专利名称：具有抑制血管新生和mmp活性的香蜂草提取物,以及包含它的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有优异的抑制血管新生和MMP活性的香蜂草乙酸乙酯提取物，以及包含它的组合物。更具体地，香蜂草的乙酸乙酯提取物的特征是用50-100% C1-C6醇提取香蜂草，浓缩，随后将浓缩的醇提物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，得到香蜂草的乙酸乙酯提取物。
背景技术：
香蜂草(Melissa officinalis)，唇形科多年生草本植物，民间也称作蜜蜂草、香脂草或水肿植物(dropsy plant)。香蜂草的主要成分是黄酮、萜酸、挥发油、醇苷和酚苷化合物以及咖啡酸衍生物。 进一步地，主要的黄酮成分有木犀草苷、秋英苷、泻鼠李黄素和异栎素，萜酸成分之一有熊果酸。含量最多的成分是咖啡酸衍生物迷迭香酸(大约4. 7% )，以及已知香蜂草提取物所含的挥发油成分有香叶醛、橙花醛、香茅醛和丁子香酚。迷迭香酸，香蜂草提取物中主要的无挥发性成分，具有较强的抗炎和退热作用；精油也已用于抑郁、神经性头疼、记忆力减退、神经痛、发烧，已知其具有镇静、抗菌、抗病毒、 抗氧化和抗激素的作用。近来，香蜂草提取物也被认为可用作血液循环促进剂，有助于外周血管的扩张。血管新生是产生新的毛细血管的过程。血管新生是受到严格限制的，通常发生在胚胎发育、组织重塑、伤口愈合和黄体发育的周期循环期间(Folkman和Cotran，Relation of vascular proliferation to tumor growth, Int Rev Exp Pathol 16207-248,1976)。与身体的其它细胞相比，内皮细胞的生长非常缓慢。然而，内皮细胞的增殖受到活化的水解酶血管新生细胞因子的诱发，水解酶将从细胞外基质释放细胞生成介体或刺激血管新生因子。通常，血管新生的过程是血管底膜降解、内皮细胞移动以及经内皮细胞增殖和分化形成腔的过程。血管新生过程的一个主要事件是在形成毛细血管前细胞外基质出现破裂。最重要的基质降解酶是基质金属蛋白酶(MMP)。当血管新生规律破坏或过激活MMP时，将出现与众多疾病相关联的病理性血管新生(Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6 (3), 230-247 (1995) ；Arup Das 等人，Progress in Retinal 禾口 Eye Research, 22 (2003) 721-748 ；Nick Di Girolamo 等人，I0VS,2001 年 8 月，Vol. 42，No. 9,1963-1968 ；Patricia Lee 等人，Survey of ophthalmology, Vol 43，No. 3，1998 年 11-12 月，245-269 ；D.B.Holland 等人，British Journal ofDermatology 2004,150,72-81 ；Anthony H Vagnucci Jr 等人，The Lancet, Vol 361,2003 年 2 月 15 日，605—608 ;Berislav V. Zlokovic, Trends inNeuroscience, Vol. 28，No. 4,2005 年 4 月，202-208 Jaap G. Neels 等人，The FASEB Journal express article 10.1096/fj. 03-1101fje. Publishedonline 2004 年 4 月 14 H ；D. L. Crandall等人，Microcirculation, 4，1997,211-232 ;G. Voros 等人，Endocrinology, 146，2005， 4545-4554 ；Μ. A. Rupnick 等人，PNAS, 99，2002,10730-10735 ；E. Brakenhielm 等人，Circ. Res.，94，2004，1579-1588 ;H. R. Lijnen 等人，Arterioscler ThrombVase Biol, 22. 2002, 374-379 ；D.Demeulemeester 等人’ Biochem. Biophys. Res. Commun. ,329,2005,105-110等。)。肿瘤生长和转移血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形以及诸如动脉粥样硬化、血管狭窄、地方性硬化症和狭窄症的心血管疾病；眼部疾病诸如糖尿病视网膜病、黄斑变性(包括与年龄相关的黄斑变性)、翼状胬肉、视网膜变性、角膜移植时的血管新生、血管新生性青光眼、血管新生性角膜病诸如角膜粘连和虹膜粘连、晶状体后纤维增生、颗粒性结膜炎、角膜溃疡、玻璃体增殖的视网膜病变、 早产婴儿的视网膜病变、眼睛内部的炎症、圆锥形角膜、干燥综合症、近视、眼部肿瘤和角膜移植的排斥反应；肥胖症；慢性炎症诸如关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎、MMP介导的整骨疗法和关节外伤导致的变性软骨损耗；炎症疾病诸如中枢神经系统炎症和炎症性肠病；皮肤疾病诸如银屑病、毛细管扩张、脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮；早老性痴呆；角膜粘连、蛋白尿症、腹主动脉瘤、脱髓鞘的神经组织、肝纤维症、肾小球疾病、早产胎膜破裂、牙周病诸如牙龈炎和牙周炎。更具体地，血管新生在肿瘤细胞的生长和转移中扮演了重要角色。新生血管不仅给快速生长的肿瘤细胞供应营养和氧气，还给转移的发展提供了循环通道[Folkmana和 Tyler, Cancer Invasion and metastasis，Biologicmechanisms禾口Therapy (S· B· Day ed.) Raven press,纽约，94-103 (1977) ；Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3) ,230-247(1995)] ο肿瘤患者由于转移而死亡，以及由于当前用于肿瘤治疗的化疗法和免疫疗法缺乏抗转移的效果，无法拯救肿瘤患者。关节炎，一种众所周知的炎症疾病，如自身免疫性疾病般发作。然而，关节腔中脉管内皮细胞的生长受到炎症细胞因子激活，最终将损坏关节中的软骨。换句话说，在诱发炎症的细胞因子的帮助下，滑膜腔中滑膜细胞和内皮细胞增殖将诱导血管新生和血管翳的形成，这在软骨的破坏中扮演了重要角色(Kocb AE, Polverini PJ和Lcibovich SJ, Arth Rheum 29,471-479,1986 ；Stupack DG, Storgard CM 禾口 Cheresh DA Braz JMed BiolRes 32,578-581,1999 Koch AE，关节炎 Rheum 41，951-962，1998)。同时，已有显示认为关节炎和关节外部创伤中的基质裂解素在胶原酶原的激活中起到重要作用，活化胶原酶[Murphy， G.等人，Biochem. J. 248，265-268 (1987)]。因此，MMP活性的下调可预防关节炎的发展。全世界许多人由于各种眼部疾病而失去了他们的视力。许多患者由于毛细血管血细胞浸润入玻璃体液而变成盲人(Jeffrey MI和Takayuki A，J Clin Invest 103， 1231-1236，1999)。典型的血管新生相关的眼部疾病有与年龄相关的黄斑变性，糖尿病视网膜病、早产婴儿的视网膜病、血管新生性青光眼、血管新生性角膜病(Adamis AP,Aiello LP 和D' Amato RA, Angiogenesis 3，9-14(1999))。糖尿病视网膜病，糖尿病的一种并发症， 被认为是毛细管破裂以及出血覆盖在视网膜表面而导致的。已经显示胶原酶、明胶酶和基质裂解素将损坏角膜的细胞外基质。这被认为是多数溃疡性眼部疾病尤其是那些感染或化学损伤所导致的眼部疾病的病态和视力损害的重要机制(Burns, F. R.等人，Invest Opthalmoland Visual Sci，32，1569-1575，1989)。溃荡形成期间眼睛中存在的MMP要么是内源性来自浸润的白细胞或成纤维细胞，要么是外源性来自于微生物。银屑病由角化细胞的异常活性增殖所导致。快速生长的细胞需要大量的血液供应，并且银屑病中将反常地诱发血管新生(Folkman J.，J InvestDermatol 59,40-48, 1972)。炎症刺激和微生物分泌的胶原酶将分解牙龈结缔组织中的胶原，并最终导致牙周炎。从发炎齿龈分离出的成纤维细胞中还鉴别出了胶原酶和基质裂解素活性以及酶的水平与观察到的牙龈炎的严重程度相关(Beeley，N. R. A等人，supra Overall, CM.等人，J Periodontal Res，22，81—88，1987)。MMP与CNS(中枢神经系统)的发病机理相关，破坏髓磷脂或血脑屏障。还报道了 MMP与早老性痴呆中的淀粉状β蛋白的积累相关[Yong，VW等人，Trends Neurosci 21(2), 75-80(1998)]。脑脊髓液中过度水平的明胶酶-B与多发性硬化和其他神经障碍的发病率相关 [Beeley, N. R. A.等人，supra ;Miyazaki，K.等人，Nature 362，839-841 (1993)]，将导致淀粉状 β 蛋白降解和累积[Backstrom JR 等人，Jneurosci 16 (24), 7910-9 (1996) ] 近来的报道已经显示早老性痴呆的大脑中MMP-I活性被极大地诱发，激发MMP酶原的ΜΜΡ-3也被囊括入该疾病的病理生理学中(LeakeA,Morris CM,&ffhateley, J Neurosci Lett 291,201-3,2000 ；YoshiyamaY, Asahina Μ, &Hattori Τ, Acta Neuropathol (berl), 99，91-5，2000)。MMP引起的底膜降解是肿瘤入侵、转移以及血管新生的非常重要的步骤。因此，MMP 的过表达可刺激血管新生、肿瘤入侵和转移。在腺癌中，浸润性近端胃癌细胞表达72-kD形式的IV型胶原酶[ktwartz， G. K.等人，Cancer 73,22-27(1994)]。由 Ha-ras 和 v-myc 致癌基因或仅由 Ha-ras 转化的大鼠胚胎细胞在无胸腺小鼠中具有转移性，并释放出92kDa明胶酶/胶原酶(MMP-9) [Bernhard, EJ.等人，Proc. Natl. Acad, ki 91,4293-4597 (1994) ] 因此，血管新生抑制剂或MMP抑制剂可用作这些疾病的治疗剂。关于这点，本发明人在KR登记号10-550,298中公开了香蜂草提取物在体外实验诸如HUVEC(人脐静脉内皮细胞)管腔成形和体内实验诸如小鼠膜基质模型和CAM检测中具有抗血管新生作用。此外，本发明人在KR登记号10-473,688中还公开了香蜂草提取物具有MMP (基质金属蛋白酶)抑制作用，这将在血管新生过程中降解底膜起到重要作用
发明内容
技术问题本发明人通过研究得到活性更显著的香蜂草提取物，具有优异的抑制血管新生和 MMP活性，由此完成本发明。技术方案本发明的目的是提供具有优异的抑制血管新生和MMP活性的香蜂草乙酸乙酯提取物，以及包含它的组合物。
图1是示出ALS-L1023抑制MMP活性的作用的曲线图。图2是示出ALS-L1023抑制HUVEC管腔成形的作用的图。图3是显示小鼠膜基质实验的结果的图，该结果可用于分析ALS-L1023抑制血管新生的作用。图4是肝脏组织的显微图，示出与溶剂对照组相比，给与高剂量ALS-L1023的高脂肪饮食喂食诱发肥胖的小鼠中肝脂质沉着和炎性细胞浸润出现减少。图5是示出与溶剂对照组相比，给与中和高剂量ALS-L1023的高脂肪饮食喂食诱发肥胖的小鼠中腹膜后脂肪组织的脂肪面积出现减少的图。图6是示出口服给与ALS-L1023对渗出性与年龄相关的黄斑变性级数的抑制作用的图。图7是示出依据毒性实验按2000mg/kg给与口服单剂量的ALS-L1023的小鼠体重的变化图。图8是示出依据毒性实验按2000mg/kg给与口服单剂量的ALS-L1023的小鼠体温的变化图；以及图9是示出依据毒性实验按2000mg/kg给与口服单剂量的ALS-L1023、以总体重百分比显示的相对器官重量值的图。
具体实施例方式因此，本发明提供了具有优异抑制血管新生和基质金属蛋白酶(MMP)活性的香蜂草乙酸乙酯提取物。本发明还提供了包含香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物，可用于治疗或预防血管新生相关的疾病和由MMP介导的疾病。以下将详细描述本发明。依据本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物的特征是用50-100% C1-CJi提取香蜂草， 浓缩，随后将浓缩的醇提物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，得到香蜂草乙酸乙酯提取物。在依据本发明的制备香蜂草乙酸乙酯提取物的方法中，可使用干燥的或不干燥的或两者混合的香蜂草。为了提高提取效率，香蜂草可切成小块或经粉碎。香蜂草的醇提物可根据常规方法提取，这里，使用的提取溶剂可以是香蜂草5-10 倍体积的50-100%醇，优选70-80%醇。醇可以是C1-C6醇，优选甲醇、乙醇或其混合物。在本发明的实施例中，香蜂草75 %乙醇提取物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，得到香蜂草乙酸乙酯提取物(称为ALS-L1023)。用50-100%醇作为提取溶剂可有效地提取出水溶性物质和水不溶性物质。这个方法也可有效地获得溶于乙酸乙酯但不溶于水的物质。考虑到产率、残渣的毒性和参照物的相对含量，选择乙酸乙酯为第二提取溶剂。为了大量生产具有优异抗血管新生活性的香蜂草提取物，将香蜂草50-100%醇提物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，得到香蜂草乙酸乙酯提取物(下列实施例中称作 ALS-L1023)。也可用50-100% C1-C6醇提取香蜂草，干燥，将醇提物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，将乙酸乙酯提取物再悬浮在水中，干燥，得到香蜂草的乙酸乙酯提取物。用得到的香蜂草乙酸乙酯部分进行动物实验和临床前实验。本发明人发现与其他溶剂部分得到的其他提取物相比，本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物具有优异的抑制血管新生和MMP的活性。MMP抑制实验、HUVEC管腔成形实验和小鼠膜基质移植实验显示香蜂草的乙酸乙酯提取物具有极其有效和优异的血管新生抑制作用。 本发明人还发现该提取物能通过减小脂肪组织、脂肪细胞尺寸以及诱发与脂肪酸氧化相关的基因表达来抑制肥胖症。因此，很清楚地，依据本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物可用作抗血管新生剂和MMP 抑制剂，用于治疗或预防与血管生产相关的疾病和由MMP介导的疾病。因此，本发明提供了包含香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物。本发明的组合物能治疗或预防的血管新生相关的疾病和由MMP介导的疾病包括但不限于肿瘤生长和转移、血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、以及心血管疾病诸如动脉粥样硬化、血管狭窄、edemic sclerosis和狭窄症；眼部疾病诸如糖尿病视网膜病、黄斑变性 (包括与年龄相关的黄斑变性)、翼状胬肉、视网膜变性、角膜移植中的血管新生、血管新生性青光眼、血管新生性角膜疾病诸如角膜粘连和虹膜粘连、晶状体后纤维增生、颗粒性结膜炎、角膜溃疡、玻璃体增殖的视网膜病变、早产婴儿的视网膜病变、眼睛内部的炎症、圆锥形角膜、干燥综合症、近视、眼部肿瘤和角膜移植的排斥反应；肥胖症；慢性炎症诸如关节炎、 风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎；炎症诸如中枢神经系统炎症和炎症性肠病；MMP 介导的整骨疗法和变性软骨损耗(regressive cartilage loss)；皮肤疾病诸如银屑病、 毛细管扩张、脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮；早老性痴呆；角膜粘连、蛋白尿症、腹主动脉瘤、脱髓鞘的神经组织、肝纤维症、肾小球疾病、早产胎膜破裂、牙周病诸如牙龈炎和牙周炎。本发明的组合物可与已知的抗血管生产剂或已知的MMP抑制剂联用。在本发明中，包含可用作治疗或预防与血管新生相关的疾病和由MMP介导的疾病的药剂的香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物可以是药物组合物或食物组合物。本发明的药物组合物还可包括制药学和生理学上可允许的添加剂，诸如稀释剂、 悬浮剂、表面活性剂、溶剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、发泡剂、润滑剂、助流剂或芳香剂。包含本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物作为活性成分的药物组合物可以与制药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂组合使用。本发明的药物组合物可制成任意形式，诸如颗粒、粉末、片、包衣片、胶囊、丸、糖浆、滴剂、液体剂、溶液、悬浮液、乳浊液或可注射的溶液。例如，在片剂或胶囊剂的组合物中，活性成分可与制药学上可接受的非活性和无毒性载体组合使用。需要的话可加入适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和染色剂。适宜的粘合剂的例子包括但不限于淀粉、明胶、糊精、麦芽糊精、天然糖诸如葡萄糖或β -乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯树胶、天然和合成树胶诸如黄芪胶、以及油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄胞胶等。在液体剂溶液类型的组合物中，制药学上可接受的载体有盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或混合溶液。通常的添加剂如抗氧剂、缓冲溶液、抑菌剂等可加入到组合物中。使用常规方法或Remington' s pharmaceutical Science -^Hidic； (Mack Publishing co, Easton PA)白勺力夕去，
明的组合物根据疾病或成分制成任意需要的形式。同时，包含本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物为活性成分的食物组合物可用作功能性食品、饮食补给物或食物添加剂。在食物添加剂的情况中，本发明的食物组合物可加入到肉、饮用水、巧克力、杂货、小吃、披萨、方便面、面条、口香糖、冰激凌、酒精饮料、维生素复合物或健康食品中。发明提供了包含香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物用于治疗或预防与血管新生相关的疾病和由MMP介导的疾病的用途。本发明的组合物可用于治疗或预防与血管新生相关的疾病和由MMP介导的疾病的食物和药物中。本发明还提供了治疗或预防与血管新生相关的疾病和由MMP介导的疾病的方法， 包括向哺乳动物给与治疗有效量的香蜂草乙酸乙酯提取物。这里的用于治疗目的的“哺乳动物”指的是任意被分类入哺乳动物的动物，优选地，哺乳动物为人。这里使用“治疗有效量”指的是将诱发经给药的动物或人产生生物的或医学反应的量。本领域普通医生可确定治疗有效量，以及适当的给药剂量和频率以获得最佳的临床效果。治疗有效量常根据不同因素而不同，诸如疾病的种类、患者体征的严重度、成分含量、 单个患者的年龄、体重、性别、饮食、给药时间、给药途径、组合物比例、治疗周期和其他联合给药的药物。本发明的组合物可单剂量给药，也可作为给药体系的一部分，诸如多剂量给药，香蜂草的乙酸乙酯提取物的优选剂量是^rig/kg 250mg/kg/天。本发明的组合物可以各种方式给药，例如但不限于口服、直肠给药、静脉给药、动脉给药、腹膜内给药、肌肉给药、粘膜内给药、皮下给药、皮内给药、经皮给药、由皮给药、阴道给药、直肠内给药、经鼻给药、经眼给药和/或肠内给药。
实施例下列实施例意在进一步说明本发明。然而，示出的实施例和实验例仅是为了更好地理解本发明，而不意在限定本发明的范围。[实施例]实施例1.香蜂草乙酸乙酯提取物的制备为了制备具有有效的抗血管新生活性的香蜂草提取物，用蒸馏水、50%乙醇水溶液、75%乙醇水溶液、100%乙醇和甲醇分别提取香蜂草。粗提物经离心分离、过滤、浓缩、冻干，得到提取物粉末。将粉末在4°C下储存直至使用。用HUVEC管腔成形实验在50 μ g/ ml的浓度下检测提取物的抗血管新生作用。如表1所示，包括水、50^^75^^100%乙醇和 100%甲醇提取物的所有提取物在HUVEC管腔成形实验中显示具有抑制作用。尤其，75%乙醇提取物与其他提取物相比具有较好的抑制活性，因此选择75%乙醇为第一提取溶剂。表 1[表 1][表]香蜂草提取物对HUVEC管腔成形的作用
权利要求
1.香蜂草乙酸乙酯提取物，具有抑制血管新生和MMP活性。
2.依据权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物，其中用50-100%C1-C6醇提取香蜂草，浓缩，随后将浓缩的醇提物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，得到香蜂草的乙酸乙酯提取物。
3.依据权利要求2的香蜂草乙酸乙酯提取物，其中C1-C6醇是70-80%的C1-C6醇。
4.依据权利要求3的香蜂草乙酸乙酯提取物，其中C1-C6醇是乙醇或甲醇。
5.一种预防或治疗肥胖症的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
6.一种预防或治疗糖尿病视网膜病、黄斑变性(包括与年龄相关的黄斑变性)、翼状胬肉、视网膜变性、角膜移植血管新生、新生血管性青光眼、新生血管性角膜疾病、晶体后纤维增生症、沙眼、角膜溃疡、增生性玻璃体视网膜病变、未成熟的视网膜病变、眼部炎症、圆锥形角膜、干燥综合症、近视、眼部肿瘤或角膜移植术后移植排斥反应的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
7.一种预防或治疗肿瘤生长和转移的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
8.一种预防或治疗血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、动脉硬化、脉管粘连、硬皮病或再狭窄的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
9.一种预防或治疗关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎、MMP介导的骨质减少或关节外部创伤导致的变性软骨损耗的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
10.一种预防或治疗中枢神经系统炎症或炎症性肠病的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
11.一种预防或治疗银屑病、毛细管扩张、脓性肉芽肿、脂溢性皮炎或痤疮的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
12.一种预防或治疗早老性痴呆的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
13.一种预防或治疗异常伤口愈合、蛋白尿症、腹主动脉瘤、脱髓鞘的神经组织、肝纤维症、肾小球疾病、早产胎膜破裂或牙周病的组合物，其包含权利要求1的香蜂草乙酸乙酯提取物。
14.依据权利要求5-13任一项的组合物，其中组合物可制成颗粒、粉末、片剂、包衣片、 胶囊、丸、糖浆、滴剂、液体剂、溶液、悬浮液、乳浊液或可注射的溶液的剂量形式。
全文摘要
本发明涉及具有优异的抑制血管新生和MMP活性的香蜂草乙酸乙酯提取物，以及包含它的组合物。更具体地，香蜂草的乙酸乙酯提取物的特征是用50-100％C1-C6醇提取香蜂草，浓缩，随后将浓缩的醇提物悬浮在水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，得到香蜂草的乙酸乙酯提取物。本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物具有强烈的和优异的抑制血管新生和MMP活性。因此，包含本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物可用作治疗或预防血管新生的相关疾病和由MMP介导的疾病的药物。
文档编号A61K36/53GK102316884SQ200880103608
公开日2012年1月11日 申请日期2008年8月25日 优先权日2007年8月23日
发明者咸钟千, 朴殷圭, 朴秉永, 李熙锡, 金敏英 申请人:血管实验室公司, 金敏英