物重量2.5％的分子量为40kDa、脱乙酰度为85％的壳聚糖溶解在体积分数为2％的醋酸水溶液中，配成壳聚糖含量(按重量比)为2g/100mL的壳聚糖酸溶液，于搅拌下将壳聚糖酸溶液缓慢加入步骤1)的矿浆中，连续搅拌反应7小时，反应温度为50℃；3)将含铜量为蒙脱石矿物重量3％的硫酸铜，于搅拌下缓慢加入步骤2)的矿浆中，检测并调节矿浆的pH值为4.5，室温反应8小时；4)检测步骤3)矿浆的pH值，用5moL/L的碳酸钠水溶液调节，使浆液pH值为8.0；水洗7次，过滤脱水；5)将步骤4)所得的滤饼烘干、粉碎至400目，得到一种载铜硅酸盐抗菌剂。
选取平均体重为4.2g的健康尼罗罗非鱼，饲喂0.01％载铜硅酸盐抗菌剂的日粮56天，发现载铜硅酸盐抗菌剂显著提高了罗非鱼的生长性能和存活率，显著降低肠道细菌数量，并明显改变肠道菌群的组成，使气单胞菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，不动杆菌属，产碱菌属，肠杆菌科，弧菌属的百分比减少；显著提高白细胞吞噬活性、血清和体表粘液溶菌酶活性、红细胞C3b受体花环百分率；显著提高各肠段绒毛和微绒毛高度；显著提高肠组织蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性和饲料养分的表观消化率。与黄霉素组相比，载铜硅酸盐抗菌剂组罗非鱼日增重、特定生长率、肠组织淀粉酶和脂肪酶、中肠微绒毛高度显著提高，在其他指标上均具一定的优势，但差异不显著。结果提示载铜硅酸盐抗菌剂通过抑制肠道病原菌的增殖，提高机体的非特异性免疫机能，改善肠粘膜形态结构，以益于消化酶的分泌和饲料养分的消化，从而提高罗非鱼的生长性能和存活率。
实施例41)将蒙脱石矿物，连同相当于矿物重量7％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为10％的悬浮液矿浆，室温钠化10小时，水洗5次，用水重新制成浓度为20％的矿浆；2)将相当于蒙脱石矿物重量1％的分子量为10kDa、脱乙酰度为90％的壳聚糖溶解在体积分数为5％的盐酸水溶液中，配成壳聚糖含量(按重量比)为1.5g/100mL的壳聚糖酸溶液，于搅拌下将壳聚糖酸溶液缓慢加入步骤1)的矿浆中，连续搅拌反应6小时，反应温度为70℃；3)将含铜量为蒙脱石矿物重量4％的五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)，于搅拌下缓慢加入步骤2)的矿浆中，检测并调节矿浆的pH值为5.0，室温反应5小时；4)检测步骤3)矿浆的pH值，用1moL/L的碳酸氢钠水溶液调节，使浆液pH值为7.5；水洗5次，离心脱水；
5)将步骤4)所得的滤饼烘干、粉碎至500目，得到一种载铜硅酸盐抗菌剂。
将64头体重7.8kg左右的“杜长大”三元杂交仔猪按饲养试验要求分成2组，每组设4个重复，每个重复8头，分别饲喂含0和0.10％载铜硅酸盐抗菌剂的饲粮，自由采食和饮水，试验期50天。记录腹泻情况、耗料量、空腹始重和终重。饲养试验结束后，每组选体重相近8头猪(每个重复2头，公母各半)屠宰，无菌采取结肠内容物，待进行大肠杆菌分析；取0.5cm×0.5cm的中部空肠一段，用0.9％NaCl将其冲洗干净，平铺在滤纸上将液体吸干，尔后浸入甲醛固定液，待光镜分析用。结果表明，在对照日粮中添加0.10％载铜硅酸盐抗菌剂使仔猪日增重提高了10.2％(P＜0.01)，料重比下降了7.5％(P＜0.05)，对日采食无显著影响；显著降低了仔猪腹泻率，使仔猪平均腹泻率比对照组降低了55.8％(P＜0.01)；使结肠内容物中大肠杆菌显著下降(P＜0.01)；使空肠绒毛高度和绒毛高度/腺窝深度的比率分别提高了21.3％(P＜0.05)和32.5％(P＜0.01)。
权利要求
1.一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法，其特征在于方法的步骤如下1)将蒙脱石矿物，连同相当于矿物重量5％～15％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为10％～20％的悬浮液矿浆，室温钠化10～15小时，水洗5～7次，用水重新制成浓度为10％～20％的矿浆；2)将相当于蒙脱石矿物重量0.5％～5％的壳聚糖溶解在体积分数为1～5％的醋酸或盐酸水溶液中，配成壳聚糖重量比含量为0.1～5g/100mL的壳聚糖酸溶液，于搅拌下将壳聚糖酸溶液缓慢加入步骤1)的矿浆中，连续搅拌反应5～10小时，反应温度为20℃～70℃；3)将含铜量为蒙脱石矿物重量1～6％的铜盐，于搅拌下缓慢加入步骤2)的矿浆中，检测并调节矿浆的pH值为3.5～6.5，室温反应5～10小时；4)检测步骤3)矿浆的pH值，用碱性溶液调节，使浆液pH值为7.0～8.5；水洗3～7次，过滤或离心脱水；5)将步骤4)所得的滤饼烘干、粉碎至大于300目，得到一种载铜硅酸盐抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法，其特征在于所说的壳聚糖为分子量为2～80kDa、脱乙酰度为80～95％的壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法，其特征在于所说的铜盐为氯化铜、硝酸铜、硫酸铜或者其水合物。
4.根据权利要求1所述的一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法，其特征在于所说的碱性溶液为浓度为0.5～10moL/L的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾的水溶液。
5.一种如权利要求1所述的一种载铜硅酸盐抗菌剂的用途，其特征在于它用作畜禽、水产动物、牛羊的饲料添加剂。
全文摘要
本发明公开了一种载铜硅酸盐抗菌剂的制备方法和用途。其制备方法的步骤如下1)蒙脱石钠化；2)钠化蒙脱石负载壳聚糖；3)蒙脱石壳聚糖复合物负载铜；4)滤饼烘干、粉碎。本发明的载铜硅酸盐抗菌剂可用作畜禽、水产动物、牛羊的饲料添加剂，具有抗菌作用强、细菌不易产生耐药性、使用安全等特点，能有效抑制动物肠道病原菌的增殖，保护肠粘膜免受病原菌的侵袭，使肠粘膜始终处于健康状态，以益于消化酶的分泌和饲料养分的消化，显著提高动物成活率、降低动物腹泻、提高生产性能，可替代抗生素和抗菌药物，生产无抗生素残留的动物产品，推动养殖业的绿色化进程。
文档编号A61K33/34GK1826898SQ20061005024
公开日2006年9月6日 申请日期2006年4月7日 优先权日2006年4月7日
发明者夏枚生, 胡彩虹, 赵文艳 申请人:浙江大学