专利名称：：功能性抗体的制作方法功能性抗体相关申请的交叉参考本申请要求2006年2月15日申请的美国申请No.60/773,994的优先权，该申请全文引入作参考。发明领域本发明涉及新的抗体，其包含单结构域结合位点。上述抗体可以是二价或者多价抗体，且可以是双特异性或多特异性的。本发明还揭示了结合细胞表面受体蛋白的双特异性抗体和多特异性抗体。当单独或者与抗血管生成或抗肿瘤发生的药物组合给予对象时，上述抗体可用于抑制肿瘤生长以及抑制过度增生性疾病。
背景技术：
：双特异性抗体(BsAb)是基于免疫球蛋白(Ig)的分子，其结合相同或不同抗原上的两个不同表位。实验室和早期临床研究已经表明BsAb在癌症治疗中可具有显著意义，例如通过使细胞毒性剂如效应细胞、放射性核素、药物和毒素耙向肿瘤细胞(Weineretal.,1997，CancerImmunol.Immunother.45:190-2.;vanSprieletal"2000，Immuol.Today21:391-7;Segaletal"2000,J.Immunol.Methods248:1-6)，或者通过同时耙向两个不同的肿瘤耙位(或者表位)以增强单个抗体治疗方法的生物学活性(Luetal.,1999,J.Immunol.Methods230:159-71;Luetal"2001，CancerRes.61:7002-8.;Luetal.,2002，J.Immunol.Methods267:213-26)。发展基于BsAb的治疗方法中的一个主要障碍是通过包括杂交瘤和化学结合方法的传统方法难以产生足够数量和质量的材料进行临床研究(Carteretal.，1995，J.Hematotherapy4:463-70)。两个不同系列的IgG轻链和重链的共表达可以产生许多轻链和重链对，其中仅一对是希望的功能性双特异性异源二聚体(Sureshetal.,1986,MethodsEnzymol.121:210-28)。另一方面，两个IgG或其片段的化学交联通常是无效的，且可导致丧失抗体活性(Zhuetal.，1994，CancerLett.86:127-34)。在这两种方法中，BsAb从非功能性物质中的纯化通常较难且产量通常较低，所述非功能性物质例如是通过杂交瘤技术产生的非同源Ig轻链和重链的同源二聚体和错配的异源二聚体，及得自化学结合的多聚聚集体(Caoetal.，1998，Bioconj.Chem.9:635-44)。为了改善功效，已经开发了许多重组方法产生BsAb，作为抗体片段形式(Carteretal"1995;Pluckthunetal"1997，Immunotechology3:83-105;Todorovskaetal.，2001,J.Immunol.Methods248:47-66)和全长IgG形式(Carter,2001，J.Immunol.Methods248:7-15)。例如，同源全长IgG样BsAb的产生已经通过所谓的"knobs-into-holes"工程学方法实现有效的IgCH3结构域异源二聚体化(Ridgwayetal.,1996,ProteinEng.9:617-21;Merchantetal.，1998，Nat.Biotech.16:677-81)，以及通过不同特异性的两个单链Fv(scFv)融合在全长IgG分子的N或C末端上(Zhuangetal.,2000，ProteinEng.13:361-7;ColomaandMorrison,1997，Nat.Biotechnol.15:159-63)而实现。BsAbs已如下构建，即使用或不使用柔性接头遗传融合两个单链Fv(scFv)或Fab片段(Mallenderetal.，1994,J.Biol.Chem.269:199-206;Macketal.，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:7021-5;Zapataetal"1995，ProteinEng.8:1057-62)，经二聚化装置如亮氨酸拉链(Kostelnyetal.，1992，J.Immunol.148:1547-53;deKruifetal.，1996，J,Biol.Chem.271:7630-4),和IgCL/CH1结构域(Mulleretal.，1998,FEBSLett.422:259-64);经二价抗体(Holligeretal.,1993，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.90:6444-8;Zhuetal.,1996,Bio/Technology(NY)14:192-6);Fab-scFv融合(Luetal"2002;Schoonjansetal.,2000，J.Immunol.165:7050-7);及小抗体形式(miniantibodyformats)(Packetal,,1992,Biochemistry31:1579-84;Packetal.，1993，Bio/Technology11:1271-7)。在大多数情况中，这些重组方法导致二价双特异性抗体产生，其对于每个靶抗原是单价的。进一步地，包含功能性Fc结构域的IgG样双特异性抗体例子是有限的。发明概述本发明提供了新的双特异性抗体，其包含单一可变结构域(sVD)抗原结7合位点。本发明的抗体也可以包括这样的抗原结合位点，其除了sVD抗原结合位点之外还包含抗体Fvs。本发明的抗体可以特异于任何抗原。在一个实施方案中，本发明的抗体结合细胞表面抗原，所述抗原可以是受体酪氨酸激酶(包括但非限于PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、EGFR)。在另一个实施方案中，本发明的抗体结合细胞表面受体的配体。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体具有受体中和活性。本发明进一步提供了所述抗体的药物学组合物。本发明提供了抑制一或多种受体酪氨酸激酶激活的方法。哺乳动物中的肿瘤生长可以通过给予该哺乳动物有效量的本发明抗体而治疗或抑制。本发明的抗体可以与结合其它细胞表面抗原(包括例如RTK)或者细胞因子(包括例如RTK配体)的抗体共同给药。在某些实施方案中，本发明的方法还包括给予所述哺乳动物抗肿瘤剂或者包括例如化疗剂和域放疗的治疗方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物中非癌症过度增生性疾病例如银屑病的方法。附图简述图1是本发明的基于单结构域抗体的双特异性抗原结合蛋白的举例示意图。所述单结构域(在图中称作VH2)可以通过融合于其它抗体结构域的N末端或C末端而掺入。图2示出mPDGFRa-特异性Fab的表达和纯化。所述Fab在大肠杆菌宿主HB2151细胞中表达，通过亲和层析纯化，并通过SDS-PAGE进行分析。A)具有相似分子量的重链(VH-CHl)和轻链(VL-CO的"标准"mPDGFRa-特异性Fab。B)在存在或不存在DTT条件下缺少VL结构域的1F2和1F9Fab片段及标准Fab对照。分子量标记的单位是千道尔顿。图3示出纯化的Fab的结合和阻断测定。A)纯化的Fab与小鼠PDGFRa的定量结合ELISA。首先将各种量的Fab在预先用mPDGFRa-Fc融合蛋白包被的96孔平板中保温，随后与兔抗-抗-人-K抗体HRP结合物保温。与平板结合的抗体-HRP通过加入过氧化物酶底物进行量化，在^4450nm读取吸光度。B)纯化的Fab对mPDGFRa与固定的PDGF-AA结合的抑制。将各种量的Fab与固定量的mPDGFRoc/Fc在溶液中保温。将混合物在用PDGF-AA包被的96孔平板中保温，随后与抗人-Fc抗体-HRP结合物保温。然后通过加入过氧化物酶底物量化结合的mPDGFRa，在^450nm读取吸光度。示出的数据是一式两份样品的平均值土SD。图4示出本发明的单价和二价Fab的结构。图5示出二价mPDGFRa特异性Fab的表达和纯化。所述Fab在大肠杆菌宿主HB2151细胞中表达，通过亲和层析纯化，并通过SDS-PAGE进行分析。在非还原条件下对比二价lF2-2HFab与标准Fab(5C5)。分子量标记的单位是千道尔顿。图6示出纯化的抗体的结合阻断测定。A)纯化的抗-mPDGFRoc单价和二价1F2Fab抗体的定量结合测定。将各种量的抗体在预先用mPDGFRa/Fc包被的96孔平板中保温，随后与抗-人-k抗体HRP结合物保温。然后通过加入过氧化物酶底物量化结合平板的抗体-HRP，在^450nm读取吸光度。B)纯化的Fab抗体对mPDGFRa与固定的PDGF-AA结合的抑制。将各种量的抗体与固定量的mPDGFRa-Fc保温，将该混合物转移至预先用PDGF-AA包被的平板中。洗涤之后，将该平板与抗-人-Fc抗体-HRP结合物保温。通过加入过氧化物酶底物量化结合的mPDGFRa，在^450nm读取吸光度。示出的数据是一式两份样品的平均值士SD。2B4是针对小鼠VEGFR2(Flkl)的抗体。图7提供了基于lF2的全长IgG的示意图。1F2VH表达为融合至CL和/或CH的融合蛋白，提供四价(A组MW150,000)或二价(B组和C组M]^125，000)抗体。图8示出抗mPDGFRa抗体的表达和纯化。在右侧组中，在进行电泳之前用DTT处理抗体。图9示出纯化的抗体的结合及配体阻断测定。A)定量结合纯化的抗-mPDGFRa抗体o将各种量的抗体在预先用mPDGFRa/Fc包被的96孔平板中保温，随后与抗人-k抗体HRP结合物保温。通过加入过氧化物酶底物量化结合平板的抗体-HRP，在^450nm读取吸光度。B)纯化的抗体对mPDGFRoc与固定的PDGF-AA结合的抑制。将各种量的抗体与固定量的mPDGFRa/Fc保温，转移至预先用PDGF-AA包被的平板中。洗涤平板后，将其与抗-人-Fc抗体-HRP结合物保温。然后通过加入过氧化物酶底物量化结合的mPDGFRa，在4450nm读取吸光度。数据表示一式两份样品的平均值士SD。2B4是针对小鼠VEGFR2(Flkl)的抗体。图10提供了结合mPDGFRa与flk-l的所选择的基于1F2的四价双特异性抗体的示意图。A)IgG-样抗体称作1F2/scFv2B4。1F2VH表达为融合至CL的融合体，2B4表达为融合至Ch的scFv融合体。B)IgG-样抗体称作1F2-2B4。1F2VH表达为与2B4Vl氨基末端融合的融合体。图11示出基于1F2的双特异性抗体的表达和纯化。所述抗体在哺乳动物细胞中表达，通过亲和层析纯化，并通过SDS-PAGE进行分析。在电泳之前用/不用(+Z-)DTT处理所述抗体。分子量标记的单位是千道尔顿。图12示出纯化的抗-mPDGFRaX抗-Flk-l双特异性抗体的定量结合测定。A)首先将各种量的抗体在预先用mPDGFRa/Fc包被的96孔平板中保温，随后与抗-人-ic抗体HRP结合物保温。B)首先将各种量的抗体在预先用Flk-1/Fc包被的96孔平板中保温，随后与抗人K抗体HRP结合物保温。示出的数据是一式两份样品的平均值士SD。图13示出纯化的双特异性抗-mPDGFRaX抗-Flk-l双特异性抗体的阻断测定。A)纯化的双特异性抗体对mPDGFRa与固定的PDGF-AA的结合的抑制。B)纯化的双特异性抗体对Flk-l与固定的VEGF165的结合的抑制。在这两个测定中，将各种量的抗体与固定量的受体(mPDGFRa/Fc或Flk-l)在溶液中保温，转移至预先用配体(PDGF-AA或VEGF165)包被的平板中。然后将平板与抗-人-Fc抗体-HRP结合物保温。通过加入过氧化物酶底物量化mPDGFRa，在A450nm读取吸光度。示出的数据是一式两份样品的平均值土SD。图14示出双特异性1F2-2B4IgG对PDGF和VEGF刺激的受体磷酸化的抑制作用。首先将eEnd.l细胞与各种抗体在37X:保温30分钟，随后用VEGF或PDGF在37。C刺激15分钟。在细胞裂解后，通过与抗-mPDGFRa、或者抗-mVEGFR2抗体及随后ProA/G-琼脂糖珠的保温从细胞裂解物上清中免疫沉淀受体。在4-12%NupageBis-Tris凝胶上分辨沉淀的受体蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜上。使用抗-磷酸酪氨酸抗体-HRP结合物在印迹上检测磷酸-mVEGFR2和磷酸-mPDGFRou加样于凝胶上的总受体蛋白使用mPDGFRot或mVEGFR2的抗体测定。图15示出一些已鉴定的Fab蛋白的VH和VL结构域的氨基酸序列。Fab1E10、1A11、3B2、1C10、3G7、1F9禾B1F2在针对结合小鼠PDGFRoc的Fab-噬菌体的筛选中鉴别。Fab2B4在针对结合小鼠VEGFR2的Fab-噬菌体的筛选中鉴别。移码突变；*:移码突变产生的终止密码子；@...@:符合读框的缺失。发明详述本发明提供了包含单一可变结构域(sVD)抗原结合位点的新抗体。本发明还提供了抗原结合蛋白，其包含单结构域抗原结合位点和两个结构域的Fv样抗原结合位点。单结构域抗原结合位点与免疫球蛋白可变结构域(例如Vh或Vl)相似，但是在不存在第二个抗原结合结构域(例如相应的VL或VH)的条件下能特异性结合抗原。这种单结构域也许事实上并不能与相应的结合结构域稳定缔合。然而，单结构域抗体可以以与既包含VL结构域也包含VH结构域的抗体相似的亲和性和亲合力结合抗原。此外，与天然抗体一样，单结构域抗体可以阻断受体-配体相互作用。因此，包含单结构域结合位点的本发明的抗体与得自例如杂交瘤、表达人抗体的转基因小鼠及Fab或scFv结合结构域的噬菌体展示文库的抗体用于相同目的。本发明的抗体在一些方面是免疫球蛋白样抗体。l)IgG样的本发明的抗体是由两个不同多肽链(每个多肽链由两个不同多肽链组成)组成的异源四聚体。2)所述不同的多肽链缔合且可以例如通过二硫键以相同方式共价连接标准的天然存在的免疫球蛋白的重链和轻链恒定区。3)所述多肽链之一能以天然存在的免疫球蛋白重链的方式稳定自身缔合。例如，所述多肽链之一可包括相应于天然存在的免疫球蛋白的CH2、CH3或CH4的一或多个结构域。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含天然存在的IgG的恒定结构域结构。免疫球蛋白样结构的一个巨大优势是抗体链在表达时天然配对。与现有的一些四聚体抗体不同，不需要进一步处理即可获得同质抗体制备物。本发明的抗原结合蛋白包含抗原结合位点，这些抗原结合位点是单一可变结构域(sVDs)。在本发明的某些实施方案中，sVD结合位点取代IgG样抗体的一个可变结构域，scFv取代另一可变结构域。这个实施方案的例子在图1A中描述。在本发明的其它实施方案中，sVD结合位点在IgG重链或轻链的N末端或C末端与IgG抗体接合(graft)。这个实施方案的例子在图IB中描述。sVD也可以掺入免疫球蛋白样抗体的其它位置中。例如，sVD可以附着在CH和域(V恒定结构域的C末端。此外，通过组合图l所示的sVD结合位点的取代和在Ch和/或CL恒定结构域的C末端添加sVD结合位点，可以产生对于特定抗原多特异性和/或多价的IgG-样抗体。如本领域所己知，Fv由两个结构域组成(例如Vh和Vt结构域)。在标准的抗体中，fv的vh和vl结构域尽管缔合形成抗原结合位点，但是不是直接连接的，而是各与连接的抗体恒定区连接。Fc的VH和VL结构域也可以与合成接头连接形成单链Fv(scFv)。抗体特异性是指抗体对于抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。双特异性抗体(BsAb)是具有两种不同的抗原结合特异性或位点的抗体。当抗原结合蛋白具有一种以上特异性时，被识别的表位可以与单一抗原或一个以上抗原相关。天然抗体分子由两个相同重链和两个相同轻链组成。每个轻链均通过链内二硫键与重链共价连接。两个重链通过在铰链区的多个二硫键进一步彼此连接。各个链折叠为具有相似大小的结构域(大约110-125个氨基酸)和结构，但是它们功能不同。轻链包含一个可变结构域(vo和一个恒定结构域(CO。重链包含一个可变结构域(vh)，且根据抗体的类别或同种型而包含三或四个恒定结构域(CHl、CH2、CH3和Ch4)。在小鼠和人中，同种型是IgA、12IgD、IgE、IgG和IgM，IgA和IgG进一步再分为亚类或亚型。由V^和Vh结构域组成的抗体部分被称作Fv，其组成抗原结合位点。单链Fv(scFv)是经工程化的蛋白质，在一个多肽链上含有V^结构域和VH结构域，其中一个结构域的N末端和另一个结构域的C末端通过柔性接头结合。Fab是指由V^VH、Cl和Ch1结构域组成的抗体部分。"可变结构域显示出一个抗体与下一个、特别是位于抗原结合位点的抗体的氨基酸序列可变性。在Vl和VH中各发现了三个区域，称作"高度可变区"、"互补决定区(CDR)"。Fc是包含成对的重链恒定结构域的抗体部分的名称。在IgG,抗体中，例如Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc进一步包含CH4结构域。Fc与Fc受体结合、补体介导的细胞毒性及抗体依赖性细胞细胞毒性相关。对于天然抗体如IgA和IgM，它们是多个IgG样蛋白质的复合物，复合物形成需要Fc恒定结构域。最后，"铰链"区分开了抗体的Fab和Fc部分，提供了Fab相对于彼此以及相对于Fc的活动性，并且包括多个二硫键以共价连接两个重链。本发明的抗体具有希望的特征组合。首先，它们基本上是同质的。通过设计，抗体重链和轻链的错配被显著降低或消除。例如，一些双特异性抗体利用两个不同的重链提供两种特异性。当这种重链排列在IgG型分子中时，可能有四种组合。其中两种由错配的重链组成，由此产物是单特异性的。在本发明的抗体中，错配基本上被消除。本发明的抗体第二个特征是其对于每种结合特异性是二价的。许多双特异性抗体对于包含的每个抗体结合位点是单价的。这对于抗体功能是有意义的，因为二价允许结合的协同性，及结合亲合力相对于包含单抗原特异性结合位点的分子显著增加。本发明的抗体的第三个优势是存在组成天然抗体的Fc区域(例如IgGi抗体的CH2和域CH3)且提供其它抗体功能的一或多个重链恒定结构域。另外，多个结合结构域与恒定结构域分隔开，由此由恒定结构域提供的功能不被削弱。恒定结构域功能包括结合某些附加分子(例如结合细胞表面及可溶的Fc受体，针对IgA和IgM的J链缔合，针对IgA的S蛋白)、激活补体途径(补体依赖性细胞毒性，CDC)、通过一些不同的白细胞群对与靶细胞结合的抗体的识别(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC)及调理作用(增强吞噬作用)。Fc重链恒定结构域也可以赋予增加的血清半衰期。本发明的蛋白质的第四个优势是在体外加工获得完整的产物中无要求。尽管以人工方式重排，但是每个结构域均具有允许在生物学系统中表达的天然特征。例如，双特异性抗体可以在原核及真核表达系统中表达。产生的蛋白质基本上是双特异性的。用于本发明的抗体中的sVD抗原结合位点和含有Fv区的结合位点可以通过多种方法获得。所选择的结合结构域的Vh和/或VL部分的氨基酸序列可以得自天然存在的抗体，或者根据希望的结合特征进行挑选或修饰、筛选，或者选择。例如，Vh和/或VL结构域可以直接得自具有希望的结合特征的单克隆抗体。或者，Vh和/或VL结构域可以得自选择的哺乳动物的V基因序列文库。这种文库的元件表达VH和/或VL结构域的随机组合，并且被任何希望的抗原筛选以鉴别具有希望的结合特征的那些元件。特别优选的是人V基因文库。这种筛选的方法为本领域所已知。或者，来自所选择的非人来源的Vh和/或Vl结构域可以被掺入包含人恒定结构域的嵌合抗体中。例如，对于给予人，可能希望的是使用具有一或多种功能性人恒定结构域的抗体，其中Vh和VL结构域选自非人来源。为了最大化恒定结构域相关功能或者降低抗体的免疫原性，优选人恒定结构域。或者，V结构域可以被"人源化"。人源化的可变结构域的构建是其中包含非人来源的一或多个互补决定区(CDRs)的氨基酸序列与人构架区(FR)结合。例如，见Jones,RT.etal"1996，Nature321，522-25;Riechman，L.etal.,1988，Nature332，323-27和Queen等的美国专利No.5,530,101所述。人源化的构建体特别用于消除不利的免疫原性特征，例如在来自非人来源的抗原结合结构域预期用于治疗人的情况中。可变结构域具有高度结构同源性，允许简便地鉴别可变结构域中的相应于CDR和FR的氨基酸残基。见例如Kabat,E.A.，etal,,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.5thed.NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD所述。因此，参与抗原结合的氨基酸易于被鉴别。另外，已经开发了保持或增强包含接合的CDR的人源化结合结构域的抗原亲和性的方法。一种方式是将影响所述CDR区构象的外来构架残基包括在受体可变结构域中。另一种方式是将外来CDR接合在与所述外来可变区最同源的人可变结构域上。Queen,C.etal.，1989，Proc.Natl.Acad.ScLUSA86,10029-33。通过首先使用包含希望的CDR序列的重叠引物扩增各个FR序列，及在随后的扩增反应中连接所得基因节段，CDR最方便地被接合在不同的FR上。CDR接合在不同可变结构域上可以进一步取代这样的氨基酸残基，这些残基与氨基酸序列中的CDR相邻或者在影响CDR的构象的折叠可变结构域结构中针对CDR而堆积(packed)。本发明的人源化的可变结构域因此包括包含一或多个非人CDR的人结构域以及其中已经进行额外取代或置换以保持或增强结合特征的结构域。本发明的抗体也可以使用已经通过置换暴露于表面的残基而降低免疫原性的可变结构域，以产生看起来针对自身免疫系统的抗体(Padlan，E.A.，1991，Mol.Immunol.28,489-98)。抗体通过这种方法修饰不丧失亲和性(Roguskaetal，，1994,Proc.Natl.Acad.ScLUSA91,969-973)。由于抗原结合位点附近的氨基酸的内部堆积保持不变，因此保持了亲和性。根据本发明降低免疫原性而进行的暴露于表面的残基的取代不意味着CDR残基或影响结合特征的相邻残基的取代。通常可优选使用基本上是人的可变结构域。人结合结构域可以得自噬菌体展示文库，其中人重链和轻链可变结构域的组合展示于丝状噬菌体的表面上(见例如McCaffertyetal.,1990,Nature348，552-54;Aujameetal.,1997,HumanAntibodies8,155-68)。可变结构域的组合典型以Fab或scFv形式展示于丝状噬菌体上。针对具有希望的抗原结合特征的可变结构域组合筛选文库。优选的单结构域和可变结构域组合显示出对于选择的抗原的高度亲和性及对于其它相关抗原的很少的交叉反应性。通过筛选众多的抗体片段(见例如Griffithsetal.，1994,EMBOJ.13，3245-60)，分离多种多样的高度亲和性结合结构域，预期其中一些结构域对于希望的抗原具有亚纳摩尔(sub-nanomolar)亲和性。或者，人结合结构域可以得自其中导入未重排的人Ig基因节段且其中内源小鼠Ig基因已经失活的转基因动物中(参见BruggemannandTaussig,1997，Curr.Opin.Biotechnol.8，455-58)。优选的转基因动物含有大小超过1Mb的极大的连续Ig基因节段(Mendezetal.，1997，NatureGenet.15,146-56)，但是中等亲和性的人Mab可以从含有较小基因座的转基因动物中产生(见例如Wagneretal"1994,Eur.J.Immunol.42，2672-81;Greenetal"1994,NatureGenet.7，13-21)。sVD结合位点可得自抗原特异性Fv区域(其既包含VH结构域也包含VL结构域)。通常地，可以表明Fv区域的结合亲和性及特异性主要由可变结构域之一导致。或者，scFv可以直接获得。sVD的直接来源包括哺乳动物(例如骆驼)，其天然表达仅含有VH结构域的抗体并构建为仅表达单一可变结构域的噬菌体展示文库。例如，人结构域抗体噬菌体展示文库可商购自Domantis(Cambridge,UK)。如本文所例证，特异于PDGFRot的sVD结合位点得自含有VL结构域己经自然缺失的变体的Fab文库。在生理学免疫应答中，表达的抗体基因的突变和选择导致对靶抗原具有高度亲和性的抗体的产生。掺入本发明抗体中的Vh和VL结构域可以被类似地进行体外突变，并进行筛选程序获得高度亲和性的变体。因此，本发明的结合结构域包括结合特征已经通过直接突变或者通过亲和性成熟方法加以改良的那些结构域。亲和性和特异性可以通过突变CDR并筛选具有预期特征的抗原结合位点而被修饰或改良(见例如Yangetal.,1995,J.Mol.Bio.254,392-403)。本领域技术人员了解作为单结构域抗体的主要结合决定因素的氨基酸可以是在Kabat描述的CDR内，但是可以包括其它残基以及例如如包埋在Vh-Vl昇源二聚体的Vh-Vl界面中的残基。CDR或者决定结合的其它残基以多种方式被突变。一种方式是随机化各个残基或残基组合，以便在其它方面相同的抗原结合位点群中，在特定位置发现所有二十个氨基酸或其亚型。或者，通过易错PCR方法在CDR残基范围内诱导突变(见16例如Hawkinsetal.，1992，J.Mol.Bio.226，889-96)。含有编码结合结构域的基因(例如重链和/或轻链可变区基因)的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌的突变菌株中增殖(见例如Lowetal.，1996，J.Mol.Bio.250,359-68)。这些诱变方法是本领域技术人员已知的众多方法的例子。本发明的抗体的每个可变结构域可以是完整的免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，或者可以是天然存在的结构域的功能性等价物或其突变体或衍生物，或者是例如在体外使用如WO93/11236(MedicalResearchCouncil/Griffithsetal.)所述技术构建的合成的结构域。例如，可以掺入相应于缺失一或多个氨基酸的抗体可变结构域的结构域。重要的鉴定特征是每个可变结构域与互补结构域结合形成抗原结合位点的能力。本发明的抗原结合位点具有任何表位、抗原性位点或蛋白质的结合位点。特别感兴趣的是用于治疗疾病的抗体。优选的抗体中和受体蛋白，如参与血管生成和/或肿瘤形成的受体。中和受体是指使受体转导信号的固有激酶活性失活。可靠的受体中和测定是受体磷酸化的抑制。本发明不限于任何特定的受体中和机制。一些可能的机制包括防止配体与受体的胞外结合结构域结合，及防止受体的二聚体化或寡聚体化。然而，不排除其它机制。内皮细胞或者非内皮细胞如肿瘤细胞的样品中受体激活的中和可以在体外或体内进行。受体表达细胞的样品中的受体激活的中和包括将细胞与本发明的抗体接触。在体外，在向细胞样品中加入VEGF之前、同时或之后将细胞与抗体接触。在体内，通过给予哺乳动物本发明的抗体而与受体接触。给予哺乳动物的方法包括例如口服、静脉内给予、腹膜内给予、皮下给予或者肌内给予。这种受体的例子包括但非限于血小板衍生生长因子受体(PDGF-R)、VEGF受体(例如VEGFR-2/KDR/Flk-l、VEGFR1/Flt-1、VEGFR3/Flt-4)、表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)等。其它非限制性受体酪氨酸激酶的例子包括Flt-4、HER2/neu、Tek和Tie2。可作为体内血管生成和/或肿瘤生长的调节剂的其它因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)和神经生长因子(NGF)。相应的受体是成纤维细胞生长因子受体(FGF-R)和神经生长因子受体(NGFR)。参与细胞迁移、形态改变和侵入性的另一受体是巨噬细胞刺激蛋白受体(MSP-R或RON)。感兴趣的受体包括人蛋白及来自其它哺乳动物的同系物。本发明的抗体可以掺入任何来源的Ig抗原结合结构域。上面所列受体的抗体例如是已知的，并且是用于本发明的抗体中Vh和VL结构域的来源。特异于KDR的scFv可变区结合结构域的例子包括例如IMC-1C11(Vh的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:l和2;Vl的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:3和4)(见WO00/44777)、IMC-2C6(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:5禾n6;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:7和8)(见WO03/075840)及IMC-1121(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:5和6;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:9和10)(见WO03/075840)的VH和VL结构域。特异于Flt-l的结合结构域的例子包括6.12(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:11和12;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:13禾B14)及IMC-18F1(vh的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:27和28;V^的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:29和30)。特异于EGFR的结合结构域包括例如ERBITUX(Cetuximab;IMC-C225)(vh的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:15和16;vl的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:17和18)，如WO96/40210揭示；及IMC11F8(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:19和20;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:21和22)。特异于IGFR的结合结构域的例子是IMC-A12(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:23和24;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:25和26)。结合FGF受体的抗体(见WO2005/037235)包括例如FR1-H7(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:31和32;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:33和34)、FR1-A1(VH的核苷酸和氨基酸序列:SEQIDNO:35和36;V^的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:37和38)，及FR1-4H(Vh的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:39和40;的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:41和42)。结合RON或MSP-R的抗体(见WO2005/120557)包括IMC-41A10(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:43和44;Vi^的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:45和46)及IMC-41B12(VH的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:47和48;VL的核苷酸和氨基酸序列SEQIDNO:49和50)。结合PDGFRot的抗体包括例如3G3和7Gll(Loizosetal.，2005,Mol.CancerTher.4:369)。进一步地，上面所列的结合结构域的如CDR区域的部分可以掺入用于产生本文所述的结合蛋白的结合结构域中。某些优选的抗体结合上面所列的受体中的两种。在本发明的实施方案中，双特异性抗原结合蛋白结合并阻断参与血管生成的两种不同的受体酪氨酸激酶的激活。在一个这样的实施方案中，所述抗体结合PDGFR和VEGF受体，例如VEGFR2/Flk-1/KDR。在另一个这样的实施方案中，所述抗体结合KDR和FLT-I。在另一个实施方案中，本发明的抗体结合HER2和EGFR。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体结合EGFR和IGFR。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白结合EGFR和VEGFR。在一个优选的实施方案中，所述VEGFR是VEGFR2。这种抗体可用于阻断血管上皮细胞的刺激，这通过EGFR和VEGFR阻断信号传导而实现。这在应答肿瘤细胞分泌的EGFR配体、特别是TGFoc而出现血管生成的情况中特别有用。本发明的抗体可用于使靶细胞上的抗原与免疫系统效应细胞上的抗原交联。这可用于例如促进针对在细胞表面上具有感兴趣的特定抗原的细胞的免疫应答。根据本发明，免疫系统效应细胞包括抗原特异性细胞如激活细胞免疫应答的T细胞，和非特异性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和介导细胞免疫应答的天然杀伤(NK)细胞。本发明的抗体可具有免疫系统效应细胞的任何细胞表面抗原的结合位点。这种细胞表面抗原包括例如细胞因子和淋巴因子受体、Fc受体、CD3、CD16、CD28、CD32禾HCD64。除了sVD提供的抗原结合位点之外，双特异性抗体还可包含Fv提供的结合位点。这种Fv可得自前述抗原的抗体、得自组合文库，以及通过本领域熟知的其它方法获得。特异于细胞因子和淋巴因子受体的双特异性抗体也可以包括包含相应于受体的所有或部分天然配体的氨基酸序列的结合位点。例如，在细胞表面抗原是IL-2受体的情况中，本发明的双特异性抗体可具有包含相应于IL-2的氨基酸序列的抗原结合位点。其它细胞因子和淋巴因子包括例如白细胞介素如白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-5(IL-5)，及集落刺激因子(CSF)如粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)。本发明的抗体可以通过表达两个多肽链而产生，它们在一起包含至少一个单结构域抗原结合位点。这两个多肽链均包含能二聚体化的至少一个重链恒定结构域(例如CH2和/或CH3)。使用在每个多肽链的起始处包含细菌分泌信号序列的DNA构建体，可以在大肠杆菌中便利地产生抗体。本领域己知许多细菌信号序列。优选的信号序列来自五nv/m'a^ratovora的pelB基因。编码抗体的DNA片段可以被克隆进例如使用人巨细胞病毒启动子(HCMV)和增强子的载体中以在哺乳动物细胞中高水平表达，所述哺乳动物细胞例如是CHO、NS0、COS-7和PER.C6细胞，及源于淋巴的细胞系如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞(见例如Bendig，etal,U.S.Patent5,840,299;Maeda，etal.(1991)Hum.Antibod.Hybridomas2,124-34)。选择标记是编码在选择性培养基中生长的经转化的宿主细胞存活或生长必需的蛋白质的基因。典型的选择标记编码如下述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)互补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供不可得自复合培养基的关键营养素，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。特别有用的选择标记赋予氨甲喋呤抗性。例如，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂氨甲喋呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体，用DHFR选择基因转化的细胞首先被鉴别。当使用野生型DHFR时合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其制备和增殖方法如UrlaubandChasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sd.USA77,4216所述。然后将转化的细胞暴露于增加水平的氨甲喋呤下。这样导致DHFR基因的多个拷贝合成，并伴随包含所述表达载体的其它DNA如编码所述抗体或抗体片段的DNA的多个拷贝合成。当希望在酵母中表达基因构建体时，用于酵母中的合适选择基因的例子是酵母质粒YRp7中存在的trpl基因。Stinchcombetal.(1979)Nature,282,39;Kingsmanetal.(1979)Gene1，141。trpl基因提供针对缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株的选择标记，例如ATCCNo.44076或PEP4-1。Jones(1977)Genetics85，12。然后，酵母宿主细胞基因组中trpl损害的存在提供了通过在没有色氨酸的条件下生长而检测转化的有效环境。相似地，Leu2-缺陷的酵母株(ATCC20,622或38，626)由携带Leu2基因的已知质粒互补。通过本领域已知方法在液态培养基中培养转化的宿主细胞，所述培养基中含有可同化的碳源例如碳水化合物如葡萄糖或乳糖，氮源例如氨基酸、肽、蛋白质或其降解产物如胨，铵盐等，及无机盐例如硫酸盐、磷酸盐和/或钠、钾、镁和钙的碳酸盐。所述培养基进一步含有例如促进生长的物质如微量元素，例如铁、锌、锰等。结合生长因子受体的抗体优选能阻断受体酪氨酸激酶(RTK)活性的激活。酪氨酸激酶抑制可以使用熟知的方法确定，例如通过测量重组激酶受体的自发磷酸化水平和/或天然或合成物质的磷酸化而确定。因此，磷酸化测定可用于确定本发明的RTK拮抗剂。磷酸化可以例如在ELISA中或者在western印迹上使用特异于磷酸酪氨酸的抗体检测。酪氨酸激酶活性的一些测定方法在Paneketal"J.Pharmacol.Exp.Thera.(1997)283:1433-44和Batleyetal.,LifeSci.(1998)62:143-50中描述。另外，检测蛋白质表达的方法可以用于确定RTK拮抗剂，其中被测量的蛋白质的表达由RTK介导。这些方法包括检测蛋白质表达的免疫组织化学方法(IHC)，检测基因扩增的荧光原位杂交法(FISH)，竞争性放射性配体结合测定法，固相基质印迹技术如Northern和Southern印迹，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA。见例如Grandisetal.，Cancer,(1996)78:1284-92;Shimizuetal.,JapanJ.CancerRes"(1994)85:567-71;Sauteretal.:Am.J.Path.,(1996)148:1047-53;Collins,Glia，(1995)15:289-96;Radinskyetal.，Clin.CancerRes"(1995)1:19-31;Petridesetal.，CancerRes"(1990)50:3934-39;Hoffmannetal.，AnticancerRes"(1997)17:4419-26;Wikstrandetal.，CancerRes"(1995)55:3140-48所述。抗体阻断配体结合的能力可以例如通过在体外竞争性测定法中测量。在这种测定中，固定化RTK的配体(例如EGFR的EGF)，进行结合测定以确定抗体竞争性抑制RTK与固定化的配体结合的效力。体内测定法也可以用于确定RTK拮抗剂。例如，受体酪氨酸激酶抑制可以通过使用在有和无抑制剂的条件下受体配体刺激的细胞进行的促有丝分裂测定法观测。例如，EGF刺激的A431细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville,MD)可用于测定EGFR抑制。另一种方法包括使用例如注射进小鼠中的人肿瘤细胞检测表达EGFR的肿瘤细胞生长的抑制情况。见美国专利No.6，365，157(Rockwelletal.)所述。本发明的优选抗体具有双特异性，且能同时结合两个不同抗原。所述不同的抗原可位于不同细胞上或者位于相同细胞上。抗原的交联可以在体外示出，例如通过提供已经结合了第一抗原的固体表面，加入特异于第一抗原的双特异性抗体及也特异于所述结合蛋白的第二抗原，检测结合的第二抗原的存在。本发明的优选抗体能阻断两个受体与其各自的配体之间的相互作用。例如，特异于KDR和Flt-l的抗体抑制VEGF诱导的细胞迁移以及P1GF诱导的细胞迁移。双特异性抗体中两种受体结合特异性的组合较单独的亲代抗体在抑制细胞迁移方面可以更有效(见例如Zhu，Z.，WO2004/003211)。与单特异性抗体相比，双特异性抗体可以是细胞功能的更有力的抑制齐U。例如，VEGF刺激的细胞功能如内皮细胞的增殖及VEGF-和PlGF-诱导的人白血病细胞的迁移可以被双特异性抗体更有效地抑制，甚至对于一个或这两个靶抗原的亲和性降低。特异于(单价)KDR和Flt-l二者的抗体可以比针对靶抗原任一的单特异性scFv更有效地抑制VEGF或P1GF诱导的细胞迁移(WO2004/003211)。在另一个实施例中，具有EGFR(或Her2/neu)和IGFR双特异性的抗体用于中和EFG-与IGF-刺激的受体激活和下游的信号转导，所述双特异性抗22体能结合这两个受体并阻断与其特异性配体的相互作用。观测到EGFR或IGFR任一的刺激均导致共同下游信号转导分子包括Akt和p44/42的激活(例如磷酸化)，尽管激活程度不同。在一些肿瘤细胞中，EGFR功能的抑制可以通过其它生长因子受体信号途径的正调节而补偿，特别是通过IGFR刺激而补偿。与用结合一种受体且不完全阻断Akt或p44/42的磷酸化的抗体进行的治疗相反，将肿瘤细胞与结合EGFR和IGFR二者的抗体一起保温以阻断Akt和p44/42二者的磷酸化。因此，IGFR信号的抑制导致肿瘤生长抑制且增加肿瘤细胞对于一些治疗剂的敏感性。也观测到使用结合其它RTK例如RON的抗体对这种共同信号转导级联成分磷酸化的抑制。因此，抗原结合蛋白通常可用于治疗特征在于由多个号转导途径激活导致的细胞生长或转化的肿瘤疾病。本发明的抗体可用于治疗多种增生性疾病。例如，本发明提供了治疗表达并由一种以上受体酪氨酸激酶刺激的肿瘤。由一种以上的受体刺激可导致不受控制的生长，其对于单独每种受体的阻断不敏感。或者，第二受体的刺激可增加应答第一受体的剌激而观测到的激活。或者，单个受体的作用可倍增。在每一种上面的情况中，在存在阻断二种受体的抗原结合蛋白的情况中观测到显著改善的对肿瘤生长的抑制。本发明的抗体可用于治疗受体刺激通过EGFR旁分泌和/或自分泌环的疾病。例如，表达EGFR的肿瘤对于其环境中存在的EGF特征性敏感，且可以进一步受肿瘤产生的EGF或TGF-oc的剌激。虽然不希望受任何特定机制的束缚，可以用本发明的方法治疗或预防的疾病或病变包括例如肿瘤生长被刺激的疾病或病变。因此本发明的方法可有效治疗未血管化的实体肿瘤，或者尚未充分血管化的肿瘤。本发明的某些抗体可用于抑制与过度增生性疾病相关的血管生成。例如，通过阻断肿瘤相关的血管生成，可以抑制肿瘤生长。在一个实施方案中，抗体结合肿瘤血管的RTK并抑制肿瘤产生血管生成性配体(即VEGF)，其也结合血管细胞血管的VEGF受体以抑制这种细胞的增殖。在不同的实施方案中，抗体结合多个VEGF受体，由此阻断VEGF或者其它VEGFR配体(例如P1GF)结合一种类型以上的VEGF受体。可以治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移肿瘤，以及难治的肿瘤。难治的肿瘤包括对于单独的化疗剂、单独的抗体、单独的放疗或这些治疗方法的组合均无反应或具有抗性的肿瘤。难治的肿瘤还包括看起来被这样的物质所抑制，但是在停止治疗后至多五年、有时直至十年或更长时间后复发的肿瘤。所述肿瘤可正常水平表达EGFR或其它RTK，或者其可过表达RTK，例如是正常水平的至少10、100或1000倍。表达EGFR且由EGFR的配体刺激的肿瘤的例子包括癌、神经胶质瘤、肉瘤、腺癌、腺肉瘤和腺瘤。这种肿瘤事实上可在机体的任何部位发生，例如在乳腺、心、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈或肝脏发生。根据本发明可以治疗的观测到过表达EGFR的一些肿瘤包括但非限于结肠直肠及头颈肿瘤，特别是头颈鳞状细胞癌，脑肿瘤如神经胶质瘤，及肺、乳腺、胰腺、食道、膀胱、肾、卵巢、子宫颈和前列腺的肿瘤。观测到具有组成型活性的(即未调节的)受体酪氨酸激酶活性的肿瘤非限制性例子包括神经胶质瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌。其它肿瘤例子包括Kaposi's肉瘤、CNS肿瘤、成神经细胞瘤、毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑色素瘤、胃肠和肾的癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、神经胶母细胞瘤，优选多形性神经胶母细胞瘤，及平滑肌肉瘤。其它RTK的过表达可以产生类似的生长缺陷。例如大多数转移骨癌自前列腺、乳腺或者肺转移而来。前列腺肿瘤最初可以是激素依赖性的，但是这种依赖性的丧失与转转移至骨的细胞的IGFR介导的刺激一致。本发明的抗体也可用于治疗除了肿瘤之外的过度增生性疾病，包括给予哺乳动物有效量的本发明的抗体。如本文所揭示，过度增生性疾病是指由表达EGFR家族成员或者其它酪氨酸激酶受体的非癌细胞的过度生长而导致的病变。由过度增殖的疾病产生的过量的细胞在正常水平表达RTK或者其也许过表达RTK。过度增生性疾病的例子包括银屑病、光化性角化病，和脂溢性角化病、疣、瘢痕、及湿疹。也包括由于病毒感染导致的过度增生性疾病，例如乳头状瘤病毒感染。例如，银屑病存在许多不同变化和严重程度。不同类型的银屑病表现出的特征如脓样水泡(脓疱型银屑病)、皮肤严重脱落(红皮病型银屑病)、水滴样斑点(点滴型银屑病(guttaepsoriasis))和平滑肌(smooth)炎症损害(反向银屑病)。本发明预期治疗所有类型的银屑病(例如寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病、关节病型银屑病、副银屑病、掌跖脓疱病(palmoplantarpustulosis))。根据本发明，抗体可以与其它物质如抗肿瘤或抗血管生成物质经化学或生物学合成而结合，以治疗疾病。与抗体连接的抗肿瘤剂包括破坏或损害该抗体结合的肿瘤或者在该抗体结合的细胞环境中的肿瘤的任何制剂。例如，抗肿瘤剂是毒性剂如化疗剂或放射性同位素。使用常规方法将化疗剂与抗体结合(见例如HermentinandSeiler(1988)BehringInst.Mitt.82，197-215)，包括通过肽和非肽接头进行结合。生剂连接。所述信号产生剂产生可通过外部设备测量的信号，通常通过电磁放射设备测量。大多数信号产生物质是酶或生色团，或者发射荧光、磷光或化学发光。生色团包括吸收在紫外光或可见光范围的光线的染料，或者可以是酶催化反应的底物或降解产物。本发明进一步包含本发明的抗体与治疗或诊断剂组成二级试剂的应用。例如，将结合对的一个成员与本发明的抗体连接。将抗肿瘤剂与这个结合对的另一成员结合，并从而导向抗体结合的位点。在一个优选的实施方案中，将生物素与本发明的抗体结合，从而为提供与抗生物素蛋白或链霉亲和素结合的抗肿瘤剂或其它成分提供靶位。或者，将生物素或其它这种成分与本发明的抗体连接，并在例如诊断系统中用作报道蛋白，其中可检测的信号产生及与抗生物素蛋白或链霉亲和素结合。抗体可以与一或多种合适的佐剂组合给予，所述佐剂例如是细胞因子(例如IL-10和IL-13)，或其它免疫刺激剂，例如但非限于趋化因子、肿瘤相关的抗原，及肽。然而，应意识到单独给予抗体即足以以治疗有效方式防止、抑制或降低肿瘤的进展。在某些实施方案中，希望的是结合RTK并阻断配体结合的本发明抗体组合结合配体的另一种抗原结合蛋白给予对象。配体结合抗体为本领域所熟知，包括例如抗-VEGF(Avastin;bevacizumab)。本发明的抗体也用于组合的治疗方法中，通过与抗肿瘤剂如化疗剂或放射性同位素组合给药。合适的化疗剂为本领域技术人员所已知，包括伊立替康(irinotecan)(CPT-ll)、蒽环类制齐U(例如道诺霉素和阿霉素)、氨甲喋呤、长春花碱酰胺(vindesine)、新制癌菌素、顺铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、(左旋)苯丙氨酸氮芥、蓖麻毒蛋白和calicheamidn。抗体和抗血管生成或抗肿瘤剂以有效抑制血管生成和/或降低肿瘤生长的量给予患者。抗体也可以与其它治疗方案组合给予，例如与放疗组合。组合治疗的例子见例如美国专利No.6,217,866(Schlessingeretal.)(抗-EGFR抗体组合抗肿瘤剂)；WO99/60023(Waksaletal.)(抗-EGFR抗体组合放疗)所述。可以使用任何合适的抗肿瘤剂，例如化疗剂、放疗或者这些疗法的组合。本领域已知或正在评估中的抗肿瘤剂基于其靶位或作用模式而分类。例如，烷化剂包括但非限于顺铂、环磷酰胺、(左旋)苯丙氨酸氮芥和氮烯唑胺。抗代谢物的例子包括但非限于阿霉素、道诺霉素和紫杉醇(paditaxel)，吉西他滨(gemcitabine)，及拓扑异构酶抑制剂伊立替康(irinotecan)(CPT-ll),氨基喜树碱(aminocamptothecin)，喜树碱(camptothecin)，DX-8951f，及拓扑替康(拓扑异构酶I)和依托泊苷(etoposide)(VP-16)和替尼泊苷(teniposide)(VM-26)(拓扑异构酶n)。对于放疗而言，放射源对于治疗的患者可以是外部(外部外放射治疗-EBRT)或内部的(短距离放射治疗-BT)。这种分类可用于选择使用的抗肿瘤剂。例如，已经观测到结合IGFR的抗体当与拓扑异构酶抑制剂一起给予时也许特别有效。给予抗肿瘤剂的剂量依赖于多种因素，包括例如药物类型、治疗的肿瘤的类型和严重性及给予药物的途径。然而，应强调本发明非限于任何特定剂量。在组合治疗中，抗体在开始用另一种物质治疗之前、期间或之后给予，26以及任意组合给予，即在开始抗肿瘤剂治疗之前和期间、之前和之后、期间和之后，或者之前、期间和之后给予。例如对于治疗肿瘤或瘤疾病，可以可以在开始放疗之前1-30天、优选3-20天、更优选5-12天给予。在本发明的一个优选实施方案中，化疗是在抗体治疗同时、之前或随后给予。在本发明中，可以使用任何合适的方法或途径给予本发明的抗体，任选共同给予抗肿瘤剂、受体拮抗剂或者其它药物成分。例如，根据本发明应用的抗肿瘤剂方案包括确信最适于治疗患者肿瘤病变的任何方案。不同的恶性肿瘤可需要使用特异性抗肿瘤抗体和特异性抗肿瘤剂，这将根据患者而决定。给予途径包括例如口服、静脉内给予、腹膜内给予、皮下给予或肌内给予。给予的抗肿瘤剂的剂量依赖于多种因素，包括例如抗肿瘤剂的类型、治疗的肿瘤的类型和严重性及给予抗肿瘤剂的途径。然而，应强调本发明非限于任何特定的给予方法或途径。本领域技术人员理解本发明的抗体以预防或治疗的目的用于哺乳动物中时，将以额外包含药物可接受的载体的组合物的形式给予。合适的药物可接受的载体包括例如如下一或多种载体水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。药物可接受的载体可进一步包含少量的辅助物质如增湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液，其增强结合蛋白的贮藏期限或功效。如本领域所熟知，可以配制为注射用组合物，以提供活性成分在给予哺乳动物后快速、持续或延缓d释放。本发明也包括抑制肿瘤生长和/或血管生成、或者治疗其它疾病的试剂盒，所述试剂盒包含治疗有效量的本发明抗体。优选人或人源化的抗体。该试剂盒可进一步含有任何合适的拮抗剂，例如参与肿瘤发生或血管生成的另一种生长因子受体(例如EGFR、VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk-l/KDR、IGFR、PDGFR、NGFR、FGFR等，如上述)。或者或另外，本发明的试剂盒可进一步包含抗肿瘤剂。本发明中合适的抗肿瘤剂的例子已经在本文中描述。本发明的试剂盒可进一步包含佐剂；其实例也已经在上文中描述。明的范围内，这为本领域所熟知。所述诊断方法包括含有本发明抗体的试剂盒。因此，本发明的受体结合抗体可用于在体内和体外进行的研究、诊断、预防或治疗方法中，这为本领域技术人员所熟知。当然，本领域技术人员理解并预期对本文揭示的本发明的原理可以进行改变，这种修改包括在本发明的范围内。文中提及的所有参考文献均以其全部内容并入作参考。实施例如下实施例进一步例证了本发明，但是不以任何方式限制本发明的范围。关于载体和质粒构建、编码多肽的基因插入这种载体和质粒中、质粒导入宿主细胞中及基因和基因产物的表达和确定的详细描述可得自众多的出版物，包括Sambrook，Jetal.,(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress;禾口Coligan,J,etal.(1994)CurrentProtocolsinImmunology,Wiley&Sons,并入作为参考。A維蘑体展示Ffl6文库^透雍乂拔附尸Z)GF及a拔体使用来自Dyax的大的天然人Fab噬菌体展示文库(含有3.7X101Q个克隆)选择抗mPDGFRa-Fc蛋白(R&DSystems(Minneapolis,MN)的抗体。将文库原、液(100!il)在20ml的2YTAG培养基中生长至对数期，用M13K07辅助噬菌体拯救，在2YTAK培养基(含有100吗/ml氨苄青霉素和50吗/ml卡那霉素的2YT)中在3(TC扩增过夜。噬菌体制备物于4%PEG、0.5MNaCl中沉淀。将噬菌体制备物重悬于含有240昭不相关的人IgG的1ml3。/。脱脂乳/PBS中，在37'C保温1小时，以阻断非特异性结合及与mPDGFRa蛋白的Fc-标记的结合。用包被于选择试管上的减少量(分别为50、10和2昭)的蛋白质对固定化的mPDGFRa-Fc进行三次选择循环。对于每次选择循环，首先将mPDGFRa-Fc-包被的MaxisorpStar试管(Nunc，Rosklide,DenMark)用3%脱脂乳/PBS在37'C阻断1小时，然后与所述噬菌体制备物在室温保温1小时。试管用PBST(含有0.1%Tween20的PBS)洗涤15次，随后用PBS洗涤15次。使用lml新鲜制备的100mM三乙胺(Sigma)溶液在室温洗脱结合的噬菌体10分钟。洗脱的噬菌体与10ml对数中期的TG1细胞在37'C静止保温30分钟及振荡保温30分钟。沉淀感染的TG1细胞，铺板于三个2YTAG平板上，在30'C保温过夜。将平板上生长的所有集落刮下置于3-5ml的2YTA培养基中，与甘油混合(终浓度10%)，分成等份，并贮藏于-8(TC。对于随后的选择循环，将来自先前选择循环的噬菌体原液(10(Hxl)扩增，并用于如上所述的选择中，使用减少量的mPDGFRa-Fc包被MaxisorpStar试管。为了估计输入噬菌体，在选择之前将1(^1噬菌体用于感染TG1细胞，然后在2YTAG平板上滴定。为了估计从选择中回收的噬菌体，将10nl的TG1感染的细胞与经上述选择程序洗脱的噬菌体在2YTAG平板上滴定。计算每次选择循环回收的产量，尽管包被的mPDGFRa-Fc减少，但是产量在连续的循环中增加(第一次循环1X1(T6%;第二次循环4X10-6%;第三次循环2X10'4%)。通过化/&4廢遂4,翁今界巡銜活丝游拔体在第二次和第三次选择循环之后，随机选取来自每次循环的190个克隆，通过噬菌体ELISA和FabELISA二者检测结合和阻断活性。简而言之，随机选取在第二次和第三次选择循环之后回收的各个TG1克隆，在37'C于96孔平板中生长。为了产生噬菌体，如上述用M13K07辅助噬菌体拯救细胞。为了产生可溶的Fab，将细胞在含有lmM的IPTG的2YTA培养基中保温。为了进行结合ELISA，将噬菌体制备物和含有可溶的Fab的细胞培养上清用1/6体积的18%脱脂乳/PBS在室温阻断1小时。然后将阻断的噬菌体制备物或细胞培养上清加入用mPDGFRa-Fc(l吗/ml，50pl，4。C，过夜)包被的96孔微滴定平板(Nimc)中，在室温保温l小时。在室温保温l小时之后，将该平板用PBST洗涤3次。为了进行噬菌体ELISA，将平板与-M13噬菌体抗体-HRP结合物(AmershamBiosciences)—起保温。为了进行FabELISA,将平板与抗-人-Fab抗体-HRP结合物(JacksonImmunoResearchLaboratory)—起保温。三次洗涤后，通过加入TMB过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg,MD)生色，使用微平板读数器(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)在450nm测量吸光度。也进行了用于结合1C11IgG的ELISA，以消除在文库筛选中鉴别为结合者(binder)的Fc特异性抗体。在mPDGFRoc结合测定中，在第二次选择后77%以上的挑取的克隆和在第三次选择后99%的回收的克隆是阳性的，提示选择程序的高效率。为了进行阻断ELISA，将5(^1的噬菌体制备物或Fab培养上清与固定量的mPDGFRot-Fc(0.5pg/ml)混合，在室温保温30分钟。然后将混合物转移至预先用rhPDGF-AA(0.5|ig/ml;R&DSystems,Minneapolis,MN)包被的96孔平板中，在室温保温l小时。为了定量结合的mPDGFRoc-Fc蛋白，将平板与兔抗人-Fc抗体-HRP结合物在室温保温1小时，随后洗涤三次并加入TMS过氧化物酶底物。结合的mPDGFRa-Fc蛋白通过在450nm读取吸光度而量化。阻断活性通过由抗人-Fc抗体-HRP结合物检测到的ELISA信号降低而表示。大约4.2%的结合mPDGFRa的克隆示出PDGF-AA阻断活性。基于阻断测定结果，最初选择14个克隆(包括非阻断结合者作为对照克隆(3F3))进行进一步研究。分离噬菌粒DNA，通过双脱氧核苷酸测序法确定DNA序列。使用AndrewCR.Martin'sBioinformaticsGroup的生物信息网站(Vww.bioinf.org.uk)和MagAlignofDNAstar对VH和VL基因进行分类和排列。透揮游恭wPZ)aF及a拔体游分折在14个克隆中，显示出9种独特的抗体(表l)。除了1C10和1F2之外，发现无相同的VH或VL。令人感兴趣地，4个具有较强阻断活性的抗体具有不完整的轻链。克隆1F2和1F9具有符合读框的vl缺失(前导肽序列，随后Cl序列)。克隆1C—10和1F2共有相同的Vh基因。然而，由于1C10的VL编码序列包括终止密码子，由此Cl不被表达。克隆3G7包括位于Vl基因的5'末端的终止密码子。1C10和3G7均表现强阻断活性。Fab表达和结合活性看起来非常低，但是可以说明抗人-Fab二级试剂的不良结合。表l一来自Fab噬菌体展示文库的抗-mPDGFRa抗体<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>Fab的核苷酸和氨基酸序列如下1E10VH结构域SEQIDNO:51和52;1E10VL结构域SEQIDNO:53和54;1A12VH结构域SEQIDNO:55和56;1A12V^结构域SEQIDNO:57和58;3B2VH结构域SEQIDNO:59和60;3B2VL结构域SEQIDNO:61和62;1C10VH结构域SEQIDNO:63和64;1C10VL结构域SEQIDNO:65和66;3G7VH结构域SEQIDNO:67和68;3G7结构域核苷酸序列SEQIDNO:69;3G7Vt结构域QAW;1F9VH结构域SEQIDNO:70和71;1F9VL结构域SEQIDNO:72和73;1F2VH结构域SEQIDNO:74和75;1F2Vt结构域SEQIDNO:76和77。图15示出了每个结构域(包括VL的截短或者3G7、1F9和1F2的缺失)及CDR区域的位置。将6个克隆的Fab片段在大肠杆菌HB2151宿主细胞中表达，通过亲和性层析蛋白G柱纯化。各个选择的克隆的噬菌粒用于转化非阻抑大肠杆菌宿主HB2151细胞。HB2151中Fab片段的表达通过将细胞在含有1mM的IPTG的2YTA培养基中在3(TC培养而诱导。细胞的周质提取物如Lu(x)所述制备。可溶的Fab蛋白使用蛋白质G柱根据厂商(AmershamBiosciences)指导进行纯化。为了检查制备物的纯度和分子量，将纯化的抗体在NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中电泳，并通过SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)溶液染色进行观测。纯化的结合蛋白通过SDS-PAGE分析(图2)。图2A中示出具有完整轻链的Fab的分子量为大约50,000。相反，与标准对照Fab相比(图2B)，1F2和1F9的未还原的片段产生小的条带(-DTT:MF37，500)。在还原条件下(+DTT)，显示两个条带，上方的条带与正常大小的VH-CH1片段一致，下方的条带与具有CL片段(M^12,500)但是缺少可变结构域的轻链一致。巡銜从数量上对比6个抗mPDGFRot克隆的可溶Fab片段的抗原结合效力及阻断mPDGFRoc/PDGF-AA相互作用中的能力。在结合测定中，首先将Fab在预先用mPDGFRa/Fc融合蛋白(l吗/ml)包被的96孔平板中在室温保温1小时，随后与兔抗-抗-人-Fab抗体HRP结合物保温1小时。然后通过加入过氧化物酶底物量化平板结合的抗体-HRP。与最初的筛选结果(表1)一致，1F2Fab比所有其它Fab蛋白更有效地结合mPDGFRa(图3A)。各种抗-mPDGFRa抗体的结合动力学通过表面等离子共振技术确定，使用BIAcore3000生物传感器，并使用BIA评估程序2.0(Biacore，Inc.,Uppsala,Sweden)进行评估。亲和性常数i^以解离率(Aoff)/结合率(A:on)的比率计算。报道的数值是至少两次(对于Fab)和三次(对于IgG)测量的平均值土S.E.(表2)。与结合测定一致，sVD抗体1F2具有大约0.5nM的更高亲和性(《》，比选择的正常Fab(lE10)高23倍以上。在表2中，1F2-2HFab是含有第二个相同VH结构域的经工程化的二价Fab，表达为与CL的融合体。将所述二价的Fab在大肠杆菌中表达并通过蛋白G层析纯化。对纯化的lF2-2HFab进行SDS-PAGE分析显示一个大约50kD的单一蛋白质条带，与标准Fab片段相似(图5)。该二价Fab的亲和性为79.5pM，相比之下单价1F2Fab的亲和性为418pM，示出亲和性增强5.2倍(表2)。表2—抗-mPDGFRa抗体与<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>在阻断测定中，将不同量的抗体与固定量的mPDGFRa/Fc融合体在溶液中保温30分钟，然后将该混合物转移至用rhPDGF-AA包被的96孔平板中保温1小时。结合的mPDGFRa的数量通过量化结合的抗-人-Fc-Ab而确定。所述1F2Fab强力阻断mPDGFRa/PDGF-AA相互作用(图3B)，IC50值为12nM，对比之下，1F9、1E10和1A11的IC50值分别为57、140和220nM。在等摩尔基础上，二价Fab在结合mPDGFRa及阻断受体/配体相互作用中均示出中等增强的活性(图6)。全长Jg(^^"廣、；^^^7^^众将选择的克隆的Fab转变为全长IgG，这通过将VH和VL结构域分别克隆进重链表达载体pDFc和轻链表达载体pLC沖而实现。pDFc在前导肽序列与CH1之间具有克隆位点/f/"dIII和WzeI。pLC/c在前导肽与CL之间具有克隆位点III和Bw'『I。简而言之，将编码VH和VL的基因通过逆转录-PCR从噬菌粒DNA中扩增，并克隆进其各自的表达载体中。然后，将重链和轻链表达载体(VH-pDFc和VL-pLC"共转染进COS-7细胞中，如前所述瞬时表达。在转染后48小时和96小时收集并集合细胞培养基。通过亲和性层析法，使用蛋白-A柱根据厂商(AmershamBiosciences)指导从细胞培养上清中纯化抗体。在证实IgG的功能之后，将Vh和VL基因的表达对克隆进单一表达载体中，并转染进COS-7细胞中。如上所述进行抗体纯化。从仅含有一个VH的1F2Ig中产生三个IgG样构建体(见图7)，包括具有4个VH的四价1F2-2HIgG(A)，及具有与CH或CL表达为融合体的1F2VH的二价1F2(B和C)。表达轻链和重链的质粒用于共转染COS-7细胞，以进行瞬时表达。使用细胞培养上清通过ELISA监测抗体的表达水平。1F2-2H的表达始终低于两个二价1F2抗体，是二价1F2抗体的大约四分之一。通过亲和层析法使用蛋白A柱纯化来自细胞培养上清的抗体。克隆lE10是具有正常抗体成分的阻断者(blocker)，将其也转变为全长IgG。首先将1E10的Vh和VL基因分别克隆进pDFc和pLC一。如上述，在进行DNA测序及证实1E10IgG结合活性之后，将表达的Vh/Vl対克隆进单一表达载体中，然后用于转染C0S-7细胞，随后进行抗体纯化。通过SDS-PAGE分析纯化的抗体以确定制备物的纯度和分子量。二价抗体1F2-CH/CL和1F2-CL/CH分子量MW为125，000，其迁移速度快于正常IgG(lE10和2B4;图8左侧)。当在电泳之前用DTT处理抗体时(图8右侧)，重链和轻链解离。抗体1F2-CH/CL具有与重链相关的靠近上方的条带，与1E10和2B4相似，快速迁移的较低的条带具有接近预期的迁移性(M^12，500，仅CL)。另一方面，抗体1F2-CL/CH示出较低的条带，表示轻链的迁移性与1E10和2B4相似，上方的条带仅与CH1-Fc多肽(MF37,500)相关。全长贫-mi^G7^a贫伴游潜^与巡箭话丝通过ELISA对比所有三个纯化的1F2变体抗体1F2-2HIgG、1F2-CH/CL和1F2-CL/CH与抗体1E10结合mPDGFRa的亲和性。将各种量的抗体在用mPDGFRa/Fc包被的ELISA平板中保温，然后通过抗-人-k抗体HRP结合物检测mPDGFRa结合的抗体。ELISA结果表明尽管1F2-2HIgG具有四个结合位点，但是1F2-2H的结合活性仍低于两个二价1F2IgGs(1F2-CH/CL和1F2-CL/CH)大约8倍(图9A)。另一方面，通过ELISA(图9A)和BlAcore分析(表2)示出这两个二价1F2(1F2-CH/CL和1F2-CL/CH)具有极其相似的结合亲和性。二价1F2IgG的亲和性较其亲代1F2Fab增加大约一个数量级，1E10IgG较其Fab增加20倍(表2)。总之，这两个二价1F2IgG与mPDGFRa的结合亲和性比1E10IgG高出大约一个数量级(图9A和表2)。也进行了定量阻断测定以评估抗-mPDGFRa抗体。如上所述，将各种量的抗体与固定量的mPDGFRa/Fc融合体于溶液中保温30分钟，然后将此混合物转移至用rhPDGF-AA包被的96孔平板中保温1小时。然后通过量化结合的抗-人-Fc-Ab而确定结合的mPDGFRa的数量。与结合测定数据—致，二价1F2-CH/CL和1F2-CL/CH与1F2-2HIgG禾Q1E10IgG相比是更好的阻断者，1F2-CH/CL、1F2-CL/CH、1F2-2HIgG和1E10IgG的IC50值分别为3.2、2.7、17和9.6nM(图9B)。双錄_#丝拔沐抗-Flk-l抗体2B4也分离自DyaxFab噬菌体文库，使用基本如上述相同的方法进行，不同之处在于使用mVEGFR2-Fc融合蛋白包被MaxisorpStar试管。2B4的Fab特异于Flk-l并阻断Flk-1/VEGF,65相互作用。Fab2B4的Vh和VL结构域分别如SEQIDNO:79和81所示。图15示出每个结构域及CDR区域的位置。如上述将2B4Fab转变为全长IgGl。2B4Fab和IgG的结合动力学通过BlAcore分析确定。2B4Fab和IgG与mVEGFR2的结合亲和性分别为6.7±3.0nM和0.39±0.1nM。2B4IgG阻断VEGFR2/VEGF165相互作用，IC50值为大约3.5nM(图13B)。基f翁称鍵游双錄，丝拔体r贫-柳i^GFI2ax贫尸"-"游称虜-基于结构域的双特异性抗体以两种方式构建scFv-形式和Fab-形式(图IO，A和B)。在scFv-形式中，首先使用重叠PCR装配编码2B4的VH和VL基因的PCR片段。2B4VL的COOH末端与2B4VH的NH2末端通过5-氨基酸接头(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly，得自CL结构域的N末端)连接(图IOA)。所得基因编码2B4VL-VH，将其通过历"^////^/^/连接克隆进？00载体中，以表达scFv2B4-CH融合体(由2B4VL-2B4VH-CH1-CH2-CH3组成)。然后将scFv2B4-CH表达载体与如上述的1F2VH-CL表达载体配对，通过共转染COS-7细胞以瞬时表达。在Fab-形式中，首先使用重叠PCR装配1F2的Vh基因和2B4的VL基因。在这种融合中，1F2VH的COOH末端与2B4VL的氨基末端通过5-氨基酸接头从CH的5'末端连接。然后将1F2VH-2B4VL编码基因通过所"d////Bw'『/位点克隆进载体pLCK中以表达1F2VH-2B4VL-CL-融合蛋白。将2B4VH基因克隆进pDFc载体中以表达VH。表达轻链和重链的质粒如图IOB所示配对，用于共转染COS-7细胞以瞬时表达。在通过ELISA检测所述克隆的双重结合活性之后，将Ig表达构建体组合进单一表达载体中，然后使用转染的COS-7细胞瞬时表达设计的IgG。如上述从细胞培养上清中纯化抗体。基f薪称凝效双錄,丝拔体游表这^7錄众1F2/scFv2B4和1F2-2B4抗体通过在COS-7细胞中转染和瞬时表达而产生(100-200ml细胞培养物)。使用蛋白A柱通过亲和性层析从细胞培养上清中纯化抗体。纯化的双特异性抗体(lF2/scFv2B4禾Q1F2-2B4)及其亲代抗体1F2和2B4通过SDS-PAGE分析(图8)。与2B4IgG相比，未处理的双特异性抗体(-DTT)的较低迁移性与其高分子量(175，000)相关，二价1F2-CH/CL迁移在125，0O0分子量位置。在用DTT处理后，这四种抗体的每一种抗体的这两个成分均独立分辨。与标准IgG(2B4)对比，双特异性抗体1F2/scFv2B4(VH-CL融合体)的较低条带相应于标准IgG轻链。上方的条带与scFv-重链融合蛋白(旨62,500)相关。另一方面，1F2-2B4上方的条带相应于标准IgG(2B4)的重链，较低的条带在除了VH-轻链融合体之外的位置观测到(爆37,500)。基f结称鍵游及錄^丝拔沐游双置錄弄性在交联测定中，首先将双特异性1F2-2B4抗体及单特异性1F2-CH/CL和2B4抗体与mPDGFRct或mVEGFR2在溶液中保温，然后移至用第二受体(分别为mVEGFR2或mPDGFRoO包被的微滴定平板中，随后与第一受体的生物素标记的多克隆抗体保温。仅BsAb而不是亲代单特异性2B4IgG和1F2-CH/CL能交联连接这两个靶受体。基于结构域的双特异性抗体的抗原结合效力针对固定化的mPDGFRoc和Flk-l确定。ELISA示出双特异性抗体1F2/scFv2B4和1F2-2B4结合mPDGFRa和Flk-l，但不是与亲代抗体1F2和2B4同样有效(图12)。然而，在这两种情况中，1F2-2B4抗体的结合比1F2/scFv2B4略为更有效。正如所预期的，Flk-l-特异性抗体2B4不结合mPDGFRa(图12A)，mPDGFRa特异性抗体1F2也不结合Flk-l(图12B)。双特异性抗体与mPDGFRa和Flk-l的结合动力学使用BIAcore装置通过表面离子共振技术确定(表3)。与通过ELISA观测到的结果一致，与1F2/scFv2B4抗体相比，1F2-2B4抗体与mPDGFRa和Flk-l的亲和性均较高。表3—基于s-VD双特异性抗体的结合动力学<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>图13示出这两种双特异性抗体均抑制mPDGFRoc结合固定化的PDGF-AA(图13A)，估计对于1F2/scFv2B4和1F2-2B4的IC50分别为9.9nM和25.3nM。所述抗体也阻断Flk-l结合固定化的VEGF,65(图13B)，IC50值分别为9.5nM和19.5nM。正如所预期地，2B4对于mPDGFRa/PDGF-AA相互作用无影响，而1F2对于Flk-1/VEGF^相互作用无影响。尽管与各自的单特异性二价分子相比，双特异性抗体的mPDGFoc结合和mVEGFR2结合的亲和性较低，但是当检査1F2-CH/CL和2B4IgG(表3)结合eEnd.l细胞(表达mPDGFRa和mVEGFR2二者的细胞)上的在细胞表面表达的受体时，BsAb示出比任一亲代单特异性二价抗体更高的效力。细胞上的平均荧光强度(MFI)对于1F2-CH/CL(mPDGFRa结合)、2B4IgG(mVEGFR2结合)和1F2-2B4IgG(mPDGFRa和mVEGFR2结合)分别为15.7、31禾Q36.9。wFEGF及2浙wPDGF及效紀沐诱导游教话游滞煮/mVEGFR2和mPDGFRa的表达通过FACS分析在eEnd.l细胞中证实。将细胞与2B4IgG、1F2-CH/CL或1F2-2B4IgG(10吗/ml)在4""C保温1小时，随后与PE标记的山羊抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearchLab.)保温1小日寸，在GuavaEasycyteSystem(GuavaTechnologies,Inc.Hayward，CA)上分析。为了检验受体磷酸化，将eEnd.l细胞铺板于6cm培养皿上，生长至70-80%铺满率，之后将细胞在PBS中洗涤两次，在无血清培养基中培养过夜。首先将细胞与各种抗体在37'C保温30分钟，随后用VEGF或PDGF-AA在37。C刺激15分钟。细胞在细胞裂解液(50mMTris-HCl，pH7.4,150mMNaCl，1%TritonX-100，1mMEDTA，1mM苯甲基磺酰氟，0.5mMNa3V04，l吗/ml亮肽素，lpg/ml胃蛋白酶抑制剂及1吗/ml抑肽酶)中裂解1小时，随后将裂解物在12,000rpm在4°C离心10分钟。使用抗國mPDGFRa(eBioscience，SanDiego,CA)或者抗誦mVEGFR2抗体(SantaCruzBiotech,SantaCruz,CA)从细胞裂解物上清中沉淀受体，随后加入20^1的ProA/G-琼脂糖珠(SantaCruzBiotech)。沉淀的受体蛋白在4-12%NupageBis-Tris凝胶(Invitrogen)上分辨，并转移至聚偏氟乙烯膜上。使用抗-磷酸-酪氨酸抗体-HRP结合物(SantaCruzBiotech)在印迹上检测磷酸-mVEGFR2和磷酸-mPDGFRa。使用mPDGFRa或mVEGFR2的抗体(均得自SantaCruzBiotech)测定加样于凝胶上的总受体蛋白。如图14所示，BsAb既抑制PDGF-剌激的mPDGFRa和mVEGFR2受体磷酸化也抑制VEGF-刺激的mPDGFRa和mVEGFR2受体磷酸化，而单特异性亲代抗体仅阻断由其关联配体刺激的单一受体的激活。作为对照，抗-EGFR抗体C225对于配体刺激的任一受体的激活无任何作用。权利要求1.一种包含两个第一多肽和两个第二多肽的复合物的抗原结合蛋白，每个第一多肽均具有位于免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL结构域)的N末端的第一个抗原结合位点，所述CL结构域能与免疫球蛋白重链第一个恒定结构域(CH1结构域)稳定缔合，每个第二多肽均具有位于CH1结构域的N末端的第二个抗原结合位点，所述CH1结构域后接能稳定自身缔合的一或多个重链恒定结构域；其中至少一个所述第一个抗原结合位点和所述第二个抗原结合位点是单一可变结构域(sVD)。2.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述第一个和第二个抗原结合位点均是单一可变结构域(sVDs)。3.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述第一个和第二个抗原结合位点中的一个位点是单一可变结构域(sVD)，所述第一个和第二个抗原结合位点中的另一个位点是单链Fv(scFv)。4.一种包含两个第一多肽和两个第二多肽的复合物的抗原结合蛋白，每个第一多肽均包含由可变结构域和恒定结构域组成的免疫球蛋白重链，每个第二多肽均包含由可变结构域和恒定结构域组成的免疫球蛋白轻链，其中这两个第一多肽与这两个第二多肽稳定缔合，形成免疫球蛋白样分子，其中所述免疫球蛋白重链的可变结构域与所述免疫球蛋白轻链的可变结构域稳定缔合，形成第一个抗原结合位点，其中所述第一或第二多肽或者这两种多肽进一步包含在N末端或C末端的第二个单链可变结构域(sVD)抗原结合位点。5.权利要求l-4任一项的抗原结合位点，其中所述第一个抗原结合位点和所述第二个抗原结合位点具有不同的特异性。6.权利要求5的抗原结合位点，其中所述不同的特异性是针对位于不同抗原上的表位。7.权利要求5的抗原结合位点，其中所述不同的特异性是针对位于相同抗原上的表位。8.权利要求1和2任一项的抗原结合蛋白，其中所述第一个抗原结合位点与第二个抗原结合位点具有相同特异性。9.权利要求l-4任一项的抗原结合蛋白，其中所述恒定结构域是人恒定结构域。10.权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白，其中所述单一可变结构域是人的。11.权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白，其结合Fc受体。12.权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白，其产生补体依赖性细胞毒性(CDC)。13.权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白，其产生抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCQ。14.权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白，其与抗肿瘤剂连接。15.权利要求l-4任一项的抗原结合蛋白，其与可检测信号的产生剂连接。16.权利要求l-4任一项的抗原结合蛋白，其中所述第一个和第二个抗原结合位点中的至少一个位点特异于受体酪氨酸激酶(RTK)。17.权利要求16的抗原结合蛋白，其阻断配体与受体酪氨酸激酶的结合。18.权利要求16的抗原结合蛋白，其中和受体酪氨酸激酶的激活。19.权利要求16的抗原结合蛋白，其抑制通过受体酪氨酸激酶的信号转导。20.权利要求16的抗原结合蛋白，其中所述受体酪氨酸激酶是人的。21.权利要求16的抗原结合蛋白，其中所述受体酪氨酸激酶选自PDGFRa、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、EGFR、HER2、IGFR、FGFR、NGFR、RON、Tek和Tie2组成的组。22.权利要求16的抗原结合蛋白，其中所述第一个和第二个抗原结合位点中的一个位点特异于PDGFRa，所述第一个和第二个抗原结合位点中的另一位点特异于VEGFR2。23.权利要求16的抗原结合蛋白，其中所述第一个和第二个抗原结合位点中的一个位点特异于VEGFR1，所述第一个和第二个抗原结合位点中的另一位点特异于VEGFR2。24.权利要求16的抗原结合蛋白，其中所述第一个和第二个抗原结合位点中的一个位点特异于IGFR，所述第一个和第二个抗原结合位点中的另一位点特异于EGFR或HER2。25.—种中和受体酪氨酸激酶激活的方法，包括用足以中和受体激活的量的特异于所述受体酪氨酸激酶的权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白处理细胞。26.—种抑制血管发生的方法，包括用足以中和受体激活的量的权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白处理哺乳动物。27.—种降低肿瘤生长的方法，包括用足以降低肿瘤生长的量的权利要求1-4任一项的抗原结合蛋白处理哺乳动物。28.权利要求26和27任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白结合PDGFRa及结合VEGFR2，并抑制配体诱导的PDGFRa激活和配体诱导的VEGFR2激活。29.权利要求26和27任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白结合VEGFRl及结合VEGFR2，并抑制配体诱导的VEGFRl激活和配体诱导的VEGFR2激活。30.权利要求27的方法，其中所述抗原结合蛋白结合EGFR及结合IGFR，并抑制配体诱导的EGFR激活和配体诱导的IGFR激活。31.权利要求27的方法，其中所述抗原结合蛋白结合HER2及结合IGFR，并抑制配体诱导的HER2激活和配体诱导的IGFR激活。32.权利要求27的方法，其进一步包括给予有效量的抗肿瘤剂。33.—种产生抗原结合蛋白的方法，包括-a)在宿主细胞中以足以使得所述多肽表达和所述抗体形成的时间和方式共表达如下构建体一种重组的DNA构建体，其编码具有位于免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL结构域)的N末端的第一个抗原结合位点的第一多肽，所述CL结构域能稳定缔合免疫球蛋白重链第一个恒定结构域(CHl结构域)，及一种重组的DNA构建体，其编码具有位于CH1结构域的N末端的第二个抗原结合位点的第二多肽，所述Ch1结构域后接能稳定自身缔合的一或多个重链恒定结构域，其中所述第一个抗原结合位点和所述第二个抗原结合位点中的至少一个位点是单一可变结构域(sVD);及b)回收所述抗原结合蛋白。34.权利要求33的方法，其中所述构建体位于相同的DNA表达载体上。35.权利要求33的方法，其中所述构建体位于不同的DNA表达载体上。36.权利要求33的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞或者哺乳动物细胞。37.权利要求33的方法，其中所述抗体从所述宿主细胞中分泌。全文摘要本发明涉及新的抗体，其包含单结构域结合位点。所述抗体可以是二价抗体或者多价抗体，且可以是双特异性的。本发明进一步涉及结合mPDGFRα的单特异性和双特异性的抗体。所述抗体可以单独或者组合抗血管生成药物和抗肿瘤药物一起给药。文档编号A61K39/00GK101432015SQ200780011126公开日2009年5月13日申请日期2007年2月15日优先权日2006年2月15日发明者朱祯平申请人:英克隆系统公司