专利名称：一种银杏内酯a、b复方注射剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种银杏内酯注射剂及其制备方法，所述银杏内酯注射剂是以银杏内酯A和银杏内酯B为主药。属于药物制剂领域。
背景技术：
银杏和银杏叶是治疗心脑血管疾病常用中药，其主要活性成分银杏内酯类化合物，已证为强血小板活化因子(plateletacllvatfactor，PAF)受体拮抗剂。近年来，其单一有效成分新药成为竞相开发的目标。例如，CN1513449公开一种银杏内酯B针剂及其制备方法，该方法是把银杏内酯B溶于注射用非水溶剂，如聚乙二醇，加或不加无水乙醇成混合溶剂，加或不加表面活性剂，经搅拌或超声震荡，及后处理即得产品；CN1843351公开了一种银杏内酯B粉针剂，是由主药和助溶剂及赋形剂制成的粉针剂。
关于银杏内酯的提取生产工艺，已有很多报道。同样地，关于银杏内酯A和银杏内酯B单体成分的生产工艺，以及银杏内酯A和B混合晶体的生产工艺，也有报道。例如，CN1287121公布了一种由银杏叶或银杏叶浸膏制备银杏内酯A、B的方法。CN1379029公开了一种银杏内酯AB提取工艺，它包括浸提、柱纯化、萃取、分离、结晶几步骤。CN1491950公开了一种银杏内酯A、B、C提取工艺。CN1651436公开了一种银杏叶中银杏内酯B和白果内酯的提取方法。CN101085780公开了一种银杏内酯的制备方法，可获得高纯度的银杏内酯A和银杏内酯B混合晶体。这些已经公布现有技术均引入本申请作为参考。
现有技术公开的银杏内酯类注射剂，主药为银杏内酯B注射剂，还有银杏总内酯注射剂，以及少量银杏内酯A、B和C的药物制剂。银杏总内酯以及银杏内酯A、B和C混合物制剂，存在成分较多、各成分含量不易控制等缺陷。银杏内酯B注射剂，在低温环境下稳定性不好，容易出现析晶现象，影响制剂的安全性和疗效。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种成分可控、在低温下更加稳定的以银杏内酯A和银杏内酯B为活性成分的银杏内酯注射剂。本发明技术方案如下 本发明提供一种银杏内酯注射剂，由主药和药学上可接受的注射用辅料组成，其特征在于所述的主药为银杏内酯A和银杏内酯B。
其中，银杏内酯A和银杏内酯B均具有治疗心脑血管疾病的作用，因此所述主药对银杏内酯A和银杏内酯B的配比没有特别限制。作为优选，其中所述的主药中，银杏内酯A和银杏内酯B重量比为1～10∶1～10，优选1～2∶1～2，更优选为1∶1。
本发明上述所述的银杏内酯注射剂，单位制剂中主药的含量，可以根据临床用药实际选用合适的含量。作为本发明实施方式之一，其中每制剂单位含主药5～500mg，并优选每单位制剂中含主药5～100mg。
本发明上述所述的银杏内酯注射剂，其中所述的注射用辅料，可以选用药学上可接受的注射制剂用辅料，例如选自注射用水、聚乙二醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、吐温-80和普洛沙姆中一种或两种以上。
作为优选，上述所述的聚乙二醇，选用聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或两种以上。
其中，所述的注射用辅料用量上没有特别限制。作为本领域技术人员，可以根据需要选用合适用量的辅料。当然，作为本领域常规知识，有机溶剂的比例要合适，偏高会带来溶血、刺激性等副反应，偏低不能溶解银杏内酯A和银杏内酯B。合适用量的辅料即能保证银杏内酯A和银杏内酯B完全溶解，又不至于产生辅料带来的副作用。
本发明上述所述的银杏内酯注射剂，其中所述的主药银杏内酯A和银杏内酯B，来源和获得方式没有特别限制，可以是分别纯的银杏内酯A和银杏内酯B混和而成，或者是由含银杏内酯A和B的中间体经纯化而成。其中术语“中间体”，可以是指含银杏内酯A和B的原料，例如银杏或者银杏叶，经本领域已知提取、分离和/或纯化方法得到银杏内酯A和B的纯物质，也可以是指含银杏内酯A和B的粗品，再经本领域已知的纯化方法得到的银杏内酯A和B的纯物质。
作为本发明具体实施方式
之一，上述所述的银杏内酯注射剂，由主药、注射用有机溶剂和注射用水组成，其中每单位制剂中含主药5～100mg，其中银杏内酯A和银杏内酯B的重量比为1～10∶1～10，所述注射用有机溶剂体积比为聚乙二醇∶乙醇∶丙二醇1～10∶1～10∶1～10，或者为体积比聚乙二醇∶乙醇∶丙三醇1～10∶1～10∶1～10。其中，所述的主药，可以是由分别制得的银杏内酯A和银杏内酯B混和而成，或者所述的主药是由含银杏内酯A和B的中间体经纯化而成。
进一步地，本发明上述所述的银杏内酯注射剂，其中所述的聚乙二醇选自聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或两种以上。
本发明还提供了一种制备上述所述的注射剂的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)取主药加入聚乙二醇中溶解； (2)向步骤(1)所得溶液中加入活性炭，30～80℃保温静置5～60min； (3)向步骤(2)所得溶液中加入其余注射用有机溶剂； (4)向步骤(3)溶液中加入适量注射用水，过滤。
本发明上述所述方法中，为提高注射剂的澄清度，可以在制备该注射剂的过程中加入活性碳，以吸收溶液中的色素。活性碳的用量以充分吸收溶液中的色素为准，作为优选，所述活性碳的用量为400mg-600mg。
本发明通过试验研究，意外地发现，银杏内酯A和银杏内酯B联合用药作为制剂主药，具有意想不到的技术效果，主要表现在互相助溶，增强银杏内酯B溶解性和制剂低温条件下稳定性。本发明银杏内酯A和B注射剂经试验证明了低温稳定性大大提高，从而改善制剂在寒冷地区的有效期和药品的安全、有效性，具有重要意义。此外，二者联合作为主药，在治疗脑梗塞症状方面更是具有协同作用，所得复方注射剂的治疗效果优于相同剂量下单一成分的注射剂。同时，本发明的注射剂，由于银杏内酯A和B之间的协同效果，制剂工艺更加简单和可控。
下面通过试验说明本发明所取得的有益效果。
一、本发明注射剂低温稳定性试验 试验1 银杏内酯A 60,000mg 银杏内酯B 20,000mg 聚乙二醇400加至1000ml 配制称取银杏内酯A、银杏内酯B置容器中，加入溶剂聚乙二醇400，溶解，混合均匀；经过滤、灌封、灭菌，即得。
对照试验1 银杏内酯B 20,000mg 聚乙二醇400加至1000ml 配制称取银杏内酯B置容器中，加入溶剂聚乙二醇400，溶解，混合均匀；经过滤、灌封、灭菌，即得。
试验2 银杏内酯A 30,000mg 银杏内酯B 30,000mg 聚乙二醇300∶乙醇＝0.9∶0.1混合溶剂加至1000ml 对照试验2银杏内酯B 银杏内酯B 10,000mg 聚乙二醇300∶乙醇＝0.9∶0.1混合溶剂 加至1000ml 试验3 银杏内酯A 15,000mg 银杏内酯B 30,000mg 吐温-8020,000mg 聚乙二醇400∶乙醇＝0.5∶0.5混合溶剂加至1000ml 配制称取银杏内酯A和银杏内酯B置容器中，将吐温-80加入事先按预定比例混合好的混合溶剂中，再将三者混好的混合溶剂加入银杏内酯B中，溶解，加混合溶剂至全量，混匀。经过滤、灌封、灭菌，即得。
对照试验3 银杏内酯B 15,000mg 吐温-8020,000mg 聚乙二醇400∶乙醇＝0.5∶0.5混合溶剂加至1000ml 配制称取银杏内酯B置容器中，将吐温-80加入事先按预定比例混合好的混合溶剂中，再将三者混好的混合溶剂加入银杏内酯B中，溶解，加混合溶剂至全量，混匀。经过滤、灌封、灭菌，即得。
试验4 银杏内酯A30g 银杏内酯B30g 乙醇 100g 丙二醇 900g 配制称取试验量的银杏内酯A和银杏内酯B置容器中，加乙醇100g溶解，加入吐温-80约5g，溶解，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液，调节溶液PH值4.6，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
对照试验4 银杏内酯B10g 乙醇 100g 丙二醇 900g 配制称取试验量的银杏内酯B置容器中，加乙醇100g溶解，加入吐温-80约5g，溶解，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液，调节溶液PH值4.6，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
试验5 银杏内酯A 3000mg 银杏内酯B 3000mg 聚乙二醇400 400ml 乙醇40ml 丙三醇 200ml 加注射用水至1000ml 配制称取试验量的银杏内酯A和银杏内酯B置容器中，加聚乙二醇400400ml，丙二醇200ml，溶解，加入乙醇40ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
对照试验5 银杏内酯B 2000mg 聚乙二醇400 400ml 乙醇40ml 丙二醇 200ml 加注射用水至1000ml 配制称取试验量的银杏内酯B置容器中，加聚乙二醇400 400ml，丙二醇200ml，溶解，加入乙醇40ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
按上述各试验方法配置银杏内酯AB复方注射液、银杏内酯B溶液，考察两者在-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、25℃这几个不同温度下，0天、15天、30天和90天的稳定性，结果如下表1-4所示。
表1不同温度下贮藏0天 表2 不同温度下贮藏15天 表3 不同温度下贮藏30天 表4 不同温度下贮藏90天 由上述试验结果可以发现，在相同溶剂条件下，银杏内酯AB注射剂中主药含量高于银杏内酯B注射剂中主药含量，特别是银杏内酯AB注射剂中银杏内酯B量高于银杏内酯B注射剂中银杏内酯B含量，尤其是银杏内酯A+B的低温稳定性显著大于银杏内酯B。因此，与现有的银杏内酯注射剂制剂相比，本发明效果非常显著和令人兴奋。
二、银杏内酯AB复方注射剂抗大鼠大脑中动脉阻断致局灶性缺血再灌注损伤作用 1.试验目的证实银杏内酯AB复方注射剂的抗大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤作用。
2.实验材料 (1)受试药品与给药 银杏内酯AB注射剂，按上述试验5方法自制(银杏内酯A∶银杏内酯B＝1∶1、银杏内酯A∶银杏内酯B＝1∶2)；同时按照试验5方法自制银杏内酯A注射剂和银杏内酯B注射剂。
给药体积1ml/kg(用生理盐水配制)。阻塞前20min给药，速度0.2ml/min。
(2)试剂与实验仪器 丙二醛(MDA)测定试剂盒，超氧化物(SOD)测定试剂盒，蛋白定量试剂盒(均为南京建成生物工程研究所提供)，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC，上海化学试剂公司，用1％磷酸盐PBS溶液配制成2％工作液)，752型紫外分光光度计(上海医用分析仪器厂)。
(3)试验动物 健康雄性SD大鼠，体重250-300g，10周龄，SPF级，南京军区总院实验动物所提供。在室温18-22℃、12h明/暗交替条件下饲养3d，自由取食，饮清洁水。所有对大鼠的实验程序已经动物伦理委员会批准。
3.实验方法与结果 分组选择健康雄性SD大鼠152只，体重(250-300)g，随机分成8组，每组19只，分别为假手术组，模型组，银杏内酯A阳性对照药组(48mg/kg)，银杏内酯B阳性对照药组(24mg/kg)，银杏内酯A、B复方注射剂(1∶1)大、中、小(48、24、12mg/kg)治疗组、银杏内酯A、B复方注射液(1∶2)24 mg/kg治疗组。各组于造模手术10min后，舌下给药。各组各选出8只大鼠进行行为学评分、TTC染色；各组另取8只大鼠用于脑含水量测定。
大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型的建立 4％水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉后将大鼠背位固定，颈正中切口，分离右侧颈总动脉并穿2根缝线备用，再分离颈内、颈外动脉，并结扎颈外动脉。在已分离的颈总动脉近心端用缝线结扎，远心端用动脉夹阻断血流，在此之间，剪一小口，将一端加热成圆珠状(直径＜0.3mm)的尼龙线插入小口，去掉动脉夹，将尼龙线缓缓推入至大脑前动脉起始端(约20mm)，通过阻断大脑中动脉的血供造成大脑中动脉缺血，缝合皮肤。假手术组只分离动脉但不插线。在整个麻醉期间，采用自动控温加热垫将大鼠肛温控制在(37±0.5)℃。
行为学症状评分术后24h进行行为学评分，方法如下将动物置于地板上，若不停地向一侧转圈，计为1分。提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，记为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋，分别计为1、2、3分。将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力，如双侧阻力对等且有力，计为0分；如向手术的对侧推动时阻力下降，根据下降程度不同分为轻度、中度、重度，分别计为1、2、3分。将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力，如双前肢肌张力对等且有力，计为0分；根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1、2、3分。满分为10分，分值越高，则动物行为障碍越严重。
脑梗死体积测定术后24h将大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切4刀分为5片，第1刀在脑前极与视交叉连线中点处，第2刀在视交叉部位，第3刀在漏斗柄处，第4刀在漏斗柄与叶尾极之间。脑片用TTC染色，染色液组成为4％TTC1.5mL、1mol/LKH2PO40.1mL、生理盐水3.4mL，37℃避光染色30min。正常组织呈红色，梗死组织为白色。4％甲醛固定2d后，用滤纸吸干液体再取出脑梗死组织，以梗死脑组织质量占大脑总质量的百分比作为脑梗死体积的指标，并算出保护率。
保护率＝(模型组梗死体积-给药组梗死体积)/模型组梗死体积×100％ 脑含水量测定术后24h将大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，称取大脑湿质量，107℃烘烤72h后称干质量。
脑含水量＝(湿质量-干质量)/湿质量×100％ 统计学分析数据以x±s表示，两组间比较采用t检验。
本发明银杏内酯AB注射剂的抗大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤作用结果如表5-7所示。
表5本发明注射剂对pMCAO大鼠行为症状的影响(术后24h)
注与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
表6本发明注射剂对pMCAO大鼠脑梗死体积的影响
注与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
表7本发明注射剂对pMCAO大鼠脑含水量的影响
统计学分析数据以x±s表示，两组间比较采用t检验。
由试验结果可以看出本发明银杏内酯AB注射剂同等给药剂量下与银杏内酯A注射剂相比，疗效更强，与银杏内酯B疗效相近，而低温稳定性大于单B注射液。
具体实施方法 以下实施例仅为进一步描述本方明，本发明权利要求保护范围不受其所限制。
实施例1 银杏内酯A 3000mg 银杏内酯B 3000mg 聚乙二醇2001000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B加入1000ml聚乙二醇200，溶解，加入500mg活性炭，80℃保温15min，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
实施例2 银杏内酯A2000mg 银杏内酯B1000mg 聚乙二醇600 800ml 乙醇 80ml 加注射用水至1000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B在40℃条件下加入800ml聚乙二醇600溶解，加入500mg活性炭，80℃保温15min，加入乙醇80ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
实施例3 银杏内酯A1000mg 银杏内酯B2000mg 聚乙二醇400 800ml 普洛沙姆 50mg 丙二醇 80ml 加注射用水至1000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B在40℃条件下加入800ml聚乙二醇400，加入普洛沙姆50mg溶解，加入500mg活性炭，80℃保温15min，加入丙二醇80ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
实施例4 银杏内酯A3000mg 银杏内酯B3000mg 聚乙二醇300 400ml 乙醇 400ml 丙三醇 100ml 加注射用水至1000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B在40℃条件下加入400ml聚乙二醇300溶解，加入500mg活性炭，80℃保温15min，加入乙醇400ml、丙三醇100ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
实施例5 银杏内酯A20000mg 银杏内酯B2000mg 聚乙二醇400 600ml 乙醇 200ml 丙三醇 100ml 加注射用水至1000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B在40℃条件下加入600ml聚乙二醇400加热溶解，加入500mg活性炭，80℃保温15min，加入乙醇200ml、丙三醇100ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
实施例6 银杏内酯A2000mg 银杏内酯B20000mg 聚乙二醇400 600ml 乙醇 200ml 丙三醇 100ml 加注射用水至1000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B在40℃条件下加入600ml聚乙二醇400溶解，加入500mg活性炭，80℃保温15min，加入乙醇200ml、丙三醇100ml，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌封、灭菌、灯检、包装，即得。
实施例7 银杏内酯A100,000mg 银杏内酯B100,000mg 聚乙二醇400 8000ml 丙二醇 800ml 加注射用水至10000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B在40℃条件下加入8000ml聚乙二醇400溶解，加入5g活性炭，80℃保温15min，加入丙二醇800ml，加注射用水至10000ml，经中间体检测、过滤、灌装、灭菌、灯检、包装，即得银杏内酯A、B复方大输液。
实施例8 银杏内酯A3,000mg 银杏内酯B3,000mg 吐温-80 20ml 加注射用水至 1000ml 配制取试验量银杏内酯A和银杏内酯B加入20ml吐温-80，加注射用水至800ml溶解，加入5g活性炭，80℃保温1 5min，加注射用水至1000ml，经中间体检测、过滤、灌装、灭菌、灯检、包装，即得。
已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种银杏内酯注射剂，由主药和药学上可接受的注射用辅料组成，其特征在于所述的主药为银杏内酯A和银杏内酯B。
2. 根据权利要求1所述的银杏内酯注射剂，其中每制剂单位含主药5～500mg，优选5～100mg。
3. 根据权利要求1-2所述的银杏内酯注射剂，其中所述的主药中，银杏内酯A和银杏内酯B重量比为1～10∶1～10，优选1～2∶1～2，更优选为1∶1。
4. 根据权利要求1-3所述的银杏内酯注射剂，其中所述的注射用辅料选自注射用水、聚乙二醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、吐温-80和普洛沙姆中一种或两种以上。
5. 根据权利要求4所述的银杏内酯注射剂，其中所述的聚乙二醇选自聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或两种以上。
6. 根据权利要求1-5所述的银杏内酯注射剂，其中所述的主药是由分别制得的银杏内酯A和银杏内酯B混和而成，或者所述的主药是由含银杏内酯A和B的中间体经纯化而成。
7. 根据权利要求1所述的银杏内酯注射剂，由主药、注射用有机溶剂和注射用水组成，其中每单位制剂中含主药5～100mg，其中银杏内酯A和银杏内酯B的重量比为1～10∶1～10，所述注射用有机溶剂为聚乙二醇∶乙醇∶丙二醇1～10∶1～10∶1～10，或者为聚乙二醇∶乙醇∶丙三醇1～10∶1～10∶1～10。
8. 根据权利要求7所述的银杏内酯注射剂，其中所述的主药是由分别制得的银杏内酯A和银杏内酯B混和而成，或者所述的主药是由含银杏内酯A和B的中间体经纯化而成。
9. 根据权利要求7-8所述的银杏内酯注射剂，其中所述的聚乙二醇选自聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或两种以上。
10. 一种制备如权利要求7-9所述的注射剂的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)取主药加入聚乙二醇中溶解；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入活性炭，30～80℃保温静置5～60min；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入其余注射用有机溶剂；
(4)向步骤(3)溶液中加入适量注射用水，过滤。
全文摘要
本发明涉及一种银杏内酯注射剂及其制备方法，所述银杏内酯注射剂由主药和注射用辅料组成，其中所述的主药是由银杏内酯A和银杏内酯B组成。本发明通过试验研究意外地发现，银杏内酯A和银杏内酯B联合用药作为制剂主药，不仅具有协同增效作用，更为显著的是二者互相助溶，增强银杏内酯B溶解性和制剂低温条件下稳定性。本发明银杏内酯注射剂经试验证明了低温稳定性大大提高，从而改善制剂在寒冷地区的有效期和药品的安全、有效性，具有重要意义。
文档编号A61K31/21GK101249085SQ20081008429
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者张雷红 申请人:广州艾格生物科技有限公司