专利名称：一种构筑肝靶向载药聚合物胶束的方法
技术领域：
本发明属于化学药物技术领域，具体涉及一种构筑肝靶向载药聚合物 胶束的方法，即通过共价键合有小分子药物和糖的两亲性无规共聚物在水 相中的自组装构筑肝靶向载药聚合物胶束的方法。
背景技术：
近年来，构筑一些功能化的适用于生物药物领域的聚合物胶束已经成 为一个热门的研究领域。将聚合物胶束用作药物的传送体系可以延长药物 在血浆中的循环，减少给药次数，提高药物的生物利用率等。其中CN1524581公开了一种甲基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物胶束载药体系。在该 专利中作者将药物与嵌段共聚物溶于一种极性溶剂中，通过微乳化-溶剂蒸 发法得到胶束载药体系。CN1197396也公开了一种两亲性嵌段共聚物胶束 药物释放体系，其中亲水性嵌段为聚(烯化氧)，疏水性嵌段为聚丙交酯等。 在该专利中疏水性药物通过搅拌、加热、超声等物理作用掺入到嵌段共聚 物胶束中组成胶束药物体系。为了进一步提高聚合物胶束的靶向性， 一些靶向配体比如糖、叶酸、 RGD、抗体等被引入到聚合物胶束的表面使得这些胶束可以特异性地识别 某些细胞或组织，从而实现定点给药。如P. A. Bertin， J. M. Gibbs， C. K. R Shen， C. S. Thaxton， W. A. Russin, C. A. Mirkin and S. T. Nguyen的文章 "Multifunctional polymeric nanoparticles from diverse bioactive agents" (《Journal of the American Chemical Society》2006,128,4168-4169)报道了一 种表面可以键合有DNA以及靶向肿瘤抗体的含有抗肿瘤药物的聚合物胶 束用做药物传送体系。CN1919181也公开了一种两亲性靶向聚合物胶束的 制备方法，其中以疏水性组分生物可降解聚合物和亲水性组分聚乙烯亚胺 共聚物为载体，采用溶剂挥发法将药物包裹在胶束中，靶向分子叶酸借助 氨基接枝到胶束表面。在以往的这些报道中，人们通常采用两亲性嵌段共聚物来构筑聚合物 胶束，而且小分子药物多数是通过物理包埋作用包裹在胶束中。为了进一 步延长药物在血浆中的循环以及更好地控制药物的释放，将小分子药物共3价键合到聚合物上就成为一个很好的选择。但是，这种共价键合有药物的 嵌段共聚物的合成往往需要比较复杂的合成路线，而且往往需要一些特殊 的实验条件以及复杂的实验操作等。而无规共聚物的制备往往可以在常规 的实验条件下便利实现。因此通过可以便利制备的共价键合有靶向配体和 小分子药物的两亲性无规共聚物的自组装构筑靶向载药聚合物胶束作为潜 在的药物传送体系是对以往构筑功能化聚合物胶束方法的一个很大突破。发明内容本发明提供了一种合成与自组装构筑制备含有肝靶向配体糖和小分子 药物的两亲性无规共聚物的肝靶向载药聚合物胶束的简便方法。 一种构筑肝靶向载药聚合物胶束的方法，包括-(1) 可聚合的药物单体和糖单体的合成在有机溶剂中，枯草杆菌碱性蛋白酶、南极假丝酵母脂肪酶或者脂肪酶Lipase AY30催化小分子药物与脂肪族二酸二乙烯酯反应合成可聚合的药物单体，枯草杆菌碱性蛋白 酶催化糖与脂肪族二酸二乙烯酯反应合成可聚合的糖单体，并分离提纯其产物；(2) 含有糖和小分子药物的两亲性无规共聚物的合成在氮气保护下，将 步骤(1)所得的可聚合药物单体和可聚合糖单体用引发剂引发聚合反 应得到合适粘度的聚合物，通过选择合适的沉淀剂与可溶解该聚合物 的共溶剂，多次重复沉淀，并将沉淀物真空干燥得到两亲性无规共聚 物；(3) 肝耙向载药聚合物胶束的制备将步骤(2)中制备的两亲性无规共 聚物溶解在合适的共溶剂中，然后在搅拌、加热或者超声下向其中加 入超纯水，之后将该溶液对水透析，将透析袋内的悬浮液离心、冷冻 干燥得到粉末状载药聚合物胶束。所述的有机溶剂为吡啶、丙酮或者甲苯。所述的小分子药物为阿昔洛韦、利巴韦林等抗肝炎药物，阿糖胞苷、 阿霉素等抗肿瘤药物，普萘洛尔等p-阻断剂类药物中的一种。所述的脂肪族二酸二乙烯酯为丙二酸二乙烯酯、丁二酸二乙烯酯、己 二酸二乙烯酯、壬二酸二乙烯酯、癸二酸二乙烯酯、苹果酸二乙烯酯或反 丁烯二酸二乙烯酯。所述的糖为半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖等单糖，乳糖、麦芽糖、 棉籽糖、蔗糖等寡糖，以及各种糖的衍生物、相应的糖醇中的一种或多种 糖分子的组合物等。所述的引发剂为聚合反应中的常规引发剂，例如偶氮二异丁腈。所述的沉淀剂为能溶解糖单体和药物单体，但不能溶解得到的共聚物 的有机溶剂，如正己垸、二氧六环、四氢呋喃、甲醇、丙酮、甲苯、氯仿、 二氯甲垸、乙酸乙酯等溶剂以及上述两种或多种溶剂的混合物。所述的共溶剂为既可溶解糖单体和药物单体又可溶解共聚物的有机溶 剂，如乙二醇、丙三醇、乙二胺、氨基乙醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等 溶剂以及上述两种或多种溶剂的混合物。聚合物胶束的肝靶向行为研究将聚合物胶束与荧光素标记的花生凝 集素在缓冲溶液中培养，然后离心并将离心后的产物多次水洗除去未绑定 的凝集素，最后将其分散在水中用激光共聚焦扫描显微镜观察证明糖基团 在胶束表面的存在。将聚合物胶束分别加入到不同的肿瘤细胞中，在37摄 氏度下培养，然后用酶标仪等测定聚合物胶束对不同肿瘤细胞生存能力的 影响，考察胶束的肝靶向行为。本发明方法首先通过将酶催化选择性酯交换反应与自由基共聚反应相 结合，两步便利合成共价键合有糖和小分子药物的两亲性无规共聚物，然 后将这些无规共聚物在水相中自组装制备肝靶向载药聚合物胶束。本方法 合成路线简洁，不需要保护/去保护步骤，反应条件温和，操作简单易行， 并可以很好地控制得到的胶束的载药量以及靶向配体的含量，适合于构筑 各种不同耙向性的聚合物胶束。本发明相对于已经报道的靶向性聚合物胶束的制备具有以下优点1) 利用两亲性无规共聚物构筑肝靶向载药聚合物胶束，其中聚合物的制备条 件温和，步骤简单，操作易行；2)可以通过控制共聚单体的类型以及投料 比得到一系列具有不同载药量和靶向性的功能聚合物胶束。
图1为本发明制备方法过程示意图。图2为本发明实施例7中乳糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束的 透射电子显微镜图。图3为本发明实施例7中的通过动态光散射测定的乳糖功能化的含有 利巴韦林的聚合物胶束的尺寸分布图。图4为本发明实施例8中乳糖功能化的含有阿糖胞苷的聚合物胶束的 透射电子显微镜图。图5为本发明实施例9中几种含有利巴韦林的聚合物胶束对人体肝肿 瘤细胞(hepG2细胞)的生长抑制活性。□代表PBS磷酸缓冲溶液；■代表不含糖的利巴韦利的聚合物胶束；*代表葡萄糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束；▲代表半乳糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束；T代表乳糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束。
具体实施方式
以下实施例有利于理解本发明，但不限于本发明的内容。 实施例l:可聚合利巴韦林己二酸乙烯酯的酶促合成将利巴韦林(1.0 g)、己二酸二乙烯酯(3.2 g)、南极假丝酵母脂肪酶 (0.2 g)以及丙酮(80 mL)加入到250 mL锥形瓶中，然后将其放入50 摄氏度的恒温振荡培养箱中，在250转每分钟下反应12小时。反应结束后， 过滤除去酶并减压蒸馏除去有机溶剂，粗产物用甲醇溶解加等量硅胶拌样， 产物经柱层析分离提纯。得到的产物利巴韦林己二酸乙烯酯为白色固体， 产率78%。该产物的核磁共振、红外光谱、质谱、元素分析测试结果如下'好層及f50舰故，爐SO-^ <J "卿& 7坊，7." ^， 7场， 7.2/ Wrf， 2丑,/ = <U /fe, / = "J好z人5.卵"2私/ = 6.4孖力，5.67 " 1&, / =fl^， 5J7 " 7好，/ = 5.S Z/z人4朋"J好,J = ".0丑力，4" " 7丑，/ = "力刷，r挑，鄉4做2坊，" 2好，/ = 刷，233 " W, / ="C層及(i253f扱,Z)MSO-^ 3 "汰7， 26汰& 風0，"丄7，"2, 7", 7汰9, ".2,似33.2, 2", 2 .力 /及(X5r， c挑力J"9， J"/, "77，7729， 7柳； 甜-MS 一力"7 /M+7Va/，.ir—es C, 5.57/ 7V,实施例2:可聚合阿糖胞苷己二酸乙烯酯的酶促合成按实施例1所述的方法，不同的是所采用的药物为抗肿瘤药物阿糖胞 苷，所采用的酶为枯草杆菌蛋白酶，所采用的有机溶剂为吡啶。得到的产 物阿糖胞苷己二酸乙烯酯为淡黄色固体，产率46%。该产物的核磁共振、红外光谱、质谱测试结果如下AiV細(DMSO-^ <5 7.47 " 7好,/ = 7.4说人7.22爛风/ ="扱, / = ".5 H力，7." J好)，7.ft2 6.做"J好，/ =义7及"，5.67 " 7H,/ = 7.4 H力，5.55 r附，2好人4卵W， J好,/ = ".0 J^), 465 W， 7好，/ = 好", ￥.27 f附，2好」，4.20 r附，7好)，J.卯r附，7好)，丄S7 (附，7好人f附，2及)，236 f附, 卿丄57—，鄉"CiV臓(DMSO画^ 3 m/, 27汰7,嵌/, "5.6, "丄7, ， 9U， 6.7， S2.J, 77.2, 7"， 6",化5, 2", 2 .力 // r卿c柳力W9， 52", /柳，5W, 76; 甜-MS 一力■ /M+7V"/.实施例3:可聚合普奈洛尔己二酸乙烯酯的酶促合成按实施例1所述的方法，不同的是所采用的药物为p-阻断剂类药物普奈洛尔，所采用的酶为LipaseAY30，所采用的有机溶剂为甲苯。得到的产物普奈洛尔己二酸乙烯酯为淡黄色固体，产率68%。 该产物的核磁共振、红外光谱、质谱测试结果如下 '好7VM及fCDay <5 " Jg / = 7.5 ^j:人7.朋^Z， 1fT， / = 7.5 ^z人 r附,3好人7J6"/好人7.^^/，/^ /=6.2^:,/=".7好^，6.&2(</,风/ = 7.5刷，—， 7场，"6 "很,/ = 2"刷，455 " /好, / = 6.2〃z)， A" 2/0，义卯2好人()w， 2.35-24/ f附，4j^， r附，4〃义丄"""C層及f腹SO-fl^ <5 77汰5, i5", W, "4.7， "7.7， "6.7，"6力，"5.S, 725.5,"么2，"汰9, M5J, 97.9, 72J， 6&i, 4&9， 47.6, 2" 2", 2 J， 2U，'/及卿r, c附力275《"外,/"6，"卯，792, 777; 一力冰"/M+H/.实施例4:可聚合半乳糖癸二酸乙烯酯的酶促合成按实施例1所述的方法，不同的是所采用的底物为肝靶向配体半乳糖 和癸二酸二乙烯酯，所采用的酶为枯草杆菌碱性蛋白酶(l.Og)，所采用的 有机溶剂为吡啶。得到的产物半乳糖癸二酸乙烯酯为淡黄色固体，产率 45%。该产物的核磁共振和红外光谱测试结果如下^TV遭pMSO-W <5 7.", 6.57, 6.20, 5.", 4",《卵，"7, "5, 4.5《4"， 4.26, 4.做，义卯,1W， 3.59,152， 7.56，丄^/"CiVAtt (DMSO-r/y 3 276.9, 77汰5>，"丄7,W./, Z .5, 72.《 7汰0,卯.& 6久5， 69.2, ".6， ".5, J6J, W.5, ".0, 24.5，.J及(KSr, c附力W卵,2W/，i755， W7, 〃55, 2做汰实施例5:可聚合乳糖癸二酸乙烯酯的酶促合成按实施例1所述的方法，不同的是所采用的底物为肝靶向配体乳糖和 癸二酸二乙烯酯，所采用的酶为枯草杆菌碱性蛋白酶，所采用的有机溶剂 为吡啶。得到的产物乳糖癸二酸乙稀酯为淡黄色固体，产率32%。该产物的核磁共振和红外光谱测试结果如下W層及(DMSO謹^ J "7, "7, 0《5.27, 偶线《45-^^2， 4.53， 4.25國 7, 1S2， ^ZM2 , 3.77, 2.97, 2.43， 230，丄53， 7.25;"CiVA OWfSO-rffi) 3 J72.《J7汰0，"汰& M丄/, 97.5， 96.2， 汰& S汰3， 7A3， 742, 74.0, 72.《7丄9, 77.7, 7汰& 6久& 6久《67.7, 6U， 6汰化5久& ".6, K ， K ， 27.9, 2 .& 23.6; J及卿r， c柳力3卿/ 747, /"7.实施例6:共价键合有乳糖和利巴韦林的两亲性无规共聚物的合成将利巴韦林己二酸乙烯酯(398 mg)和乳糖癸二酸乙烯酯(570 mg) 加入到含有DMSO (l.OmL)和偶氮二异丁腈的聚合管中，在70摄氏度，氮气中反应24小时。反应完成后将粗产物反复洗涤，直到不含有单体为止。 然后将沉淀物真空干燥得到浅黄色固体，转化率34%。该产物的核磁共振、红外光谱、凝胶渗透色谱测试结果如下3-私(及，5-仏6-好，2-做，J-做，6-啦r画O好，J'画OT,冰'-做，/'歸好，2'-好，4'画私5'-好flm/ 6'-好o//a"w 2'-仏3'-好，做r/ 5'-及o/r/W/r/">，"CiV雄广"MSO-W <5 ""， 〃M, "2.5， JT6汰8， "6.2, 2似.0,97.2， ".5, 汰《75.2, 75.i， 7", Z J, 72.& 7丄5， 7汰9，7汰& 7汰2， 7汰0， 6&7， 642， 6义7， 35.& 24力顶fXS/*, c挑力3"; 29", 2柳,7736,撥6, /"6， W， /风/。76;GPC (2W" Af" = 27麵= 2.65.实施例7:共价键合有乳糖和阿糖胞苷的两亲性无规共聚物的合成按实施例5所述的方法，不同的是所采用的共聚单体为阿糖胞苷己二 酸乙烯酯和乳糖癸二酸乙烯酯。得到的产物为浅黄色固体，转化率为31%。该产物的核磁共振、红外光谱、凝胶渗透色谱测试结果如下^ iV雄P肌0-W <50-好qv似m6/"一， 7.2 -7.W —瑪o/5'-H勿似/Yi6i"e; 2-0好,6-0好，2'画Oif, 3'-Off, 4'-0好,7-孖，2-" 3画好,4-取5画及，6画好，r扁好，2'-fT, j'画好，4'-F， 5'-好6'-H 2养丄""C層/ (DMSO-r^ 3 m6, m;嵌2, "5.& "3.5,P7.3， ".6, 9K， 77.《75.4, 75.2, 75.7, 7", 7", 72.9， 7", 7汰9，7汰3, 645,6/./, 316， WJ, 3汰2, 2iU, ".2， 249, 24.4;/及卿r， c附力/Z 5， "75， 7075;GP M ="卿,M萬=2.51实施例8:乳糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束的制备首先将制备的共价键合有乳糖和利巴韦林的两亲性无规共聚物溶解在 二甲基亚砜中，然后在搅拌下向其中加入超纯水，直到水含量为15%。然 后将得到的混合溶液放入到的透析袋中，对超纯水透析2天，得到的即为 聚合物胶束溶液。通过透射电子显微镜观察的该胶束的聚集形态为规则的 球形(见附图2)。采用动态光散射考察的聚合物胶束在水溶液中的直径为 174±27纳米(见附图3)。实施例9:乳糖功能化的含有阿糖胞苷的聚合物胶束的制备按实施例5所述的方法，不同的是所采用的聚合物为共价键合有乳糖 和阿糖胞苷的两亲性无规共聚物。通过透射电子显微镜考察的聚合物胶束 的聚集形态为规则的球形(见附图4),通过动态光散射考察的聚合物胶束 在水溶液中的直径为135±25纳米。实施例10:糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束的细胞毒性考察几种不同的含有利巴韦林的聚合物胶束对人体肝肿瘤细胞(hepG2 细胞)的细胞毒性。具体步骤如下将hepG2细胞接种到含有10%胎牛血 清的RPMI1640培养液的96孔板中，在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培 养。之后，将培养液换成含有不同聚合物胶束(分别为半乳糖功能化的含 有利巴韦林的聚合物胶束，乳糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束，葡 萄糖功能化的含有利巴韦林的聚合物胶束以及不含糖的利巴韦林的聚合物 胶束)的RPMI1640培养液中继续培养。采用磷酸缓冲溶液作为空白对照。 通过MTT染色法测定不同聚合物胶束对hepG2细胞的细胞毒性(见附图 5)。
权利要求
1. 一种构筑肝靶向载药聚合物胶束的方法，包括(1)可聚合的药物单体和糖单体的合成在有机溶剂中，枯草杆菌碱性蛋白酶、南极假丝酵母脂肪酶或者脂肪酶Lipase AY30催化小分子药物与脂肪族二酸二乙烯酯反应合成可聚合的药物单体，枯草杆菌碱性蛋白酶催化糖与脂肪族二酸二乙烯酯反应合成可聚合的糖单体，并分离提纯其产物；(2)含有糖和小分子药物的两亲性无规共聚物的合成在氮气保护下，将步骤(1)所得的可聚合药物单体和可聚合糖单体用引发剂引发的聚合反应得到聚合物，通过选择沉淀剂与可溶解该聚合物的共溶剂，重复沉淀，并将沉淀物真空干燥得到两亲性无规共聚物；(3)肝靶向载药聚合物胶束的制备将步骤(2)中制备的两亲性无规共聚物溶解在共溶剂中，在搅拌、加热、或超声条件下向其中加入超纯水，之后将该溶液对水透析，将透析袋内的悬浮液离心、冷冻干燥得到粉末状载药聚合物胶束。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂为吡啶、丙酮或者甲苯。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的小分子药物为抗肝炎药物、抗肿瘤药物、p-阻断剂类药物中的一种。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的脂肪族二酸二乙烯酯为丙二酸二乙烯酯、丁二酸二乙烯酯、己二酸二乙烯酯、壬二酸二乙烯 酯、癸二酸二乙烯酯、苹果酸二乙烯酯或反丁烯二酸二乙烯酯。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖为单糖、寡糖、糖 的衍生物、相应的糖醇中的一种或两种以上糖分子的组合物。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的沉淀剂为正己烷、二 氧六环、四氢呋喃、甲醇、丙酮、甲苯、氯仿、二氯甲垸、乙酸乙酯中 的一种或多种的混合物。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述共溶剂为乙二醇、丙三 醇、乙二胺、氨基乙醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或多种的混 合物。
全文摘要
本发明公开了一种构筑肝靶向载药聚合物胶束的方法，首先通过将酶促选择性酯交换反应与自由基共聚反应相结合两步便利合成共价键合有小分子药物和糖的两亲性无规共聚物，然后再通过这些无规共聚物在水相中的自组装制备肝靶向聚合物胶束的方法。本方法合成路线不需要保护/去保护步骤，反应条件温和，操作简单易行，并可以很好地控制得到的聚合物胶束的载药量以及靶向功能，适合于构筑各种不同靶向性的载药聚合物胶束。
文档编号A61K31/7042GK101259286SQ20081006045
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者吕德水, 霞 李, 林贤福 申请人:浙江大学